硕士学位论文-抗肿瘤药长春碱的提取分离工艺研究.pdf

娜介 次 掌 硕士学位论文 论文题目 作者李 晓蕾 指导教师 专业生物化学工程 学院 材料与化学工程学院 提交日期 抗肿瘤药长春碱的提取分离工艺研究 摘要 长春碱是长春花中提取的一种二聚叫垛类生物碱 , 抗癌作用明显 , 可用于治疗 急性白血病 、 何杰金氏病 。 本文研究了从长春花草中提取长春碱 , 并进一步分离纯 化为符合药典要求纯度的产品的工艺技术 。 建立了硫酸长春碱的分析方法 。 分析条件为色谱柱 中 , 流动相二乙胺一超纯水一甲醇 , 流速 , 检测波长 。 提取研究中 , 测得原草中长春碱含量为万分之 。 强极性溶剂提取效果较好 , 含酸甲醇提取率在实验范围内最高 。 原料室温下浸泡小时达到溶解平衡 , 升温有 利于提取 , 但温度过高会导致产品降解 , 以 为佳 , 此温度下提取次提取率达 到 。 将粗品纯化为的纯品 , 须经过氧化铝和硅胶两步柱层析精制 。 氧化铝柱层 析流动相配比采用氯仿正己烷体系 , 流速 , 上样量为硫酸长春碱 层析固定相在 , 该步层析后产品纯度从提高到 , 收率达到 。 硅胶柱层析流动相为氯仿 一 甲醇 一正 己烷 体系 , 流速 , 该步精制得到 的产品纯度为 , 收率为 。 的硫酸长春碱粗品经过两次过柱 , 一次结晶可得到纯度为的硫酸长春 碱 , 全过程的产品收率为 , 明显优于原有的纯化工艺收率约 。 根据小试 结果推算 , 按年产硫酸长春碱的生产规模 , 需要中 、 。枷 的硅胶柱床 。 最后 , 在过程的建模方面作了有益的探讨 , 用线性平衡关系加上忽略颗粒内部 传质的速率模型来试描述本体系的线性色谱行为 。 关键词长春碱 , 长春花 , 柱层析分离 , 溶剂提取 浙江大学硕士学位论文 , 且 呷 , 中 刀 只 勿 一, , , , 呷 , 娜 , , , , 且 ,一, , , , 七 , , , , , , 即盯即 又 浙江大学硕士学位论文 注之山之一 目红西 各种各样与肿瘤有关的疾病一直威胁着人类 , 至今已有大量的研究致力于肿瘤 学和抗肿瘤方法 。 恶性肿瘤即癌症的严重危害性是人人皆知的 , 据权威机构调查 癌症是仅次于导致人类死亡的心血管疾病的病症 。 所以研究抗癌药物的任务是非常 迫切的 。 长春碱的抗癌作用自世纪年代发现以来就倍受人们的重视 , 长春碱和长 春新碱是近四五十年来国际上应用的最多的两个植物抗癌药 。 以长春碱为原料 , 还 可合成抗癌作用更强的长春酞胺和长春新碱 、 长春瑞宾等 。 我国长春花资源极为 丰富 , 广泛分部于广东 、 广西 、 云南 、 海南岛等地 , 是生产长春碱的有利条件 。 但 长春花植物中长春碱的含量极低 , 仅约万分之几 。 目前国内一些制药厂在生产长春碱 , 如广州环叶制药有限公司 、 杭州民生制药厂 、 上海第十二制药厂等等 , 在海南还成立了一个专门的长春花研究中心 , 长期从事长 春花的研究工作 , 国外如美国 、 日本 、 加拿大 、 匈牙利 、 印度等许多国家也都对长 春碱的提取分离工艺做过研究 。 对于长春碱的提取分离工艺 , 国内外介绍的一些分离方法都比较复杂烦琐不利 于工业化 , 而 国内的很多药厂虽然己作大规模工业生产 , 但仍然存在很多问题 , 比 如收率不高等问题 。 因此有必要对其提取工艺作系统的进一步优化研究 。 硫酸长春 碱作为一种疗效很好的抗癌药 , 多采用针剂入药 , 要求很高的纯度 , 而且 生产长春瑞宾等衍生物需要以高纯度的长春碱为原料 , 所以更有必要对分离纯化方 法进行研究 , 以得到高纯度的硫酸长春碱 。 本文主要是对传统的药厂柱层析精制长春碱作进一步的工艺优化 , 在保证纯度 的基础上提高收率 , 增加经济效益 。 浙江大学硕士学位论文 加 目录 摘要 前言 目录 , , 第一章文献综述 , 长春花和长春碱概述 长春花简介 , 长春碱简介 长春碱的提取方法 溶剂提取 , 超临界萃取法 , 长春碱的分离纯化技术 柱层析法 薄层色谱法 , 巧 高效逆流色谱法 长春碱的分析方法 , 巧 制备液固色谱理论 , 、 二, 制备色谱分离过程原理书 氧化铝 硅胶 流动相的选择 制备液相色谱动态理论 第二章溶剂法粗提长春碱 硫酸长春碱定量分析方法的建立 实验仪器和条件 , , 紫外吸收图谱扫描 标准曲线绘制 , 溶剂粗提长春碱实验 “ , , , ,“ 二“ 二 ” , 。” 、 , 二 、 、 、 实验材料 实验方法 实验结果与讨论 粗提实验部分结论 , 第三章 氧化铝柱层析法纯化长春碱 实验材料及仪器 , 二 实验原料 , 实验设备及试剂 实验方法 结果与讨论 流动相中正己烷含量对分离效果的影响 , ” ” “ ” ”二“ ” “ ” ,二“ ”“ 上样量对柱分离效果的影响 , 浙江大学硕士学位论文加 最大上样量的求法 , 氧化铝柱分离效果的其他影响因素 , , 结论 第四章硅胶柱层析法精制长春碱 , , 硫酸长春碱的薄层色谱研究 , 实验仪器及试剂 实验步骤 , , 、二、 , , 一 、二、 、二、 实验结果及讨论 硅胶柱层析精制长春碱 , , 实验仪器及试剂 实验步骤 实验结果及讨论 , 最大进样量 结论 , 、 , , 二 ,、 ,、 , 、 、 基本工艺设计 结晶实验 第五章色谱数学模型 , 速率方程色谱模型的建立 。 