药理学博士论文-芫花酯甲抗黑色素瘤的作用及其机理的初步研究.pdf

中国协和医科大学 博士学位论文 芫花酯甲抗黑色素瘤的作用及其机理的初步研究 姓名：张炜 申请学位级别：博士 专业：药理学 指导教师：张德昌 20070601 中国协和医科大学，中国医学科学院博士论文 英文缩略语 英文全称 英文缩略词表 中文全称 a w a a a p a f - i a t p 酽p - a t p b s a 【c a 2 + 】i c c k - s c d c c d k c i c 归c d a b d t t e b e d t a e g f p f c s f i t c g t p g 6 h h i s 3 h t d r m e m b r a n ep o t e n t i a l a p p l i c a t i o n a p o p t o t i cp r o t e a s ea c t i v a t i n gf a e t o r - i a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e 把pl a b e l e da t p b o v i n es e r u ma l b u m i n i o n i z e di n t r a c e l l u l a rc a l c i u m c e l lc o u n tk i t - 8 c e ud i v i s i o nc y c l e c y c l i n - d e p e n d e n tk i n a s e c u r i e c y t o c h r o m ec p - d i m e t h y l a m i n o a z o b e n z e n e d i t h i o t h r e i t o l e i l l i d i u mb r o m i d e e t h y l e n ed i a m i n et e n c e ca c i d e n h a n c eg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n f e t a lc a l f s e r u m f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e g u a n o s i n et r i p h o s p h a t e g 0 6 9 8 3 h o u r h i s t o n el i l - 5 t r i t i u ml a b e l l e dt h y m i d i n e 膜电势 涂抹 凋亡蛋白酶激活因子1 三磷酸腺苷 t 位3 2 p 标记的a t p 牛血清白蛋白 细胞内钙离子浓度 细胞计数试剂盒 细胞分裂周期蛋白 细胞周期素依赖激酶 居里 细胞色素c 对二甲基偶氮苯 二硫苏糖醇 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 增强性绿色荧光蛋白 胎牛血清 异硫酸酯荧光素 三磷酸鸟苷 小时 组蛋白h i s t o n e - s 3 h ( 氚) 标记的胸腺嘧啶 中国协和茨科大学冲国医学科学院博士论文 i n h i b i t o ro f a p o p t o s i s 5 0 i n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n i n t e r l e u k i n i n t r a p c r i t o n e a li n j e c t i o n k a n a m y c i n m 0 1 1 i t e r m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e m i t o e h o n d r i a m i t o s i s p r o m o t i n gf a c t o r m i l i l i r e r m i c r o m o l e h i t e r o p t i c a ld e n s i t y p o l y a c y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n p o l y e t h y l e n eg l y c o l p r o p i d i u mi o d i d e p r o t e i nk i n a s ec c l a s s i c a lp r o t e i nk i n a s ec p h o r b o l1 2 m y r i s t a t e1 3 - a c e t a t e p r o t e i n 3 - s n - p h o s p h a t i d y l l - s e r i n e p e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o np o r e p o l y v i n y l i d e n ed i f l u o r i d e r o t t l e r i n s e c o n d s u b c u t a n e o u si n j e c t i o n s o d i u md o d e e y ls u l f a t e t r i s b u f f e r e ds a l i n et w e e n 凋亡抑制蛋白 半数抑制浓度 白介素 腹腔注射 卡那霉素 摩尔每升 丝裂原激活蛋白激酶 线粒体 分裂促进因子 毫升 微摩尔每升 光密度 聚丙烯酰胺凝胶电泳 磷酸缓冲液 聚乙二醇 碘化丙啶 蛋白激酶c 典型性p k c p k c 激动剂 蛋白 磷脂酰丝氨酸 通透性转运孔 聚偏二氟乙烯 秒 皮下注射 十二烷基磺酸钠 吐温t r i s 盐缓冲液 肿 儿 砸 m 脚 差 | 薹 蚰 州 一 哦 l 堇 h 眦 一 n i 2 m 一 】蔓 。 ：i 哪 一 中国协和医科大学中国医学科学院博士论文 t c a t e t e m 匣d t h r t n f t r i s t y r 呜 v d a c y h c t r i c h l o r o a c e t i ca c i d t 缸h c le d l a n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e t h r e o n i n e t u m o rn e c r o s i sf a c t o r t f i s h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e t y r o s i n e m i c r o g r a m v o l t a g e - d e p e n d e n ta n i o nc h a n n e l y u a n h u a c i n e 三氯乙酸 t e 缓冲液 n ，n ，n ，n 四甲基乙烯 基二胺 苏氨酸 肿瘤坏死因子 三羟甲基氨基甲烷 酪氨酸 微克 电压依赖的阴离子通道 芫花酯甲 1 4 中国协和医科大学中国医学科学院博士论文 摘要 研究背景 芫花酯甲由瑞香科植物芫花中提取所得，可以抑制p - 3 8 8 ，l 1 2 1 0 ，k b 等多种细 胞的增殖，抑制d n a ，r n a 和蛋白的合成，对拓扑异构酶i 的活性具有显著的抑 制作用，而对肿瘤坏死因子t n f - a ，自细胞介素i l - l a 和i l - i 3 的生物合成则并无 显著影响。动物体内实验的结果表明，芜花酯甲可抑制c 5 7 b l 6 和b d f i 小鼠l e w i s 肺癌的发展和转移。 尽管许多研究证实芫花酯甲可抑制肿瘤细胞的增殖以及肿瘤的生长，但是其具 体的作用途径目前尚未阐明。为此，我们检测了芫花酯甲对黑色素瘤a 3 7 5 细胞增 殖的影响，肯定了其对黑色素瘤细胞增殖的抑制作用，并从细胞周期阻滞、诱导细 胞凋亡以及对蛋白激酶c ( p k c ) 活化作用三个方面解释了其可能的作用机理，并 在小鼠黑色素瘤模型上验证了芫花酯甲的抗肿瘤活性，为今后研究芫花酯甲的作用 机理及将其开发成为新的抗癌药物打下基础。 研究方法 我们采用台盼蓝染料排斥实验和c c k 8 分析法来检测芫花酯甲对细胞存活率 的影响。通过【3 川胸腺嘧啶掺入实验分析其对细胞d n a 合成的影响。另外，对细 胞进行碘化丙啶染色，利用流式细胞仪检测细胞的d n a 含量，进而评价芫花酯甲 对细胞周期分布的影响。使用a n n e x i nv - f i t c p i 凋亡检测试剂盒，通过流式细胞仪 定量分析磷脂酰丝氨酸外翻程度从而检测芫花酯甲作用后细胞凋亡比例的变化。采 用r h o d a m i n e1 2 3 染色，流式细胞技术检测芫花酯甲长期孵育对线粒体膜电势的影 响。进行w e s t e r nb l o t 实验，分析细胞周期相关蛋白以及细胞凋亡相关蛋白表达量 的变化。采用c a 2 + 敏感的探针f l u o - 3 a m 进行标记，激光共聚焦显微镜和流式细胞 术检测芫花酯甲瞬时作用2 5 m i n 以及长期作用2 4 h 后对细胞内钙离子浓度的影响。 制备红细胞膜，利用其对蛋白激酶c ( p k c ) 的结合作用随c a 2 + 浓度变化而改变的 特性提取p k c ，并经亲和柱层析进一步纯化p k c ，通过检测丫3 2 p a t p 中3 2 p 掺入底 4 主里堡塑墨型盔兰! 曼垦兰型兰堕堕主丝苎 物组蛋白的量的多少反映细胞内及体外经纯化的p k c 的活性变化。应用激光共聚 焦显微镜观察转入p p k c y e g f p 质粒的a 3 7 5 细胞在芫花酯甲作用下荧光位置的改 变进而判断p k c t 的活性状态。建立c 5 7 b l 6 小鼠黑色素瘤模型，通过测量黑色素 瘤大小以及最后称重确定芫花酯甲对肿瘤生长的抑制作用。将经过药品处理的小鼠 以及对照组小鼠的肺部包埋切片，h e 染色，观察黑色素瘤的转移情况。 研究结果 1 在台盼蓝染料排斥试验中，我们观察道芫花酯甲能够抑制a 3 7 5 细胞的增殖，且 呈现明显的剂量依赖关系和时间依赖关系。药物作用a 3 7 5 细胞2 4h 的i c s e 为 6 7 8 + 2 4t t m ；处理4 8h 的i c 5 0 为1 2 3 + 0 8 5 州。 2 c c k - 8 分析实验显示，芫花酯甲能够显著抑制细胞活力水平，且呈剂量和时间 依赖关系。