脂代谢紊乱导致脂肪肝及高脂血症发生的机制

项目名称： 脂代谢紊乱导致脂肪肝及高脂血症发生脂代谢紊乱导致脂肪肝及高脂血症发生 的机制的机制 首席科学家： 管又飞管又飞 北京大学北京大学 起止年限： 2012.1-2016.82012.1-2016.8 依托部门： 教育部教育部 一、关键科学问题及研究内容 根据我国高脂血症和 NAFLD 的特点，我们围绕高脂血症和 NAFLD 的诱因、 重要发病环节以及生物标记物的发现这几个方面，凝炼出 6 个有特色、有创新 性的科学问题： NAFLD 和高脂血症发生、发展及转归和高脂血症发生、发展及转归的易感基因和表观遗传的易感基因和表观遗传特征？特征？ 我国居民膳食我国居民膳食营养和生活方式（运动）与营养和生活方式（运动）与 NAFLD 和高脂血症发生、发展和高脂血症发生、发展 的关系的关系？ 代谢性炎症在代谢性炎症在 NAFLD 和血脂紊乱发生、和血脂紊乱发生、发展中的作用？发展中的作用？ 肝脏营养感应调控及脂代谢稳态失衡与肝脏营养感应调控及脂代谢稳态失衡与 NAFLD 发生和发展发生和发展的关系？的关系？ 外周脂外周脂质质向肝脏异位以及肝细胞内脂肪向肝脏异位以及肝细胞内脂肪重分布在重分布在 NAFLD 发生、发展中的发生、发展中的 作用？作用？ NAFLD 和高脂血症和高脂血症不同疾病阶段及转归的生物标记物是什么？不同疾病阶段及转归的生物标记物是什么？ 主要研究内容包括：主要研究内容包括： 1.脂肪肝和高脂血症的遗传学研究：易感基因及表观遗传脂肪肝和高脂血症的遗传学研究：易感基因及表观遗传 利用我们项目组人群队列及病人活检样本资源、部分中国人群的SNPs数据 和国内外脂代谢通路相关基因的研究成果，重点研究：1）NAFLD和高脂血症和高脂血症 的易感基因以及表观遗传因素：的易感基因以及表观遗传因素：利用代谢基因数据库（WIT）和本项目组研究 获得的SNPs数据，通过外显子深度测序筛查进一步确定中国汉族人群NAFLD和 高脂血症的易感基因位点，并在长期大样本人群队列研究和肝组织活检标本的 基础上验证其与不同阶段NAFLD（SS和NASH）以及不同预后转归（肝硬化、 糖尿病、心脑血管疾病、恶性肿瘤）的相关性；在NAFLD动物模型的不同阶段 进行全基因组启动子甲基化位点扫描、microRNA表达谱分析；并利用上述平台 进行高脂血症和/或NAFLD患者肝组织活检样本检测，从而识别并明确与高脂 血症和NAFLD相关的表观遗传学因素；我们也将特别关注两个极端人群，即 “吃水也胖”和高脂饮食而不发生脂肪肝和高脂血症人群，并通过上述手段研究 其易感/保护基因（位点）（注：综审专家建议）；2）易感基因及表观遗传因易感基因及表观遗传因 素的作用机制研究素的作用机制研究：针对获得的NAFLD和高脂血症相关性易感基因/易感位点， 应用EMSA、super EMSA和Chip技术“挖掘”与之相结合的转录因子，验证易感 基因突变或多态性对基因转录/翻译、信号通路活性、细胞生理功能的影响；结 合筛选获得以及前期工作发现（SREBP1c、FoxO1、PGC1、SIRT1基因甲基化） 的表观遗传学因素，在原代肝脏细胞和动物模型水平验证其对基因表达、信号 通路活性、细胞糖脂代谢功能的影响,并利用SIRT1基因缺陷小鼠研究乙酰化表 观遗传修饰在NAFLD和高脂血症中的作用和机制；3）婴幼儿期环境因素对婴幼儿期环境因素对 NAFLD和高脂血症的远期影响和高脂血症的远期影响：在年龄、性别等因素匹配的条件下，对婴幼儿 的肥胖程度、喂养方式与饮食结构及其母亲怀孕和哺乳期饮食与运动状况进行 回顾性调查和长期随访观察，收集被研究儿童、青少年的血液标本和肝脏超声 检查结果，分析母亲和家庭因素以及婴幼儿时期饮食运动等环境因素与儿童、 青少年高脂血症和NAFLD的发生及发展的关系，并探讨其易感基因和表观遗传 改变；4）遗传、环境因素与遗传、环境因素与NAFLD和高脂血症发病相互作用并建立数学模型和高脂血症发病相互作用并建立数学模型： 分析队列人群营养、运动状况的背景资料，尤其是脂（饱和/单不饱和/多不饱和 脂肪酸、甘油三酯、胆固醇）摄入，以及其构成比例（饱和/不饱和脂肪酸，单 不饱和/多不饱和，3/6脂肪酸的比例），不同数量与类型的糖（葡萄糖、果 糖等）等含量；动态监测患者的血脂变化；调查职业、锻炼、睡眠、进食规律 等生活方式因素，结合上述遗传研究的资料，评价遗传变异与环境因素及其交 互作用对NAFLD和高脂血症发生、发展的影响；采用CART、MARS、MDR、 贝叶斯网络、随机森林等模型，构建遗传因素及环境因素诱导NAFLD和高脂血 症及其不同转归的预测模型。 