一 模型参数的计算 色谱柱参数 轴向扩散系数 , 二 , ,、 , 一 、 、 平衡常数和液膜传质系数 , 计算结果与讨论 , , 一 第六章结论 参考文献 , 附录一 , , 附 录 二 主要符号说明 、 , “ 二 ”二 ,二、,“ 、 、 致谢 , 浙江大学硕士学位论文 第一章文献综述 长春花和长春碱概述 长春花简介 长春花为夹竹桃科长春花属植物长春花卜 的全草 , 别名日日新 、 雁来红 、 四时春 , 主产于广东 、 广西 、 云南 、 海南 岛等地 。 人们很早就知道长春花可用以止血 、 止痛 、 清洗伤口 , 治疗坏血病和控制糖尿 病 。 年代中晚期 , 和等分别从长春花中提取并发现长春碱和长春新 碱对小鼠白血病的疗效十分显著 。 此后 , 长春花生物碱的抗肿瘤作用引 起广泛的注意和深入的研究 。 至今为止己从长春花全草中分离出余种生物碱 , 如长春碱 、 醛基长春碱长春新碱 、 、 异长春碱等等 , 性味苦 、 凉 、 有毒 。 其中种具有 抗肿瘤作用 , 如长春碱 、 长春新碱等 , 种具有抗病毒作用 , 种具有利尿及降血糖 作用 , 但其中生物碱的含量都是很低 , 均在万分之几甚至百万分之几 。 我国长春花 资源极为丰富 , 是生产长春碱的有利条件 。 长春碱简介 长春碱 , 是长春花中提取的一种二聚睬类生物碱 , 长春碱可 用于抗癌 、 降压 , 尤其是其抗癌作用受到人们的重视并已应用于临床 。 长春碱与醛 基长春碱等 , 能够降低脱氧核糖核酸与核糖核酸及蛋白质的合成 , 抑制癌细胞的有丝分裂 , 使细胞分裂停止在中期 , 因而肿瘤细胞不能增殖 。 长春碱 在长春花中的含量约为万分之四 , 可用于治疗急性白血病 、 何杰金氏病 、 淋巴肉瘤 、 绒毛膜上皮癌等, , 对乳腺癌 、 卵巢癌 、 辜丸癌 、 单核细胞白血病均有一定疗效 。 对网状细胞肉瘤 、 肾母细胞瘤 、 恶性黑色素瘤也有效 , 并被若干国家药典所收载 。 浙江大学硕士学位论文 长春碱的分子式为从分子量 , 分子结构如下 口 它为针状晶体 , 不溶于水 、 石油醚 , 溶于乙醇 、 丙酮 、 乙酸乙酷 、 氯仿 。 密闭 、 闭光 、 凉暗处保存 。 味苦 , 有引湿性 , 遇光或热色渐变黄 , 熔点 一 干燥 物 , 从甲醇得到的溶剂化物针状结晶 , 折光率 十 “ 氯仿 。 其硫酸盐为白色或类 白色结晶性粉末 , 无臭 , 有引湿性 , 遇光或热易变黄 。 在 水中易溶 , 在甲醇或氯仿中溶解 , 在乙醇中极微溶解 。 熔点 一 , 。 一 , 甲醇 , 。 入 。 “。 。 一, 芳香 。 。二八。 。二 、 。,。 、 。 , 。, 认 。二 、。 八。 , , 、 。,。二八。 、 , 二 , , 一 一一 了 户 , 尹。 长春碱的提取方法 一般生物碱的提取方法有如下几种 非 弱 极性溶剂提取常用苯 、 氯仿或二氯乙烷 。 极性溶剂提取常用酒精或稀酒精 一 。 水或酸水提取生药粉末直接用水或酸水一般用一硫酸或醋酸浸泡 渗滤或加热提取 。 一般弱碱的提取方法 弱碱性生物碱在植物中往往以游离态存在 , 因此 , 可 以用苯 、 氯仿等有机溶剂 直接提取 。 而强碱仍以盐的状态留在植物体内 。 提取前应先用适量水湿润生药 , 使 植物细胞膨胀后 , 再用有机溶剂提取 , 以提高提取效率 。 或用稀的有机酸 , 如柠檬 酸水等湿润生药 , 以便使一些中等强度的碱也成盐而留在植物体内 , 再用有机溶剂 提取 。 提取液经酸水抽提 , 酸水液碱化 , 氯仿抽提即得弱碱部分的总碱 。 如生药用 水或稀醇提取 , 浓缩提取液 , 则因生药中常含一些有机酸而使浓缩液呈弱酸性 , 用 氯仿等有机溶剂振摇 , 即可将游离弱碱提出 , 如提取液中混杂有机酸 , 可视具体情 况 , 用小苏打溶液等洗去 。 浙江大学硕士学位论文加。 长春碱的提取方法主要有溶剂提取和超临界萃取两种 , 提取方法及其效果的好 坏直接影响着下一步纯化的难度及最终产品的质量 。 溶剂提取 早期人们还不十分熟悉长春碱的性质的时候 , 曾尝试用乙醇来提取 , 因为乙醇 比较经济 、 安全 , 但是后来发现长春碱在乙醇中的溶解度很小 , 提取率特别低 , 不 适合用作提取溶剂 。 等在研究柱层析结合梯度分离技术 时发现 , 在 伙 的萃取液中长春碱含量最大 , 以盐的形式被萃取出来 , 时 , 长春碱与一些性质相近物质以弱碱的形式萃取出来 , 这给以后研究酸碱水粗 提提供了依据 。 