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摘 要 人白细胞介素 13（interleukin 13，IL13）是近年来发现的一种细胞因子， 是造血因子家族的新成员，具有调节 B 淋巴细胞及单核细胞、抑制 HIV 复制、促 进原始造血前体细胞的增殖及分化等功能。本论文用超声波核化学渗透两种细胞 粉碎方法对 IL13 基因工程菌进行了细胞破碎实验，并系统地考察了 pH、温度、 时间、化学试剂等因素对细胞破碎效果的影响，得出了最佳的细胞破碎核包涵体 融解工艺条件。将破碎后的菌悬液用双水相萃取的方法进行了目标产物的初步分 离纯化，并对双水相体系的各影响因素进行了深入细致的研究。这将为我们进一 步地研究以包涵体形式存在于基因工程菌内地目标产物分离纯化新方法打下良好 的基础。 关键词关键词：IL13，包涵体，细胞破碎，双水相，分离 II Abstract Interleukin (IL-13) is a recently descried protein and a member of the family of hematopoietics. It is a protein in vitro modulator of B lymphocyte and monocyte functions. Recently, it was reported that it also could inhibit the HIV replication in monocyte and regulate proliferation and differentiation of primitive hematopoietics progenitor cells. In this study, we try disrupting JM109 cells by means of ultrasonic and chemical osmosis,primarily testing the functions of pH, temperature, time, chemical reagent and so on, and achieving an optimal process of cell disruption and inclusion solution. In addition, we carry on the partition of GST-IL-13 by aqueous two-phase system and carefully check the effects of the main processing parameters. Key words：IL-13, inclusion, cell disruption, aqueous two-phase, Partition 从基因工程菌中释放提取白介素 13 的研究 目 录 第一章 前言1 1.1 发展生化“下游”技术的意义 .1 1.2 基因工程蛋白质分离纯化的原则 .1 1.3 现有白细胞介素13 的分离纯化方法 7 1.4 蛋白质分离纯化的方法 .9 1.5 本论文的立项背景及研究内容 .12 第二章 实验材料与方法.13 2.1 概述 .13 2.2 实验材料与方法 .15 第三章 实验结果与讨论.17 3.1 GSTIL13 的诱导培养17 3.2 GSTIL13 总含量的测定20 3.3 化学破碎 .22 3.4 GS 双水相萃取的研究23 第四章 结论与展望24 4.1 结论 .24 4.2 对进一步研究的展望 .26 参考文献27 致 谢.28 附 录.29 从基因工程菌中释放提取白介素 13 的研究 - 1 - 第一章 前 言 1.1 发展生化“下游”技术的意义 现代生物技术的迅猛发展使当今世界发生了日新月异的变化。迄今为止，人 们已经能够设计、制造、生产多种具有重要价值的蛋白质，如胰岛素（insulin）、 白细胞介素（interleukin）、干扰素（interferon）、促红细胞生长素（EPO） 和肿瘤坏死因子（TNF）等。 1.2 基因工程蛋白质分离纯化的原则 生物产品有许多使生物高分子，必须考虑到产品的变性和活性恢复等问题。 如果选取的条件合适，也可以通过耦合不同技术来改进分离工艺。一般认为，要 实现基因工程蛋白质分离纯化的高效率、高纯度和低成本必须做到以下几点： 使用温和、高效的方法； 尽可能地减少操作步骤； 减少化学和生化试剂地使用。 Prokopakis 等提出了优化分离纯化步骤的基本规则，用以指导分离纯化操作 的改进。具体规则如下： 选择分离操作必须基于产品的物理化学性质和生化性质； 高产量的杂蛋白必须要除去； 最高效率地利用目标产物与杂质间地理化性质差异； 尽可能地将高效的步骤放在前面； 把操作最困难的步骤放在最后1, 2。 