2营养、生活方式营养、生活方式 (运动运动)与与脂肪肝和高脂血症发生、发展的关系脂肪肝和高脂血症发生、发展的关系 本课题将利用前期已建立的人群队列、高脂血症和 NAFLD 患者样本资源以 及动物模型，重点研究：1）我国人群的饮食营养结构与我国人群的饮食营养结构与 NAFLD 的关系，的关系，重点 关注饱和/单不饱和/多不饱和脂肪酸、甘油三酯、胆固醇含量，饱和/不饱和脂 肪酸、单不饱和/多不饱和、3/6 脂肪酸的比例，果糖的含量以及运动等；探 寻影响 NAFLD 和高脂血症发生、发展的我国国民营养膳食特点；2） “极端极端”人人 群群饮食营养结构与饮食营养结构与 NAFLD 的关系：的关系：对两种“极端”表现人群，即“吃水也胖”的 人群，及高脂饮食但不发生脂肪肝和高脂血症的人群中，分析影响 NAFLD 和 高脂血症发生、发展的膳食营养成分与易感基因的相关性，与课题 1 合作重点 探讨对高脂血症和脂肪肝具有致病性和保护性的基因位点和表观遗传修饰，为 高脂血症和 NAFLD 个体化营养干预提供依据（注：综审专家建议）；3）高高脂脂 肪酸和果糖诱导肪酸和果糖诱导 NAFLD 和高脂血症的分子机制和高脂血症的分子机制：在细胞和动物模型（-3/-6 PUFAs 代谢酶基因敲除小鼠如 COX-1-/-、COX-2-/-、mPGES-1-/-、cyp4a10-/- 、cyp4a14-/-、sEH-/-等）中探讨不同比例饱和脂肪酸/不饱和脂肪酸、-3/-6 PUFAs、果糖含量在高脂血症和 NAFLD 发生、发展及预防中的作用及分子基 础；4）营养膳食预测营养膳食预测 NAFLD 和高脂血症的模型和膳食质量评分体系和高脂血症的模型和膳食质量评分体系：通过分 析营养素 (尤其是脂质含量，脂肪酸类型和比例、果糖含量)等的摄入量（外暴 露量）和血尿样本中营养素或其代谢产物含量（内暴露量） ，结合检测血脂谱、 代谢性炎症与氧化应激指标以及临床相关指标，探讨营养膳食与高脂血症及 NAFLD 生物标志物和临床表型的关系，建立有效的营养膳食预测高脂血症和 NAFLD 的模型和膳食质量评分体系；5）NAFLD 和高脂血症个体化营养膳食和高脂血症个体化营养膳食 防治研究：防治研究：分析营养膳食与易感基因的相互作用对高脂血症和 NAFLD 的影响， 为高脂血症和 NAFLD 个体化营养干预提供依据；6）运动对运动对 NAFLD 的影响的影响： 分析我国人群运动量对高脂血症和 NAFLD 发生、发展的影响，并在动物模型 中探讨其作用机制。 3. 代谢性炎症在脂肪肝和高脂血症发生中的作用机制代谢性炎症在脂肪肝和高脂血症发生中的作用机制 我们拟利用细胞、模式动物和部分 NAFLD 患者的肝活检样本，重点探讨： 1）PRR 在代谢性炎症产生中的作用，在代谢性炎症产生中的作用，主要运用转基因和基因敲除小鼠研究清 道夫受体，清道夫受体 B，TLR3，TLR4，CIITA 在调控代谢性炎症反应的 发生中的作用；2）膳食因子在代谢性炎症中的作用膳食因子在代谢性炎症中的作用：探讨如不同浓度-3、-6 脂肪酸、胆固醇、果糖等因素对 PRR 介导的代谢性炎症的影响及其相关机制； 3）PRR 和脂质共同和脂质共同激活代谢性炎症的信号通路：激活代谢性炎症的信号通路：论证 PRR-清道夫受体- GRP78-JNK/NF-B 在代谢性炎症产生和放大中的作用；同时通过基因和蛋白 Array 技术，发现新的脂质和炎症通路共同的 sensor; 3）代谢性炎症的干预：代谢性炎症的干预： 根据上述信号通路的研究和我们前期的工作基础，我们将进一步论证小分子多 肽 （如 H11 肽、resveratrol 等）是否能阻断或降低代谢性炎症和 NAFLD 及高 脂血症的发生，为治疗代谢性炎症提供新方法和新靶点。本研究的平台和技术 与子课题 4 和子课题 5 密切相关，即代谢性炎症是影响肝脏脂代谢稳态和外周 脂肪向肝脏的异常转运的重要机制。 4. 肝脏营养感应调控及脂代谢稳态失衡与脂肪肝和高脂血症的发生和发展肝脏营养感应调控及脂代谢稳态失衡与脂肪肝和高脂血症的发生和发展 我们拟利用细胞模型、模式动物和部分 NAFLD 患者肝脏活检样本，展开以 下几个方面的研究：1）代谢性核受体网络与肝脏脂代谢：代谢性核受体网络与肝脏脂代谢： 探讨代谢性核受体 （如 PPARs、LXRs、FXR、SHR、PXR、CAR 和 TR 等）参与脂肪酸代谢（合 成、摄取、氧化、储存和分泌）调节的分子网络及其作用机制；利用已经具备 的 PPAR、PPAR、PPAR、LXR、LXR、FXR 和 PXR 等基因敲除小鼠研 究其在高脂血症和 NAFLD 发生中的作用。在野生型和核受体基因敲除小鼠上 诱导 SS 或 NASH 模型，测定肝组织脂肪酸含量和种类、甘油三酯和胆固醇水 平，在 mRNA 和蛋白水平检测与脂肪酸（甘油三酯）摄取 (FAT/CD36、caveolins、FATPS、FABPpm 等)、合成 （SREBP1c、FAS、DGAT 等） 、-氧化(ACO、CPT1、 HMGCS2、CYP4A 等)、 储存和分泌(Cide 家族蛋白、perilipin、seipin 等)等基因表达改变，核受体 (PPAR、PGC1、LXR、FXR 和 PXR 等)、重要脂代谢调节转录因子和信号分 子(SREBPs、ChREBP、FOXO、AMPK、Sirt、mTOR 等)、以及炎症通路分子 （JNK、TLRs 和 NFkB 等）的表达或/和磷酸化水平，和肝脏纤维化 （TGF/Smad 蛋白、胶原、fibronectin 等）的指标；2）脂肪组织脂肪组织-肝脏调节轴：肝脏调节轴： 研究脂肪组织源性信号分子（游离脂肪酸、脂肪因子、脂滴包被蛋白等）对肝 脏营养感应信号通路的影响及作用机理； 3）胰腺胰腺-肝脏调节轴：肝脏调节轴：验证核受体和 胰源性信号分子（PANDER 和 FAM3A）对肝细胞脂代谢以及炎症及纤维化的 影响。