根据长春碱是弱碱性生物碱的特性 , 一般先用水浸取生药 , 使植物细胞膨胀 , 再 用苯 、 二氯乙烷等有机溶剂从浸取液中将脂溶性成分提取出来 , 这样游离的弱碱性 生物碱被提取出来 , 而强碱仍以盐的形式留在植物体内 , 接着经过稀酸液逆相萃取 , 将弱生物碱以盐的形式从有机溶剂中萃取出来 。 酸一般采用硫酸 、 盐酸或酒石酸 。 然后碱化 , 使生物碱又变为游离态 , 碱多用氨水 , 也有用 。 最后用氯仿萃取 得到总弱生物碱 。 这种方法提取率不够高 , 而且高毒性有机溶剂的用量太大 , 对操 作人员伤害较大 。 , 等 川 用碱水浸润生药 。 将生药用 一 的氨水溶液浸润后再用甲苯提取 。 但碱水浸润生药就将一些中等强度生物碱乃 至强生物碱都变成游离碱被提取出来 , 造成提出来的总生物碱所含杂质增多 , 给下 一步纯化带来更大难度 。 后来 , 改为用含少量水的甲醇浸取原料 , 接着蒸发 掉甲醇 , 将蒸得的含水浸膏加硫酸酸化 , 使生物碱转化成盐 , 再用水不溶性有机溶 剂苯或氯仿萃取浸膏把一些非生物碱有机物去除 , 碱化后再用氯仿把生物碱萃取出 来 , 最后得到 一 总生物碱 , 提取率约为 。 这样分离过程当中长春碱 、 长春新碱 、 异长春碱三种二聚生物碱均以盐的形式存在 , 而不是以敏感的易降解的 生物碱混合物形式 , 因此减少了操作步骤中的降解转化损失 , 提高提取率 。 这样得 到的生物碱量比碱水浸取的方法提高了 一 倍 , 而且甲醇的价格相对于苯 、 二氯 乙烷的价格较低 , 节约成本 , 也减少了提取步骤 , 但甲醇极性较大 , 提高了提取率 的同时浸泡出来的东西含杂质也相对较多 , 选择性不够高 。 浙江大学硕士学位论文 。 , ”侧先将生药在索氏抽提器用石油醚进行脱脂处理 , 接着 二氯乙烷重复萃取 。 直接用苯提取可以同时去除油脂 , 但是苯毒性太大 、 易燃 , 应 尽量避免使用 。 而用石油醚脱脂经济实用 , 还使后面进一步萃取工作相对简单 , 防 止了乳化现象的产生 。 后来又用经酸化的的甲醇提取生药 , 酸化使 得长春碱等弱生物碱也转化成盐的形式 , 更易被甲醇提取出来 , 比只用甲醇的提取 率有所增加 。 提取液浓缩之后加硫酸调 二 , 有部分酸不溶性杂质沉淀出来 , 再 用氨水碱化后二氯乙烷萃取得到粗提到总弱生物碱 。 这种方法比以前进步了许多 , 步骤简化 , 提取率增加 。 一 等人曾用一种繁琐的方法得到高纯度的长春碱产品 。 将 全草粉碎后用乙醇浸取然后酸化 , 再用氯仿萃取 , 然后磷酸缓冲液再次萃取 , 萃取 物浓缩干燥后溶于氯仿 , 在氯仿中用石油醚沉淀部分杂质生物碱 , 又溶于乙酸乙醋 再用磷酸缓冲液萃取 , 最后碱化 , 得到富含长春碱的部分 , 提取率为 , 提 取得到的总生物碱中长春碱含量为 。 此法提取率较高 , 最后得到的总生物碱中 长春碱含量也较高 , 但是提取步骤过于复杂 , 经过多次萃取 、 浓缩 , 耗用大量溶剂 , 只能用于制备少量作研究用 , 而不适合大规模的工业化生产 。 近年来 , 人们越来越重视环保问题 , 在医药工业中也一样 , 尽量减少有机溶剂 的使用量是工业上所采取的一种方式 , 于是 , ,等 将甲醇浸取改 为用酸水浸取 。 新鲜收割的长春花全草分别用 乙酸酸化的酸水浸取两次 , 水相浸取液用氨水调为 一 , 再用二氯甲烷萃取 , 蒸千溶剂得到生物碱混合物 , 提取率为 , 生物碱混合物中长春碱含量 。 该方法提取步骤简单 、 有机溶剂使用量较少 , 避免了用苯 、 甲醇等毒性较强的溶剂 , 毒性相对较小 , 增强 了操作人员的安全性 , 而且提取率比较高 , 适于工业生产的操作 。 但是酸水极性较 大 , 选择性低 , 提取物中所含杂质比较多 , 必须要有成熟高效的柱层析方法作为后 续操作步骤 , 才能得到高质量的产品 。 超临界萃取法 这方面的研究比较少 。 七十年代,等人 “ 初步研究了长春碱的超临界 流体微量萃取 , 在压力为 , 提取温度为 以下的条件下 , 最后发现萃 取效果不佳 , 此条件下从萃取效果比稍好 , 而且盐的形成会降低对生物碱的 浙江大学硕士学位论文 萃取能力 。 最近 , 等研究发现用二氧化碳一甲醇一三乙胺以 的比例能够有效的提取长春花全草干粉中的长春碱 , 在 、 时能将超临界 萃取的萃取率提高到甲醇萃取的 , 而不加改性剂或其它改性剂的条件下萃取 率不及甲醇萃取的 。 研究表明超临界萃取中使用三乙胺等碱性改性剂后提取率 大大提高 , 几乎可与传统的有机溶剂萃取相媲美 , 而且超临界流体无毒 、 无污染 , 萃取所需时间短 、 能耗低 。 但是由于超临界流体萃取需要耐高压的设备 , 设备成本 较高 , 进行大规模原料萃取从经济的角度看不太适用 。 长春碱的分离纯化技术 一般生物碱的分离纯化方法有如下几种 分步结晶利用各种生物碱在不同溶剂中的不同溶解度以达到分离目的 。 制备衍生物许多生物碱的盐往往比游离碱更易于结晶 , 因此 , 可利用其盐在 各种溶剂中的不同溶解度进行分离 , 分离后再使转成游离碱 。 