1.3 现有白细胞介素13 的分离纯化方法 1993 年，Mckenzie 首次提出白细胞介素13（IL13）的名字，此后，人们 逐渐发现了 IL13 的许多生物学活性：刺激前髓样细胞（TF1）的增殖，直接 诱导原始造血前体细胞（LinSca1）的增殖及分化；诱导 B 细胞表达 MHC 类抗原和 CD23，并存进其增殖及分泌 Ig；抑制 HIV 单核细胞中的复制，并具有抗 炎、抗肿瘤等多种作用。 2 第二章 实验材料与方法 2.1 概述 本论文主要从 IL13 地分离纯化入手，将传统的细胞破碎和双水相萃取（选 择 PEG 盐系统）用于 IL13 的提纯。 2.2.实验材料与方法 2.2.1 实验仪器设备 2.2.3 实验方法 1菌种培养 母液的配置 操作方法 按事先计算，取一定量的 PEG 母液、盐母液核细胞碎片固体（超声波破碎， 4000r/min 离心收集），用 NaOH 或盐酸调节 pH 值，加水至要求的浓度； 计算 GSTIL13 的萃取率： bbbttt ttt g vwcvwc vwc （21） 从基因工程菌中释放提取白介素 13 的研究 - 3 - 第三章 实验结果与讨论 3.1 GST-IL-13 的培养 3.2 GST-IL-13 总含量的测定 3.3 化学破碎 3.3.1 pH 的影响 pH 对蛋白质释放的影响见图 3.8。pH 的作用主要是影响蛋白质的电离平衡， 从而影响到其融解性。JM109 菌的细胞壁蛋白在微碱性师的融解性较高，同时这 又很接近细胞本身的生长环境，故蛋白质不会发生结构上的改变。从图中也可以 知道，pH 以 8.0 左右为宜。 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 678910 pH 蛋白质浓度/gmL-1 GSTIL-13总蛋白 图 3.8 pH 化学破碎的影响 3.4 双水相萃取的研究 本文分别考察了 PEG600，PEG1540，PEG4000，PEG6000 与不同的盐（硫酸 铵、硫酸镁、硫酸钠、磷酸钠）构成的双水相体系，系统分析了蛋白质、 GSTIL13 和细胞碎片的分布规律。 4 3.4.1 不同 PEG 分子量萃取结果的影响 表 3.4 平均相对分子质量对双水相萃取结果的比较 相组成ABCD 蛋白收率/%64.369.568.741.2 GSTIL13/%58.178.471.518.9 成相情况上清、下微浊上下清上清、下浊上下相浑浊 A.PEG600(26)，硫酸铵(14)；B.PEG1540(25%)，硫酸铵(12%)； C.PEG600(25)，硫酸铵(8)； D.PEG1540(20%)，硫酸铵(10%)； 从基因工程菌中释放提取白介素 13 的研究 - 5 - 第四章 结论与展望 4.1 结论 通过正交实验设计，对化学渗透法破碎 JM109 菌的各影响因素进行了实验 研究和显著性分析，确定了各影响因素显著性的大小，并对各显著因子进行了单 独实验，确定处适宜的破碎条件为盐酸胍 7.0mol/L,Triton X-100 0.5%，pH 为 8.0。 综合比较了超声波细胞 4.2 对进一步研究的展望 本实验对基因工程菌 JM109 中以包涵体形式存在的外源融合蛋白 GSTIL13 进行了细胞破碎（超声波法、化学渗透法）、包涵体融解、双水相 萃取等方面的实验研究，确定了最佳的细胞破碎、双水相萃取的工艺路线和工艺 条件，并取得较为满意的结果，为下一步的研究工作奠定了良好基础。进一步的 研究工作主要包括： 目标产物 GSTIL13 的进一步纯化。 目标产物 GSTIL13 的酶切和折叠复性实验，尽可能地提高酶切效率和 蛋白切割后的高级结构的重建。 切割后的 IL13 的活性检测，以及影响性的相关因素研究。 通过对 GSTIL13 分离纯化系统的研究，可为用基因工程菌大量生产基因 工程药物提供一个理论和方法上的借鉴。 6 参 考 文 献 1 陈五平主编. 无机化工工艺学. 北京：化学工业出版社，1992:38135 2 徐柱亮、贝建中. PAD 功能介绍. 北京：中国金融出版社，1988:4385 3 张文中. 论石油价格与石油工业发展. 世界石油经济，1990（2）:1421 4 黄良君. 大庆地区经济发展战略研究. 哈尔滨工业大学硕士学位论文. 1994:2330 5 李欣.世界石油市场发展趋势预测. 国务院发展研究中心信息网: /,2000,2 6 Allamaraju Subrahmanyam.Professional Java Server Programming J2EE Edition.Wrox Press，2001 从基因工程菌中释放提取白介素 13 的研究 - 7 - 致 谢 对给予各类资助、指导和协助完成研究工作，以及提供各种条件的单位及个 人表示感谢。致谢应实事求是，切忌浮夸与庸俗之词。 8 附录 1 透析袋的准备 1、将透析袋剪成合适长度； 2、在 250mL 烧杯中加入 2%NaHCO3 和 0.1mol/L 的 EDTA； 3、将透析袋装入其中，煮沸