4）脂代谢调节新基因的发现：脂代谢调节新基因的发现：利用基因组学和蛋白组学技术在 NAFLD 动物模型上研究可能参与肝脏脂肪酸代谢稳态调控的新基因。 5. 脂质的异位沉积在脂肪肝和高脂血症发生、发展中的作用脂质的异位沉积在脂肪肝和高脂血症发生、发展中的作用 我们拟利用细胞模型、模式动物（Seipin-/-小鼠，Perilipin-/-小鼠，肝脏或脂 肪组织特异性的FAT/CD36-/-小鼠，肝脏特异的FAT/CD36转基因小鼠等）和部 分NAFLD患者的活检样本，重点进行以下方面的研究：1）脂肪组织、细胞中脂肪组织、细胞中 脂滴的分解机制及在脂滴的分解机制及在NAFLD中的作用：中的作用：在培养的脂肪细胞水平和模式动物研究 不同游离脂肪酸对脂滴包被蛋白（如Perilipin和Seipin等）表达以及磷酸化的影 响，和脂肪分解代谢（脂肪酶ATGL和HSL）的改变；2）脂肪细胞与肝细胞脂脂肪细胞与肝细胞脂 肪酸的转运机制肪酸的转运机制：利用脂肪细胞和肝细胞共培养模型和模式动物，观察脂肪酸 在代谢性炎症因子的作用下，在胞浆、细胞膜和亚细胞器 （ER）的分布和细 胞间转移机制；3）肝脏脂肪酸转运蛋白肝脏脂肪酸转运蛋白FAT/CD36在脂肪酸二次转运中的作用在脂肪酸二次转运中的作用 及分子机制：及分子机制：使用分子生物学和质谱技术检测肝脏脂肪酸转运蛋白FAT/CD36的 表达调控以及糖基化、棕榈酰化和磷酸化修饰的水平，并研究这些修饰与肝细 胞脂肪酸摄取及亚细胞定位的关系；在动物和人群，拟利用氢质子磁共振波谱， 研究高脂和炎症对脂肪酸异常分布的影响；4）脂肪酸在肝脏聚集与肝脏损害的脂肪酸在肝脏聚集与肝脏损害的 机制：机制：研究脂肪组织游离脂肪酸的代谢、肝脏对循环游离脂肪酸的摄取改变、 肝细胞损害（氧化应激，ER应激，细胞凋亡，和肝纤维化）及血脂种类和水平 的改变。本项目的开展将验证我们提出的NAFLD发生的“脂肪酸二次异常转运 假说”；也对课题四研究的器官间对话（肝脏-脂肪组织轴）共同控制机体整体 和局部组织脂代谢稳态的推测提供进一步的实验基础。 注:我们项目组已经通过高脂饮食和皮下注射 10% 酪蛋白，在模式动物上 成功建立了代谢性炎症模型，具体方法见 Ruan X,et al.Hepatology 2009。 6. 与与 NAFLD 和高脂血症疾病分期和转归相关的生物标志物发现和应用和高脂血症疾病分期和转归相关的生物标志物发现和应用 我们将利用在课题 1 和课题 2 中已经建立的大规模 NAFLD 以及高脂血症 的人群研究队列、和课题 4、课题 5 中建立的 NAFLD /高脂血症模式动物，重 点进行以下方面的研究：1）利用生物化学、蛋白组学、代谢组学等生物学的方生物化学、蛋白组学、代谢组学等生物学的方 法研究法研究 NAFLD 相关相关生物标志物生物标志物，包括血脂、肝脏脂肪含量、肝脏酶学、氧化 应激指标、炎症因子、脂肪细胞因子、血小板数量和活性、血浆 CK-18 等，以 及未知的小分子代谢产物标志物，分析上述生物标志物与不同阶段肝脏脂肪变 性发生和发展的相关性，筛选出更加准确、敏感和有预测价值的 NAFLD 生物 标志物；我们也将特别关注两个极端人群，即“吃水也胖”和高脂饮食而不发生 脂肪肝和高脂血症人群的生物标志物的变化（注：综审专家建议）； 2)建立建立无无 创性创性 NAFLD 评分诊断系统评分诊断系统： 结合人体肝脏组织活检标本、生物标志物（特别 是小分子代谢产物） 、营养膳食内外暴露以及超声等检查，利用生物信息学分析 提出 NAFLD 综合评分诊断体系，并在较大的规模人群进一步加以验证，最终 建立无创性评分诊断系统，用于 NAFLD 预测和防治。 二、预期目标 总体目标：总体目标： 本项目将根据我国脂代谢紊乱的主要表型为高甘油三酯血症和 NAFLD 这这 一重要特征一重要特征，围绕参与 NAFLD 发病的肝脏营养感应信号网络调控异常和外周 组织脂肪向肝脏异常转运这两大关键环节两大关键环节，从易感基因及其表观遗传修饰、易 感基因与环境因素（膳食营养和生活方式）的相互作用和代谢性炎症等三大诱三大诱 因因入手，探讨高脂血症 NAFLD 发生、发展与转归的危险因素及其作用机制， 并寻找可用于准确识别 NAFLD 不同病理阶段和转归的代谢性小分子生物标志 物，为制定适合我国国情的 NAFLD 和高脂血症预防、诊断、治疗的策略提供 科学依据。 五年预期目标：五年预期目标： 我们预计在 5 年中达到以下目标： 1.基本阐明我国特有的 NAFLD 和高脂血症的遗传背景，并确定一些对特定 高危人群具有预警意义的遗传学指标;发现与我国 NAFLD 和高脂血症发病 密切相关的营养和生活方式因素，并明确其表观遗传学基础，为应对我国青 少年 NAFLD 和高脂血症高发的严峻形势，提出有效的预防策略； 2.明确不同膳食因素和生活方式促发 NAFLD 和高脂血症的分子机制；建立 有效的基于营养膳食预测 NAFLD 和高脂血症的模型和膳食质量评分体系， 为在群体和个体层面制定 NAFLD 和高脂血症的营养膳食防治措施提供科学 依据和技术支持； 3.阐明模式识别受体 SR-A，SR-B、TLR3，TLR4 及 CIITA 调控代谢性炎症 的分子机制以及在 NAFLD 和高脂血症形成中的作用，明确是否可以通过调 控这些受体的表达和功能达到限制代谢性炎症反应，进而改善 NAFLD 和高 脂血症的目的； 4.