利用不同酸碱度碱度不同的混合生物碱在酸水溶液中 , 加适量的碱液有机溶 剂萃取 , 再逐步添加碱量 、 萃取直至将不同碱度的生物碱全部萃取出来 。 分馏由不同沸点组成的液体生物碱总碱 , 往往可通过常压或减压分馏分离 。 层析法当用一些简便方法还未能达到分离目的时 , 往往采用柱层析法 , 常用 氧化铝有时也用硅胶吸附层析 , 以苯 、 乙醚 、 氯仿等溶剂洗脱 , 如柱层析结果 仍不理想 , 可采用氧化铝或硅胶薄层层析制备性分离 。 层析法的分离能力很强 , 能 使一些含量低 、 组分复杂的生物碱分到单体 。 但是层析法技术也有一些缺点 , 例如 要求高 , 周期长 , 消耗溶剂多等等 , 这就需要摸索出合理经济的工艺路线 , 以投入 工厂进行大规模生产 。 在实践中 , 往往是上述几种分离提纯方法交叉与反复使用 , 一般首先试用分步 结晶或成盐的方法 , 把能够分出的生物碱先分出 , 然后它的母液再用柱层析或利用 不同酸碱度方法进一步分离 。 有时使用不同酸碱度或层析法只得到有效部位而不能 分出单体时 , 可将有效部位再用分步结晶或成盐方法进行分离 。 总之 , 应根据具体 情况灵活掌握上述方法 。 减尹 口, 浙江大学硕士学位论文加 长春碱纯化的主要目的是将粗提后总生物碱中的长春碱 、 长春新碱 、 异长春碱 以及一些结构性质比较相近的生物碱分开 , 使目标产品分离出来 。 长春碱的纯化方法主要有柱层析法 , 制备型法 , 制备型法和 离心逆流色谱法等 , 制备型和的方法往往分离量小 、 成本较高 , 制 备型设备价格昂贵 , 而且分离量小 , 都不太适合工业应用 , 常规的柱层析简 单易行 、 成本低 、 处理量大 , 比较适合工业化生产 。 柱层析法 一次过柱 长春碱的柱层析纯化一般是通过一次碱性氧化铝柱 , 除去极性较低的碳氢化合 物及部分中性 、 酸性物质 。 氧化铝用前要经过 一活化处理 , 降低含水量 , 提高活性 , 但活性太高也不行 , 产品被吸附在上面下不来 , 所以要选择合适的氧化 铝活性 , 一般为级 , 含水量 一 。 层析中流动相的溶剂体系很多 , 由于长春碱是中极性物质 , 溶剂的极性不能太 高 , 一般有苯一氯仿 、 苯一石油醚 、 苯一二氯甲烷 、 二氯甲烷一氯仿 、 乙酸乙酷 一石油醚等以不同比例等度或梯度洗脱 。 收集流出液主要得到三段流分 , 前段主要 为长春碱 , 中段为长春次碱和长春新碱的混合物 , 后段主要为长春新碱 。 利用碱性 氧化铝柱一般可以从碳氢化合物中除去含氧化合物 , 能完全将长春碱和长春新碱分 开 , 它们仅相差一个基团长春碱甲基 , 新碱醛基 , 但是长春碱常常和异长春碱等 一些杂质是分不开的 。 这种方法是目前工厂中用于大规模生产的方法 , 但是它的缺 点是最终产品的纯度不够高 , 而且大量使用苯 、 氯仿这些毒性很大的溶剂 , 给操作 人员和环境带来很大的危害 。 我国学者经过反复实践 , 摸索出了一个相对比较简单的生产方法 。 生产方法主 要根据这两个生物碱都是弱碱的特点 , 用苯渗滤生药 , 酒石酸提取弱碱 , 再通过控 制制备硫酸盐粗结晶 , 而后经转成游离碱 , 通过一次氧化铝层析即分得主要为 这两个生物碱的单体 。 具体操作步骤 渗滤和萃取长春花全植物粉过目筛孔加自来水以生药 浙江大学硕士学位论文 水 比例拌匀 , 放置约半个小时 , 投入预先放好苯的渗滤桶中浸没 , 加盖密闭 浸个小时后开始渗滤 , 随时添苯 , 不使表面流千 。 收集生药倍量的苯渗滤 液 , 与酒石酸在四支串连的玻璃管中进行液 一 液逆流萃取 。 当第一管酸水 时 , 放出 , 换入新配的酒石酸溶液继续萃取 , 直至苯液全部交换完 , 放出底 、 第管中的酸水液 , 置分液漏斗中 , 先加入倍的氯仿 , 然后加入约 的氨水调节至 一 , 振摇 , 放出氯仿层 , 以后又用水溶液体积的倍的氯 仿摇三次 , 氯仿提取液静置去水 , 减压蒸干 , 然后加少量丙酮抽松 , 得总弱生 物碱 。 将总弱生物碱加甲醇倍溶解 , 放过夜 , 滤去结晶 , 甲醇滤清液 , 减 压蒸干 , 抽松 , 将此游离碱加无水乙醇倍溶成浓液 , 然后加硫酸乙醇溶 液至 一 , 放置过夜 , 析出混合长春碱硫酸盐 。 滤出 , 加蒸馏水 , 一 倍溶解 , 移入分液漏斗中先加倍量的氯仿 , 然后加氨水调节到 一 , 振 摇 , 将此游离碱提入氯仿 , 直至最后振摇的氯仿不呈明显的生物碱反应为止 , 共约提六次 , 氯仿提取液加无水硫酸钠干燥 , 滤出 , 减压蒸干 , 得纯化游离弱 减 。 长春碱 、 长春新碱的分离将上述纯化游离弱碱在真空干燥器充分干燥后 , 按克用克氧化铝化学纯的比例 , 在氧化铝柱上层析分离 , 洗脱溶剂用 重蒸的苯 一氯仿混合溶剂 比重冲洗 , 分段收集 , 用薄板层析检查 , 相当 流份合并 。 