研究代谢性核受体在肝脏糖脂代谢调控网络中的作用；发现一批新的参与 肝脏脂代谢调节的重要基因；明确肝外组织通过器官间对话途径调节肝脏糖 脂代谢的机制； 5.证明我们课题组原创性的“游离脂肪酸二次异常转运假说”，提供代谢性炎 症通过加强脂肪组织甘油三酯水解、引发高脂肪酸血症，继而增加肝脏对游 离脂肪酸的摄取导致单纯性 NAFLD 发生（第一次异常转移)；继而通过增 加肝细胞内游离脂肪酸向线粒体和内质网上转运（第二次异常转移） ，从而 导致 NAFLD 向脂肪性肝炎和肝硬化发展的实验依据； 6.获得并验证与 NAFLD 不同病理阶段高度相关的新的代谢分子生物标志物， 建立无创伤性评估和诊断 NAFLD 不同病理阶段的方法和评价量表。 本项目的实施也将为我国 NAFLD 和高脂血症的大规模早防、早诊、早治提 供了科学依据；将培养一支有国际竞争力的优秀中青年研究队伍（博士生 100 名、硕士生 80 名） ；预计将在 NAFLD 和高脂血症防治领域实现数个原创性突 破，产生一系列创新性研究成果，获得 3-5 个国际专利，发表 IF5 的学术论文 100 篇，IF10 的论文 10 篇，顶级科学论文 3-5 篇。 三、研究方案 （一）（一）总体学术思路总体学术思路 本课题紧紧围绕 NAFLD 和高脂血症的发生和发展的分子机制这个中心问 题，对病因/诱因（遗传因素、环境因素、代谢性炎症）和重大发病环节（肝脏 脂代谢稳态失衡和肝外脂质向肝脏的异常转运） ，从分子、细胞、模式动物、人 群队列和病人样本四个层面，系统地进行研究和论证。设计的 6 个子课题既相 互独立又彼此相关，这些子课题的开展将为阐明高脂血症和 NAFLD 发生和发 展的机制、识别高危人群和危险因素、发现有效的膳食营养干预方法、和制定 新的诊疗策略做出重要贡献（图 2） 。 易感基因及表观遗传易感基因及表观遗传 （课题（课题 1） 脂质代谢紊乱脂质代谢紊乱肝脏脂质聚集肝脏脂质聚集氧化应激氧化应激ER 应激应激炎症应激炎症应激 膳食营养和生活方式膳食营养和生活方式 （课题（课题 2） 代谢性炎症代谢性炎症 （课题（课题 3） 单纯性脂肪肝单纯性脂肪肝正常肝组织正常肝组织 肝细胞内脂质的异常分布肝细胞内脂质的异常分布 （第二次转运）（第二次转运）(课题课题 5) 外周脂质异位至肝脏外周脂质异位至肝脏 （第一次转运）（第一次转运） （课题（课题 5） 肝内脂代谢稳态紊乱肝内脂代谢稳态紊乱 （课题（课题 4） 非酒精性脂肪性肝炎非酒精性脂肪性肝炎 寻找寻找 NAFLD 和高脂血症发生、发展和转归的标记物及干预靶点（课题和高脂血症发生、发展和转归的标记物及干预靶点（课题 6） （二）（二）主要技术路线和各课题预期目标主要技术路线和各课题预期目标 在上述总体学术思想框架下，本项目的 6 个子课题将按以下的技术路线实 现各自预期目标。 课题课题 1： NAFLD 和高脂血症的易感基因及表观遗传研究和高脂血症的易感基因及表观遗传研究 图 2. 总体学术思路示意图 本课题将综合我们课题组已有的人群队列样本、部分中国人群 SNPs 数据和 国内外脂代谢通路相关基因的研究成果，重点阐明：1）NAFLD 和高脂血症的 易感基因，明确重要易感基因突变/多态性对基因转录/翻译、信号通路活性、细 胞生理功能的影响，以及与高脂血症和 NAFLD 的相关性；2）NAFLD 和高脂 血症的表观遗传特点，特别是前期工作发现的 SREBP1c、FoxO1、PGC1基因 甲基化和 SIRT 去乙酰化酶家族在高脂血症和 NAFLD 中的作用；3）婴幼儿期 环境因素与表观遗传改变以及与 NAFLD 和高脂血症的关系；4）遗传-环境因 素-表观遗传与 NAFLD 和高脂血症发病相互作用及其数学模型。 课题课题 2：环境因素：环境因素与与 NAFLD 和高脂血症和高脂血症发生、发展的关系发生、发展的关系 本课题将利用前期已建立的人群队列、高脂血症和 NAFLD 患者样本资源以 及基因敲除动物模型，重点明确：1）我国人群的饮食营养结构与 NAFLD 的关 系，并建立有效的营养膳食评分体系和预测 NAFLD 和高脂血症的模型；2）高 脂肪酸（饱和脂肪酸、-3/6 PUFAs）和果糖诱导 NAFLD 和高脂血症的分子机 制；3）运动和营养干预对 NAFLD 和高脂血症的影响及其机制。以期为高脂血 症和 NAFLD 的生活干预提供科学依据。 课题课题 3：代谢性炎症在：代谢性炎症在 NAFLD 和高脂血症发病中的作用和高脂血症发病中的作用 我们拟利用细胞、转基因、基因敲除和模式动物以及部分 NAFLD 患者的 肝活检样本，重点阐明：1）模式识别受体（PRR）和脂质膳食营养素在代谢性 炎症中的作用；2）PRR 和脂质共同激活代谢性炎症的信号通路；3）代谢性炎 症的干预对高脂血症和脂肪肝发病的影响。以期为治疗代谢性炎症提供新方法 和新靶点。 本研究的平台和技术与子课题 4 和子课题 5 密切相关，即代谢性炎 症是影响肝脏脂代谢稳态和外周脂肪向肝脏的异常转运的重要机制。 课题课题 4：肝脏脂代谢稳态失衡与：肝脏脂代谢稳态失衡与 NAFLD 和高脂血症的发生和发展和高脂血症的发生和发展 我们拟利用细胞模型、转基因、基因敲除模式动物和 NAFLD 患者肝脏活检 样本，重点揭示：1）代谢性核受体（PPARs、LXRs、FXRs 和 PXR 等）网络 在肝脏脂代谢稳态调节中的作用；2）脂肪组织-肝脏调节轴对肝脏营养感应信 号通路和脂代谢稳态的影响及作用机理； 3）胰腺-肝脏调节轴在肝脏脂肪酸代 谢调节中的作用和机制；4）发现可能参与肝脏脂肪酸代谢稳态调控的新基因。 课题课题 5：脂质异常分布在：脂质异常分布在 NAFLD 和高脂血症发病中的作用和高脂血症发病中的作用 我们拟利用细胞模型、模式动物 （Seipin-/-小鼠，Perilipin-/-小鼠，肝脏或脂 肪组织特异性的FAT/CD36-/-小鼠，肝脏特异的FAT/CD36转基因小鼠等）和部 分NAFLD患者的活检样本，重点阐明：1）脂肪组织、肝组织中脂滴的分解的 机制及在NAFLD中的作用；2）脂肪细胞与肝细胞间脂肪酸的转运规律和调节 因素；3）肝脏脂肪酸转运蛋白FAT/CD36在脂肪酸二次转运中的作用及分子机 制；4）脂肪酸在肝脏聚集与脂肪肝发生、发展的关系。本项目的开展将验证我 们提出的NAFLD发生的“脂肪酸二次异常转运假说”；也对课题四研究的器官间 对话（肝脏-脂肪组织轴）共同控制机体整体和局部组织脂代谢稳态的推测提供 进一步的实验基础。 课题课题 6：与：与 NAFLD 和高脂血症的疾病分期和转归相关的生物标志物发现和应和高脂血症的疾病分期和转归相关的生物标志物发现和应 用用 我们将利用在课题 1 和课题 2 中已经建立的大规模 NAFLD 以及高脂血症 （血脂异常）的人群研究队列、和课题 4、课题 5 中建立的 NAFLD /高脂血症 模式动物，利用蛋白组学和代谢组学的方法重点明确：1）不同 NAFLD 疾病阶 段的相关生物标志物；2)结合人体肝脏组织活检标本、生物标志物、营养膳食 内外暴露以及超声等检查，利用生物信息学分析提出诊断 NAFLD 不同疾病阶 段并判断其转归的综合评分体系，发现有效防治疾病进展的干预靶点，从而建 立无创性诊断体系和营养和药物干预靶点用于脂代谢紊乱性疾病的诊断和防治。 （三）（三）创新点与特色创新点与特色 1. 关注具有我国人群特点的遗传和环境因素在关注具有我国人群特点的遗传和环境因素在 NAFLD 和高脂血症中的作用及和高脂血症中的作用及 其机制其机制 首先阐明我国汉族人群高脂血症和/或NAFLD及其不同转归阶段的易感基因 和表观遗传特征；明确遗传因素及环境因素如何相互作用，共同促进NAFLD和 高脂血症发生发展的作用机制；揭示生命早期营养及环境因素对儿童、青少年 NAFLD和高脂血症的远期影响。 2. 以创新性科学假说解决临床重大问题以创新性科学假说解决临床重大问题 我们提出如下创新性科学假说： 1）提出“代谢编程”通过表观遗传学机制 参与生命早期营养过度（种类、量）增加成年后脂代谢紊乱疾病的假说。这个 假说可以帮助我们理解为什么我国儿童、青少年高脂血症和 NAFLD 发病情况 越来越严重的原因，也为代谢编程的可遗传性和可逆性提出科学依据，这项研 究将对促进我国 NAFLD 和高脂血症防治从娃娃抓起的策略有积极的推动作用； 2）系统探讨“代谢性炎症”发生的机制和在 NAFLD 和高脂血症中的作用； 3） 提出脂肪-肝脏和胰岛-肝脏“器官间对话” 的概念，从系统生物学角度研究 NAFLD 和高脂血症的关系；4）提出循环中脂肪酸在生理情况下由肝脏向脂肪 组织转运的“生理流向”，和在代谢性炎症和胰岛素抵抗等病生理因素作用下由 脂肪组织向肝脏转运的“病理流向”的假说；5）我们首次从炎症应激引起“脂肪 酸二次重新分布”的角度阐释 NAFLD 的发病机制，提出脂质在肝细胞（器）内 的定位比血脂水平更重要，更具有生物学和临床意义，可望成为诊断 NASH 的 敏感而准确的指标。 3. 基础研究与临床研究紧密结合的基础研究与临床研究紧密结合的“转化型转化型”研究模式研究模式 本项目课题组人员组成充分反映了基础与临床结合的理念，强调跨学科和 转化医学研究。虽然实验内容涉及从分子、细胞、到动物模型、再到人群的研 究，但是所有课题内容都围绕一个根本的科学问题，即肝脏脂代谢稳态紊乱以 及外周组织脂肪向肝脏异常转运的分子机制。通过基础与临床紧密结合的研究， 我们也将可能把本项目实施所取得的原创性科学成果，迅速向临床应用转化。 4. 以高脂血症和以高脂血症和 NAFLD 不同疾病阶段和转归的早期识别和干预作为主要研究不同疾病阶段和转归的早期识别和干预作为主要研究 目标目标 从疾病预防的角度，我们需要早期识别并有效阻断单纯性脂肪肝向 NASH 发展的手段，需要准确判断血脂紊乱和 NAFLD 患者的严重程度并预测其向不 同疾病（肝硬化/肝癌、心脑血管疾病和糖尿病）转归的可能，只有这样才能在 高危人群采取高度针对性的干预措施。本项目针对 NAFLD 发生、发展与转归 的机制研究（如“代谢性炎症”、 “脂肪酸二次异常转运”学说）和代谢性小分子高 通量研究，有可能发现无创性诊断指标和新的干预和治疗靶点，从而为脂代谢 紊乱性疾病的预测、早期预防和干预提供新的策略和措施。 （四）（四）取得重大突破的可行性分析取得重大突破的可行性分析 参加本项目的研究人员大多数是来自我国高脂血症和 NAFLD 临床及基础 研究重要研究单位的学术带头人，几乎所有主要骨干都有过主持大型国家项目， 特别是 973、863 项目的经验。