前段减压蒸去溶剂 , 抽干 , 放的真空干燥器中抽干小时以 上 , 称重 , 加无水乙醇 一 倍溶解 , 再加 , 使无水乙醇溶液至一 , 密塞在 以下 , 放置个小时 , 析出长春碱硫酸盐结晶 , 滤出 , 少量 无水乙醇洗后 , 立即移至真空干燥器中干燥 , 即为硫酸长春碱粗品 , 中段为交 叉混合物另行处理 。 后段经薄板层析检查的相同流份合并 , 减压 , 蒸去溶剂 , 抽干 , 至真空干燥器干燥 , 称重 , 加无水乙醇 “ 倍溶解 , 加无水 乙醇溶液至一 偏 , 塞紧在 以下放置 个小时 , 即析出长 春新碱的硫酸盐粗品 。 精制硫酸长春碱粗品 , 加入蒸馏水和甲醇使在 加热全溶 , 滤过 , 容 器用甲醇洗 , 滤液合并 , 减压回收甲醇 , 立即将倍量预先热至沸的无水乙 醇加入 , 迅速摇匀后放置 , 很快析出白色针晶 , 放过些时 , 滤出干燥 , 即得硫 冲明 浙江大学硕士学位论文加 酸长春碱的精品 , 熔点 分解 。 精制 硫酸长春新碱粗品 , 加入少量甲醇溶解 , 过滤 , 减压浓缩掉部分甲醇 , 将倍量的无水乙醇加入 , 摇匀 , 放置过夜 , 滤出析出的结晶 , 放千燥器抽干 , 即为精制硫酸长春新碱 , 熔点 一 。 此外 , 文献中还有记载匈牙利 、 加拿大等国也对此种一次过柱的方法进行过研 究 ”, 。 匈牙利专利中基本步骤相同 , 都用氧化铝柱层析 , 只是浸取萃取溶剂及洗 脱溶剂不大相同 。 它使用含酒石酸的的甲醇溶液浸取 , 二氯乙烷多次萃取 , 用 。一 洗脱 。 用干药得到约几 , 得率万分之三左右 。 还有用苯和石油醚做洗脱流动相 , 但从文献中看不如前者效果好 。 而加拿大专利中 原料药也是采用了甲醇浸取 , 分别用含 , 水的甲醇溶液浸取 。 用甲 醇浸取极性比较大 , 溶出物质较多 , 后面应再加一步脱脂的工作 , 但用甲醇浸取较 易回收 , 且更便宜 。 该专利中用于进行柱层析的流动相是和混合 溶液 , 而这两种溶剂性质比较相近 , 用来作洗脱剂可能选择性不高 , 分离效果可能 不是很好 。 对一次过柱法流程进行总结 长春花全草干习分一有机溶剂浸取一酸化将生物碱转化为盐溶于酸水中 碱化一有机溶剂多次萃取 , 浓缩干燥 , 得总生物碱一一柱层利卜一分段收集 , 丁比鉴定各段成分一对目标产物段浓缩干燥 , 精制一今目标产物硫酸长春碱 几种一次过柱法的比较表 表 一 几种柱层析方法的比较 方方方浸取溶剂剂提取溶剂剂层析固定定流动相相 评述述 法法法法法才目目目目 含酒石酸的的 一 刃玩梯梯法 、 浸取液均用强极性溶剂甲甲 的 甲醇溶溶溶溶度 , 增加坛浓浓醇 , 提取率较高 , 但含杂质较多 , , 液液液液液液度度也需进行脱脂处理 , 防止后续步步 骤骤骤骤骤骤骤骤骤骤骤骤骤骤骤骤骤骤骤骤骤骤骤骤骤骤骤骤骤骤骤乳化严重中用苯浸取 , 提提 , 一 取率比甲醇低 , 选择性较好同时时 的甲醇醇醇醇可除去油脂 , 但有毒性大 、 易燃 、 致致致致致致致致致致致致致致致致致致致致致致致致致致致致致致致癌等缺点 , 应尽量避免使用 。 生药一苯苯刃重蒸的苯和氛仿混混萃取溶剂使用 、 等等 为为为合液 , 比重 或或或工业甲醇 浙江大学硕士学位论文 的热乙醇 , 提取液加 调 硅胶正己烷一乙酸乙酉旨中极性溶剂比较适合生物碱的萃 取中用的热乙醇加硫酸 主要是为了在提取生物碱的同时 将一种酸不溶物熊果酸也提取 出 来 , 这样得到的生物碱在酸水液 中 , 而熊果酸在酸不溶物中 。 两次过柱 只利用一次氧化铝柱层析往往不能得到较高纯度的长春碱 , 而硫酸长春碱作为 针剂入药或者作为原料生产近年来开发出的抗癌作用更强的药品 长春瑞宾均需 要以纯度较高的长春碱为原料 , 因此就需要选择合适的固定相进行二次过 柱除去氧化铝不能除去的杂质 , 如用硅胶或其它吸附剂 。 , 等人采用了两次过柱的方法来生产较高纯度的硫酸长春 碱 。 将粗提后的总生物碱粗品先通过经丙基交联葡聚糖凝胶 柱粗分 , 用二氯甲烷一甲醇或者氯仿一甲醇作流动相 , 分段收集流分 , 把含长春碱 部分合并浓缩 。 接下来过二柱硅胶柱进一步纯化 , 硅胶须经过去活处理 。 用 一 甲醇一氯仿梯度洗脱 , 含长春碱部分蒸馏 , 除去溶剂 , 最后在无水乙醇中结晶 , 得 到含量较高的硫酸长春碱产品 , 收率为 。 此法第一次过柱粗分时所用的固定相价格比较昂贵 , 成本较高 , 且多次使用会造成不可逆吸附 , 分离效果变差 。 所以使用时必须注意尽量减少污染 凝胶 , 在操作中所用的蒸馏水 、 器皿和实验室都要干净无灰尘 , 避免再度污染凝胶 。 如果凝胶的再生和保护问题能处理好 , 可以多次使用 、 经济上适用的话 , 这将是一 个很好的获得高纯度长春碱的分离方法 。 多次过柱 一 等人经过三次过柱纯化得到高纯度长春碱 。 首先经过复杂的提 取步骤得到粗提的总生物碱 , 再过氧化铝柱 , 然后过硅胶柱 , 最后又用制备型 分离 , 均用乙酸乙醋一石油醚梯度洗脱 , 最后得到纯的长春碱 。 但是 这种方法步骤烦琐 , 收率非常低 , 三次过柱总收率仅为 , 制备量也很少 , 不适 合工业上应用 。 浙江大学硕士学位论文 薄层色谱法 薄层色谱一般认为是一种定性和半定量的方法 , 常用来少量制备研究或者筛选 工业生产中的柱层析流动相 。 硫酸长春碱分离常用的薄层板有氧化铝板和硅胶薄板等 , 展开剂的选择主 要根据样品的极性 、 溶解度和吸附剂的活性等因素来考虑。 通常采用的展开剂有氧 化铝板含 乙睛的苯一含乙醇的乙睛 、 苯一氯仿 、 氯仿一 乙酸乙酷 、 氯仿一 乙醚一石油醚硅胶板 乙酸乙醋一无水乙醇 、 氯仿 一甲醇 、 氯仿一甲醇一石油醚 , 等 。 薄层色谱分离量太小 , 不适合大规模工业化生产 。 高效逆流色谱法 逆流色谱是一种不用固态支撑体或载体的液液分配技术 ,一 等人利用这种方法在区精制模式下从粗提过的长春花生物碱混合物中制备级 高效分离出文多灵 、 和长春碱等几种生物碱 。 粗提物 用高效逆流色谱柱 , 甲基叔丁基醚一乙睛一水的溶液静 置得到的有机相和水相作为逆流的两相 , 用盐酸和三乙胺调体系的酸碱性 , 在 上升模式下分离得到长春碱 。 高效逆流色谱法在分离多组分混合物时 , 如果采用一种恒定的洗脱条件 , 往往 不能将所有组分适当分开 , 因此采用值变化的模式 。 即便如此 , 还会有些峰难 以分开 , 所以同时还必须考虑径长比 , 径长比越小越容易分离 , 但是要保持柱效率 长期稳定 , 往往又是比较困难的 。 而且这种方法现阶段分离量小也是存在的一个问 题 。 所以 , 仍处于研究阶段 , 不适于大规模工业应用 。 长春碱的分析方法 长春碱的分析方法很多 , 有薄层一紫外分光光度法 、 薄层扫描法 、 高效液相 色谱法 、 非水相毛细管电泳法 、 班 结合 材 法 、 及电化学分析法等 。 版中国药典规定用紫外分光光度法测定长春碱的含量 , 但后来发现其分解 产物在所测波长处也有吸收 , 对测定有干扰 , 而且薄层定量也不太准确 , 现已改为 浙江大学硕士学位论文 用法 。 目前应用最多的是即法 , 对于文献中的关于植物提取物中长春碱 、 长春新碱的分析方法 , 在下表中作出总结 。 表 一 长春碱 、 长春新碱的分析方法总结表 心 一 牛 , 磷酸盐缓冲液一 甲醉 , 压戊烷 磺酸钠 一 乙腑一 碳酸钠溶液 即 乙睛一 醋酸钠和 吧 戊烷磺酸钠水溶液 , 比一砌 , 一 一 的甲醇一水溶液 , 含 乙醇胺 , 乙二胺一水一甲醇 , 磷酸调 十 一 醋酸钠一乙睛一甲醇 与两种 流动相梯度洗脱 这些分析方法大都使用了盐缓冲溶液 , 这也是很多天然产物分析的一大特点 。 但是盐的进入对整个色谱体系是不利的 , 容易将泵头或其它内径很小的管线堵塞 , 需要采取一定的保护措施 , 盐的浓度应尽量低 。 使用钠盐缓冲液 , 值往往较高 , 造成分析时间过长 , 而且由于高效液相色谱柱所允许的流动相值使用范围是 一 , 过高的流动相值会使固定相中作为载体的硅胶溶解 , 使色谱柱寿命缩 短 。 从色谱图上看 , 固定相 , 一一一 的分离效果不好 , 长春碱 、 长春新 碱和均不能达到基线分离 , 而 即 一 分离效果较好一些 , 长春 碱能够和其它物质基线分离 , 但是长春新碱和不能完全分开 。 反相柱 对长春碱的分离效果较好 , 能将长春碱 、 长春新碱 、 长春酞胺完全基线分离 , 而且 流动相盐浓度不高 , , 值为 , 在使用范围以内 。 用离子对反相色谱 , 对某些生物 碱可 以较好地分离 , 也能将三者完全分开 。 苯基柱对长春花生物碱也有一定的分离 效果 , 但不如 。反相柱分离效果好 。 长春碱分析方法中所使用的检测器多为紫外检测器 , 等用 一 检测 , 提高了检测的灵敏度和线性范围 。 浙江大学硕士学位论文 制备液固色谱理论 固定床色谱作为分析工具和分离方法已经得到广泛的应用 。 大规模液相色谱 技术也随之得到迅速发展 。 年公司提出抢 工艺 , 使用固定 床色谱 , 以工业规模成功地从烷基碳氢化合物中分离芳烃化合物 。 随之 , 固 定床色谱在工业上的应用范围越来越广 。 大型液相色谱装置指冲洗色谱 已经工业化 , 直径一米以上的色谱柱和整 套附属设备已经定型 , 直径的制备色谱柱已经规范化作为商品出售 , 而 更大直径的色谱柱也己经用于石油化工 , 制糖工业和其他行业 , 在医药和精细化 工中应用大型液相色谱柱分离液相产品的技术已日趋成熟 。 随着化工 , 生物 , 医 药 , 食品行业的迅猛发展 , 大规模液相色谱日益成为重要的分离手段 。 色谱装置的大小可以按产品量和处理量的多少分为分析规模制备色谱 、 实验 室规模制备色谱和大型工业色谱几种 。 分析规模制备色谱是在实验室分析仪 器上 , 色谱柱按比例放大 , 其大多数色谱参数如线速度 , 柱尺寸 , 样品量与柱截 面积之比等和分析分离大致相同 。 实验室规模制备色谱其色谱系统和技术与分析 分离具有较大的差别 , 色谱柱在超负荷条件下工作 。 