在遗传、流行病、临床、及基础研究方面有大量 的实验材料、研究技术和成果积累，本次申请我们将力求在以下几个方面寻求 重大突破： 1.阐明我国与高脂血症和脂肪肝发病密切相关的遗传和表观遗传特征阐明我国与高脂血症和脂肪肝发病密切相关的遗传和表观遗传特征 课题组专家范建高教授已主持开展 10 余项大样本的 NAFLD 横断面调查， 发现发达地区成人 NAFLD 患病率高达 15%。另外在上海宝山钢铁公司建立了 为期 15 年的随访队列（N15,000） ，并在此基础上建成了反映 NAFLD 自然 史的流行病学数据库（Fan JG, et al. Prev Med 2010; J Hepatol 2005,2009; JGH 2005,2007,2008; Gastroenterol 2003; WJG 2003， Fan JG, et al. J Hepatol 2005; HBPT Int 2007） 。此外，通过中国脂肪肝诊疗协作网建立了包括 2000 余例肝炎 患者的肝组织活检标本库(Fan JG, et al. JGH 2008)。上述数据及样本资源能够为 发现并验证遗传、环境因素（膳食营养和生活方式）对高脂血症、脂肪肝自然 史的影响提供重要支持。上海市儿科医学研究所蔡威教授和北京大学公共卫生 学院儿童青少年卫生研究所所长马军教授的研究，发现我国儿童青少年近年来 NAFLD 患病率增长迅速且呈不断低龄化趋势，在环境因素与儿童肥胖和脂肪肝 的发病及其防治方面进行了一系列开拓性的研究工作，在我国首次建立了包括 2000 名肥胖、高脂血症和脂肪肝学童在内的人群队列，为前瞻性研究膳食和运 动干预对上述代谢疾病发生、发展和转归的影响建立了可靠的基础。本课题组 专家唐熠达副教授所在的中国医学科学院阜外心血管病医院是“九五”至“十一五” 期间国家“863”计划心血管遗传资源收集的牵头单位，具备 30 多年心血管疾 病流行病学和遗传学研究的经验，有完整优秀的人才梯队和雄厚的技术力量。 已建立了高质量的约 30000 例社区人群的血脂表型、脂肪肝和基因组 DNA 库， 为今后在大规模独立样本中进行重复验证以及功能分析奠定了基础；也已经应 用 Affymetrix 公司最新 Axiom 中国人芯片进行了 5000 例社区人群样本的全基 因组关联分析，发现一系列新的中国人群特异关联位点和区域。北京大学医学 部生物信息学系主任崔庆华副教授是生物计算学专家，在 microRNA 调控肝脏 脂代谢方面有良好的积累；重庆医科大学生命科学院的肖晓秋教授在基因表观 遗传研究如 DNA 甲基化、组蛋白修饰及非编码 RNA 调控方面有长期的研究积 累，并具备了很强的相关研究工作基础，前期研究中已发现生命早期营养信号 与肥胖、脂肪肝有重要关系，有望在以生命早期营养与脂肪肝表观遗传研究方 面取得重大突破。 2.明确膳食营养、生活方式明确膳食营养、生活方式 (运动运动)与与 NAFLD 发生、发展的关系发生、发展的关系 本课题专家黎健、唐蔚青和闫道广教授等的研究表明，高脂血症 （高甘油 三酯血症和高脂肪酸血症）是我国脂代谢紊乱的主要表型，且与 NAFLD 发生 密切相关。血脂紊乱独立于 BMI 和内脏性肥胖与 NAFLD 关系密切，现况调查 和临床病例分析显示，高脂血症患者 NAFLD 患病率为 27%-92%，高甘油三酯 血症与 NAFLD 的关联强于高胆固醇血症；我们课题组的队列研究显示高甘油 三酯血症是 NAFLD 发病的独立危险因素(范建高,等.中华肝脏病杂志, 2010;18:676-680)；反之，NAFLD 患者随访中高脂血症发病率显著增加（Fan JG, et al. J Gastroenterol Hepatol 2007; 22:1086-91） 。通过运用自身拥有的 29 365 例北京人群样本和“课题一”建立的前期前瞻性研究队列展开工作，有望可以初 步阐明遗传与环境因素相互作用对高脂血症和 NAFLD 发生、发展的影响。此 外，本课题组也将对在上述人群队列研究中发现的及有研究证据支持的重要膳 食营养和生活方式（运动）因素在 NAFLD 动物模型中进行验证。 3.明确代谢性炎症在明确代谢性炎症在 NAFLD 发生中的机制发生中的机制 本课题组的南京医科大学陈琪教授、徐涌教授和李跃华教授，重庆医科大 学的陈压西教授和 301 医院的叶平教授所组成的研究团队过去数年中对三种炎 症模式受体 SRA、TLR4 及 CIITA 和其他炎症相关因子对巨噬细胞及其他组织 细胞功能的影响进行了深入研究，提供了其参与脂代谢及炎症发生相关的大量 证据。该课题组在过去五年中就模式识别受体介导的代谢性炎症进行了深入的 前期研究，在 J Biol Chem、Circ Res、Arterioscler Thromb Vasc Biol、Cardiovasc Res、Mol Cell Biol 等国际权威期刊共发表具有独立知识产权 的相关论著 20 余篇，并取得项国家专利，充分具备完成本课题研究内容的积 累与基础。部分模型小鼠（如 GRP78Tg/Tg 小鼠）是具有独立知识产权的原创 性成果。 4.