制备色谱分离过程原理 色谱柱内填充吸附剂 , 在填充状况良好的情况下 , 当含有溶质的流动相流过 此床层并和固定相接触时 , 相互作用 。 溶质在两相内在一定时间内 , 达到动态平 衡 , 对于液固色谱 , 溶质在两相内的分配取决于吸附等温方程的吸附平衡常数 。 此平衡常数表征溶质在一定的温度和浓度下 , 与固定相以及流动相的亲和力 大小 , 反映各组分在固定相中的保留能力 。 流动相在床层内不断流动 , 溶质组分 在床层固定相内不断地达到平衡 , 这种动态的平衡过程 , 使色谱峰或流出曲线 不断地移动 。 移动速度除需考虑流动相的流速外 , 相平衡常数表征亲和力的大 小的常数是决定性的因素 , 可以说溶质组分在床层内滞留时间的长短与亲和力 有关 , 亲和力小的组分 , 保留时间短 , 亲和力大的组分保留时间长 , 从而使亲和 力不同的溶质组分得到分离 。 分析型色谱由于进样浓度低 , 处于吸附等温线的线 性区域 , 得到的色谱峰是对称的高斯曲线 。 制备色谱往往进样浓度高 , 组分浓度 浙江大学硕士学位论文加 落在吸附等温线的非线性范围内 , 平衡常数随流动相中溶质浓度的改变而改变 , 使所得的色谱峰不对称 , 甚至导致峰形重叠 。 制备液相色谱与分析液相色谱相比 , 最突出的特点是进样量很大 。 进样量的 变化会对色谱分离参数如分离度 , 容量因子定义为溶质在固定相和流动相中 的分配量之比 , 保留值和理论塔板当量高度等产生较大的影响 。 每一种色谱柱的固定相都有一定的样品线性容量 。 线性容量是指在线性等温 线的范围内 , 单位重量的固定相上能够负载样品的量 。 提出 , 吸附剂的线 性容量用 。 表示 。 。 定义为样品的容量因子下降相对于小进样量下 测定的一定或理论塔板当量高度增加两倍以上时的样品量 。 在线性容量的范 围内 , 谱带的高度随进样量的增大而增加 , 而 、 保留值和分离度都保持不变 。 当样品超过线性容量范围时 , 随着进样量的增加 , 容量因子下降 , 理论塔板当量 高度增大 , 此时样品量与柱效之间己失去线性关系 。 当样品量大于线性容量时被 定义为样品过载 。 制备色谱要在保证产品纯度和回收率的前提下 , 尽力提高色谱柱的原料处理 量和产品的产率 。 工业上还要考虑溶剂回收的能耗和设备操作费用 。 为了达到在 一定的分离度条件下 , 加大色谱柱处理量的要求 , 可以在每单位时间内增加原料 容积进料量或者提高原料中组分的浓度值 , 使色谱柱在超载下操作超载是指对 分析色谱柱的工作条件而言 。 同时适当地切割部分馏分 , 用循环进料的方法 , 提高产品的产量 。 除了上述几个因素 , 还要注意色谱出峰要快 , 使色谱柱的操作 周期缩短 , 得以提高生产能力 。 色谱分离效能指标常用分离度表示 , 定义为 凡 珠 一 珠 叽矶 一 式中 , 与 础为相邻两个组分的保留体积 , 与为两相邻组分色谱峰 的峰宽 。 当 时两个组分可以完全分开 , 时两组分可分离 。 制备 液相色谱分离的目的是要得到大量的单一纯品 , 分离过程是在样品过载下进行 的 , 州用值表示这种过载 , 样品过载的值将低于 。 但在实践中 , 为了提高设备的生产能力 , 都大大低于这个数值 。 值至少应该取多少 , 应 综合考虑产品纯度的要求和生产能力等各方面的因素 , 并不是值越大越好 。 浙江大学硕士学位论文 分离度的大小是由热力学平衡和动力学因素两种效应决定的 。 影响分离度的 主要因素是容量因子 、 分离因子 。 和色谱柱的理论塔板数 。 其中 , 和反 映了溶质的保留性质和色谱峰的相对位置 , 其取决于溶质 、 流动相 、 固定相的性 质以及温度等条件 。 但是仅从热力学平衡来考虑色谱分离是不充分的 。 即使在热 力学上认为可行的色谱分离 , 由于色谱峰在通过柱子时的扩展 , 溶质有可能分不 开 。 谱峰扩展反映了色谱柱中的动力学因素 , 导致分离度下降 。 理论塔板数 控制了色谱峰的扩展程度 , 主要是由色谱柱本身的特性和色谱操作条件决定的 。 色谱分离理论指出 , 评价色谱分离有三个主要的指标分离度 , 分离速度和 分离样品量 , 这三者相互关联和制约 。 对于一个特定的色谱分离系统 , 改善任何 一项指标都必须靠牺牲另两项指标来实现 , 或者任何两项指标也可 以靠牺牲其余 一项而得到改善 。 对于分析液相色谱 , 其目的是对样品中的各组分作出定性和定 量的分析 , 分离度和分离速度是其主要要求 , 应尽量降低样品量 。 而制备色谱的 目的在于大量分离以取得一定回收率和一定纯度的单一产品 , 不得不损失分离度 和分离速度 。 由此 , 制备色谱与分析色谱相比 , 具有以下一些特点 色谱柱的尺寸分析色谱用的色谱柱一般内径小 , 长度较长 , 死体积 小 , 流动相的线速度高 。 制备色谱为了提高生产能力 , 往往使用大直径 , 短柱长 的色谱柱 。 柱的两端有较大的死体积 , 进出口的截面积较大 , 这样流体在柱内流 速分布不均一 , 将使柱内产生涡流 、 返混 、 边壁效应 。 而且柱的两端突然收缩或 扩大容易使进料液产生涡流 , 影响柱内液流分配 , 使色谱柱的分离度恶化 , 产品 纯度下降 。 进料量分析色谱的进样量很小 , 往往只有几微升的进料 , 进柱组分 的浓度处于吸附平衡等温线的线性范围内 , 可以不考虑各组分间的干涉和竞争吸 附 。 因此 , 柱出口处较容易得到对称的流出曲线 , 色谱峰拖尾的现象比较容易克 服 。 制备色谱为了提高产量 , 要求进样量很大 , 且一般样品的浓度比较高 , 色谱 柱中组分浓度处于吸附平衡等温线非线性一端 , 往往会出现不完全分离 , 得到拖 尾的色谱峰或重叠峰 , 使得各组分的纯度和回收率下降 。 进样的方式进料的方式对色谱峰的峰宽 、 峰形都有直接的影响 。 对 于分析色谱 , 由于进样量小 , 是矩形波式脉冲进样 , 可以提高色谱柱的分离效果 浙江大学硕士学位论文 加 和柱的利用率 。 制备色谱由于进样量大 , 要成矩形波是很难的 。 氧化铝 氧化铝可能带有碱性因其中可混有碳酸钠等成分 , 对于分离一些碱性中 草药成分 , 如生物碱类的分离颇为理想 。 但是碱性氧化铝不宜用于醛 、 酮 、 醋 、 内醋等类型的化合物分离 。 因为有时碱性氧化铝可与上述成分发生次级反应 , 如 异构化 、 氧化 、 消除反应等 。 除去氧化铝中级碱性杂质可用水洗至中性 , 称为中 性氧化铝 。 中性氧化铝仍属于碱性吸附剂的范畴 , 本适用于酸性成分的分离 。 用 稀硝酸或稀盐酸处理氧化铝 , 不仅可中和氧化铝中含有的碱性杂质 , 并可使氧化 铝颗粒表面带有或的阴离子 , 从而具有离于交换剂的性质 , 适合于酸性 成分的层析 , 这种氧化铝称为酸性氧化铝 。 而且氧化铝具有价廉 、 再生容易 、 活 性容易控制而能适应不同化合物层析要求等优点 。 供层析用的氧化铝 , 用于柱层析的 , 其粒度要求在目之间 。 粒度 大于目 , 分离效果差小于目 , 溶液流速太慢 , 易使谱带扩散 。 样品与 氧化铝的用量比 , 一般在之间层析柱的内径与柱长比例在 一 之间 。 在用溶剂冲洗柱时 , 流速不宜过快 , 洗脱液的流速一般以每半小时内流 出液体的毫升数与所用吸附剂的重量克相等为合适 。 一般工业用氧化铝的技术指标如下表 表 一 工业氧化铝的技术指标 指指标名称称 一 球球 一 球球 堆堆积密度 妻 比比表面积 一 二 孔孔容 一一 静静态吸附容量 二 一一 抗抗压破碎强度 妻 磨磨耗率 蕊簇 浙江大学硕士学位论文 硅胶 硅胶是色谱中最常用的固定相 , 它价格低廉 。 硅胶的分子式为 是一种坚硬无定型链状和网状结构的硅酸聚合体颗粒 。 由于具有经基官能团硅 醇基 , 所以硅胶表面有强极性和亲水的性能 , 为一种亲水性的极性吸附剂 。 它 有多种形态 , 干燥用的硅胶是所谓的 “ 干凝胶 ”。 水凝胶脱水的方法很多 , 对硅 胶颗粒的机械强度和性质都有影响 。 硅胶的孔径在 一 之间 , 大孔硅胶的平均孔径为左右 , 比表面 积为 , 细孔硅胶的平均孔径在 一 之间 , 比表面积为 勺 。 工 业用硅胶的基本特性见表 。 表 一 工业用硅胶的基本特性 真真密度 颗颗粒密度 , , 装装填密度 , , 孔孔隙率率 孔孔隙容积 , 比比表面积 , 平平均孔径 由于硅胶表面轻基官能团产生的极性 , 使硅胶对极性分子和不饱和烃有明显 的选择性 , 特别对芳香烃的键有很强的选择性能 。 硅胶结构中的经基是它的吸 附中心 , 所以硅胶的吸附特性取决于结构上的经基与吸附分子之间的相互作用力 的大小 。 一些官能团的吸附强度大致为 不吸附的分子 , 如烷烃 , 氢 弱吸附的分子 , 如硫醚 , 硫醇 , 烯烃 , 双环或单环芳烃 , 卤代芳烃等 中等吸附的分子如多核芳烃 , 醚 , 硝酸基化合物和大多数的拨基化合物 强极性的分子 , 如酚 , 醇 , 胺 , 酞胺 , 亚枫 , 酸和多官能团的化合物 。 硅胶颗粒的形状 、 粒径的大小分布对色谱柱的填充效果 、 分离效率都有 很大的关系 。 硅胶的比表面积和平均孔径的大小 , 也会影响溶质的保留性质 。 对于分子尺寸较小的吸附质 , 近似地保留值与比表面积成正比 。 孔径影响溶 剂通过颗粒的迁移速率 , 同时与分子的立体构型也有关系 。 浙江大学硕士学位论文 。 水对硅胶的活性有很大的影响 。 在 下长时间加热 , 硅胶表面吸附 水脱去 , 呈现最大的活性升温至 以上 , 表面发生反应 , 相邻经基形 成氢键 , 继续升温 , 经基失水成为硅氧烷 , 活性中心消失 。 对于大孔硅胶 , 上述过程是可逆的 。 如果脱水发生在小孔硅胶上 , 则上述过程是不可逆的 。 因此 , 应注意控制硅胶的活化温度及含水量 。 流动相的选择 在液相色谱中 , 流动相的作用是非常重要的 。 对己选定硅胶作为固定相 的液固色谱来说 , 控制分离选择性和分离速度则主要靠选择合适的流动相来 实现 。 提出用溶剂强度参数 “作为溶剂相对强度的度量 。 。”是溶剂分子在 单位吸附