阐明营养信号网络、脂代谢稳态调节失衡与阐明营养信号网络、脂代谢稳态调节失衡与 NAFLD 发生的关系发生的关系 本课题组管又飞教授研究组长期从事长链脂肪酸-花生四烯酸和核受体 PPAR 及 LXR 的生物功能研究，发表了大量文章(Nat Med 2005；Diabetes2007; J Clin Invest 1999,2007 等);其课题组最近的研究发现胰源性因子 PANDER 在肝 脏糖脂代谢调节中有重要作用，可能是 NAFLD 治疗的一个新靶点(Hepatology 2011)。此外，管又飞教授课题组保有所有与本课题计划内容相关的核受体基因 敲除小鼠品系。北京大学糖尿病中心的朱毅教授长期从事肝脏脂代谢和血脂紊 乱，特别是核受体 PPAR 及 LXR 方面的研究。他们研究发现 LXR 和 PPAR 在调节肝脏脂代谢和 NAFLD 的发生中有重要的作用（J Biol Chem. 2009; Hepatology. 2008） 。中南大学湘雅医学院赵水平教授课题组从 1989 年开始致力 于血脂代谢和脂肪细胞脂质代谢及内分泌功能的研究，积累了丰富的经验，多 篇有价值的学术论文发表在 Atherosclerosis、Am Heart J、Int J Cardiol.等期刊上， 引起国外同行关注。医学科学院方福德/常永生副教授课题组致力于 miRNA 和 Sirt 在调节糖脂代谢中的作用，发表了一系列的文章(Mol Endocrinol, 2007; Biochem J. 2010; PLoS ONE 2010 等)。上述条件和前期积累为本课题的实施， 并取得突破性进展提供了强有力的支持。 5.探讨脂质重分布在探讨脂质重分布在 NAFLD 及高脂血症发生中的作用及高脂血症发生中的作用 本课题负责人阮雄中教授针对胆固醇在组织间异常转运这个问题，在细 胞和模式动物水平开展了很多原创性的前期工作，探讨了在炎症应激状态下胆 固醇在体内转运的机制，首先提出慢性炎症疾病通过脂质敏感器 SCAP，改变 脂代谢稳态平衡，引起体内脂质从血循环向组织转移（redistributions）导致器 官损害，并提出在炎症状态下血脂定位检测比定量更重要的理论，这些发现将 挑战传统的血脂诊断和治疗学中的一些概念，已被美国肾脏病基金会纳入了全 球 Cardio Kidney Diabetes 降脂治疗指南。前期工作已经分别发表在 Hepatology，Kidney International；Arterioscler Thromb Vasc Biol.；J Am Soc Nephrol 等国际著名期刊上。这些有自主创新性的系统理论已经应邀发表在 Nature Rev Nephol。本项目组张建法教授是脂肪组织代谢调控领域的著名专家， 尤其是在生物节律信号传导与脂肪代谢基因调控方面做出了杰出成就 ，其一系列 的代表性成果分别作为第一作者发表在Nature 杂志、随后作为通讯作者分别发表 在 Endocrinology，American Journal of Pathology, Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Journal of Biological Chemistry 等国际著名学术杂志上。 刘国庆教授长期从事高甘油三酯血症的基础研究，负责建成了北京大学教育部分 子心血管重点实验室的转基因动物中心，该中心拥有多种有自主知识产权的转基 因小鼠，转基因猪，8 年来共发表了20 余篇SCI 论文，包括ATVB、Circ Res 和 Gut 等。徐国恒教授多年来主要从事脂肪组织脂滴包被蛋白perilipin 与脂肪代谢 调控方面的研究，以第一作者或通讯作者在J Cell Biol、J Biol Chem、Biochimica Biophysica Acta -Lipid、Mol Pharmacol、Mol Endocrinol 国际期刊发表了17 篇 SCI 研究论文。在大量前期工作基础上，该课题组重点研究了脂肪组织与肝脏组织 之间“脂肪酸转运轴”（包括脂滴包被蛋白，脂肪酸转运蛋白）的机制，有望产 生原创性的科学成果。 6.NAFLD 不同阶段和转归的生物标志物的发现不同阶段和转归的生物标志物的发现 该项目组负责人凌文华教授多年来从事脂质与 NAFLD 的流行病学和膳食营 养研究，在广东省建立了大规模的高脂血症和 NAFLD 研究队列，并发现了一 批对中国人血脂代谢、炎症反应和 NAFLD 有重要作用的易感基因。翁建平教 授多年来从事糖脂代谢临床和基础研究，近年来发表 SCI 论文 29 篇，其中第一 作者和/或通讯作者 22 篇，第一作者论文单篇最高影响因子 30.8 分（Lancet, 2008） 。赵春霞副研究员作为参加单位负责承担了科技部十一五重大专项课题 “肝炎进展为肝癌的早期诊断标志物筛选、验证，分子分型与诊断试剂研发”、 科技部国家重点基础研究发展“973”计划项目“代谢性疾病的蛋白质功能与代谢 组学研究”等项目。主要研究方向为生物样品的高分辨、高灵敏度分离分析的新 材料和新方法研究，已逐步将研究成果应用到疾病相关基因、代谢组学及脂质 组学等研究领域，在国内外期刊和会议上发表论文近 40 篇。此外，中科院大连 化学物理研究所具有国际领先的代谢组学研究平台，为本课题组寻找和验证可 适用于临床不同病理阶段 NAFLD 诊断的代谢小分子生物标志物奠定了坚实的 基础。该团队有很好的临床资源，很好的高脂血症和 NAFLD 的队列人群，同 时有很好的技术平台，通过课题组内部的合作以及与其他课题组的协作，有希 望在不同疾病阶段的 NAFLD 病人的样本及已建立的高脂血症和 NAFLD 动物 模型样本中，运用蛋白质组学和代谢组学技术高通量的检测 NAFLD 患者/动物 血清蛋白质和代谢小分子指纹图谱，从而找出差异蛋白和小分子代谢产物，再 通过生物信息学手段建立 NAFLD 和 NASH 的无创诊断模型，并回到人群队列 进行可靠性验证，以期筛选出新的候选生物标志物。 （五）课题设置课题设置 1.课题设计思路课题设计思路 本项目共设置了 6 个课题。各课题间紧密联系，并各有侧重，利用模式动 物、基因敲除动物、队列人群及病人，在分子、细胞、组织、器官和整体等多 个层次，围绕 NAFLD 和高脂血症发生、发展和转归的机制、无创性诊断指标 的发现和早期干预这个中心问题，通过基础和临床相结合的转化研究策略，阐 明其发病机制、并确定早期预警指标和早期干预方法。 2.具体的课题设置、主要研究内容和目标、课题负责人及经费比例具体的课题设置、主要研究内容和目标、课题负责人及经费比例 课课 题题 1：NAFLD 和高脂血症的易感基因及表观遗传研究和高脂血症的易感基因及表观遗传研究 研究内容：本课题将综合我们项目组已有的人群队列以及肝活检标本、部分中 国人群的 SNPs 数据和国内外脂代谢通路相关基因的研究成果，重点 研究高脂血症和 NAFLD 的易感基因及其功能，表观遗传特点，生命 早期营养对脂代谢调节基因的表观遗传影响。 预期目标：阐明我国高脂血症和 NAFLD 的分子遗传学和表观遗传学特征，确 定一些对特定高危人群具有预警意义的遗传学指标；并对我国高脂 血症和 NAFLD 人群的营养因素以及生活方式进行分析，从而提出基 于减少遗传背景和环境因素相互作用的预防策略。 承担单位：上海交通大学、中国医学科学院、北京大学 负责人： 范建高教授（上海交通大学） 学术骨干：蔡威教授（上海交通大学） 唐熠达副教授（中国医学科学院） 马军教授（北京大学） 杨洋副教授（北京大学） 经费比例：16% 课题课题 2：环境因素：环境因素与与 NAFLD 和高脂血症和高脂血症发生、发展的关系发生、发展的关系 研究内容：本课题将利用前期已建立的人群队列、高脂血症和 NAFLD 患者样 本资源以及动物模型，重点研究我国人群的膳食营养和运动与脂代 谢紊乱的关系；不同类型的脂肪酸及果糖诱导高脂血症和 NAFLD 的 分子机制以及营养干预措施，以及营养和生活方式干预对高脂血症 和 NAFLD 患者的防治作用。 预期目标：明确营养因素、生活方式(运动)共同作用促发高脂血症和 NAFLD 的 分子机制；为高脂血症和 NAFLD 的生活干预方法提供科学基础，有 助于在我国高脂血症和 NAFLD 人群中推广科学合理的生活方式及理 念，从而实现早防、早治的目标。 承担单位：卫生部北京医院、暨南大学、北京大学 负责人： 黎健教授（卫生部北京医院） 学术骨干：闫道广教授 （暨南大学） 洪天配教授 （北京大学） 唐蔚青教授（卫生部北京医院） 经费比例：14% 课题课题 3：代谢性炎症在：代谢性炎症在 NAFLD 和高脂血症发病中的作用和高脂血症发病中的作用 研究内容：我们拟利用细胞、模式动物、PRR 转基因或敲除动物和部分 NAFLD 患者的肝活检样本，重点探讨模式识别受体在代谢性炎症中 产生的作用机制以及代谢性炎症的信号通路，为代谢性炎症的干预 提供新的靶点。 预期目标：阐明模式识别受体（PRR）和脂质膳食营养素在代谢性炎症中的作 用；明确 PRR 和脂质共同激活代谢性炎症的信号通路；评估代谢性 炎症的干预对高脂血症和脂肪肝发病的影响。 承担单位：南京医科大学、重庆医科大学、中国人民解放军总医院 负责人：陈琪教授（南京医科大学） 学术骨干：徐涌教授（南京医科大学） 李跃华教授（南京医科大学） 李仲副教授（南京医科大学） 陈压西教授（重庆医科大学） 叶平教授（中国人民解放军总医院） 经费比例：16% 课题课题 4：肝脏脂代谢稳态失衡与：肝脏脂代谢稳态失衡与 NAFLD 和高脂血症的发生和发展和高脂血症的发生和发展 研究内容：我们拟利用细胞模型、代谢性核受体基因敲除等模型动物、和部分 NAFLD 患者肝脏活检样本阐明核受体调节网络与肝脏脂代谢稳态调 节与失衡的关系；明确脂肪-肝脏调节轴和胰腺-肝脏调节轴对肝脏营 养感应信号通路的影响、作用机理以及在高脂血症和 NAFLD 中的作 用。 预期目标：本项目旨在揭示肝脏自身脂代谢稳态失衡的机制以及脂肪组织，胰 腺组织与肝脏器官间对话在高脂血症和 NAFLD 的形成和发展中的 作用。 承担单位： 北京大学、中南大学、中国医学科学院 负责人： 管又飞教授（北京大学） 学术骨干：朱毅教授（北京大学） 赵水平教授（中南大学） 常永生副教授（中国医学科学院） 王林教授（中国医学科学院） 杨吉春副教授（北京大学） 经费比例：22% 课题课题 5：脂质异常分布在：脂质异常分布在 NAFLD 和高脂血症发病中的作用和高脂血症发病中的作用 研究内容：我们拟利用细胞模型、模式动物和部分 NAFLD 患者的活检样本， 重点研究脂肪组织、细胞中脂滴的分解的机制及在 NAFLD 中的作用； 脂肪细胞与肝细胞脂肪酸的转运规律；肝脏脂肪酸转运蛋白 FAT/CD36 在脂肪酸二次转运中的作用及分子机制以及脂肪酸在肝脏 聚集与肝脏损害的机制。 预期目标