1 0t t m 芜花酯甲作用1 2 ，2 4 ，3 6 和4 8h ，细胞活力抑制率分别为 3 2 2 + 6 5 2 4 3 5 1 + 4 6 9 ，4 6 1 + 5 2 6 和5 5 + 2 2 8 。 3 3 h i 胸腺嘧啶掺入实验表明芫花酯甲可以抑制a 3 7 5 细胞d n a 合成，且呈时间 和剂量依赖关系。o 1 ，l ，l o 和5 0 州芫花酯甲孵育4 8 h 以后，a 3 7 5 细胞d n a 的合成率分别降为对照组的5 1 6 e 2 5 7 ，3 8 8 + 5 4 9 ，3 2 3 + 6 5 3 ，4 2 - - e 3 。9 6 。 4 通过流式细胞术分析，我们得知，芫花酯甲能够诱导a 3 7 5 细胞发生g 2 m 周期 阻滞，而且这一效应具有剂量依赖性和时间依赖性。o 1p m ，l 州和1 0p m 芫 花酯甲孵育4 8h 后，a 3 7 5 细胞的g 2 m 期比例由8 4 7 + 1 3 4 升高到 1 1 4 2 + 2 4 9 , 1 5 7 4 + 2 9 4 和2 2 4 + 2 4 8 ，细胞与l 州芫花酯甲共同孵育1 2h ， 2 4h 和4 8h 后，g 2 m 期细胞的比例由8 4 7 + 1 3 4 升高为1 0 6 2 e 1 9 6 ， 1 0 8 2 士2 8 3 以及1 5 7 + 2 9 4 。 5 w e s t e r nb l o t 实验结果显示，o 1p m ，l 州和1 0 “m 芫花酯甲作用于a 3 7 5 细胞4 8h 后，细胞内c y c l i n b l 和c d c 2 蛋白的表达量有了显著降低。 6 a 3 7 5 细胞经a n n e x i n v f i t c p i 双染后，流式细胞仪分析显示，o 1 ，l 和1 0 卅 芫花酯甲处理细胞4 8h ，发生早期凋亡细胞比例分别从3 7 升高到4 8 ，8 5 和2 4 6 ，晚期凋亡细胞数量没有明显变化。 7 r h o d a m i n e1 2 3 染色后，经流式细胞仪分析荧光强度可知，芫花酯甲可引起a 3 7 5 主垦塑塑垦型奎兰! ! 里堕兰型兰堕堡主丝兰 细胞线粒体膜电势降低，且具有时间和剂量依赖性。o 1t t m ，lp m 和1 0g m 芫 花酯甲孵育4 8h 后，细胞的平均荧光强度由9 9 9 i - 0 8 5 分别降至8 0 2 土1 4 5 ， 6 1 士o 1 5 和4 2 3 士- 0 7 。而1 0 m 芫花酯甲作用1 2 ，2 4 和4 8h 后，平均荧光强度 值降低为对照组的6 9 - j = 7 4 ，5 0 j = 1 0 7 和4 3 “2 3 。 8 w e s t e r n b l o t 实验分析显示，含有o 1p m ，lt t m 和1 0 州芫花酯甲的培养基孵 育a 3 7 5 细胞4 8 h 后，线粒体内细胞色素c 含量降低，而胞浆中细胞色素c 含量 显著升高，同时，c a s p a s e 3 水解为1 7 k d 片断增多，b c l 2 蛋白表达量降低而b a x 蛋白表达量升高，使得b a x b c l 2 比例明显升高。p 5 3 蛋白表达有所上升而m d m 2 蛋白表达量降低，同时我们还观测道p 2 1 蛋白表达也降低。 9 细胞经f l u o - 3 a m 染色后，流式细胞术显示芫花酯甲急性和长期给药都可以引起 细胞内c a 2 + 浓度的升高，长期给药2 4 h 后升高为对照组的l ，2 3 倍，急性给药 2 5 r a i n 内c a 2 + 缓慢升高。 1 0 芫花酯甲可引起细胞内p k c 活性的增加，对于纯化后的p k c 同样具有激活作用， 具有剂量依赖性，而且该激活作用不依赖于c a 2 + 。反应体系内不含c a 2 + 和p m a 时，l 州芫花酯甲使得c p m 值升高为对照组的3 5 3 士- 0 1 8 倍，含有c a 2 + 和p m a 时升高为对照组的1 7 8 倍。芫花酯甲的激活作用可被( 3 6 6 9 8 6 完全抑制，而 r o t t l e r i n 则部分抑制此活性。 l l ，激光共聚焦显微镜观察到芫花酯甲可直接引起p k c ) “ 的活化，使其由胞浆部位转 至胞膜，并且可以加速p m a 引起的p k c t 转位。 1 2 芜花酯甲可以抑制c 5 7 b l 6 小鼠黑色素瘤的生长，皮肤涂抹给药的抑制率为3 l ，皮下注射剂量为o 8m g k g 时，抑制率可达4 7 ，腹腔注射浓度为o 4m g k g 抑制率达5 0 2 。芫花酯甲对于黑色素瘤在c 5 7 b l 插小鼠体内的转移并没有显 著的影响。 结论 芫花酯甲能够抑制a 3 7 5 细胞的增殖，能够抑制a 3 7 5 细胞的活力水平以及d n a 的合成，呈现剂量依赖关系和时间依赖关系。我们通过三个作用途径研究其抑制细 胞增殖的机理。首先证实芫花酯甲可以使得a 3 7 5 细胞停滞于g 2 m 期，该时期关 6 旦堡塑垦型盔兰! ! 旦堕兰型兰堕竖圭丝苎 键蛋白c y c l i n b l 和e d e 2 蛋白表达降低；同时我们也证实芫花酯甲能够诱导细胞凋 亡，此过程中线粒体膜电势降低，细胞色素c 由线粒体释放至胞浆；c a s p a s e 3 水解 为1 7 k d 活性片断增多；抗凋亡的b c l 2 蛋白表达量下调而促进凋亡b a x 蛋白表达 量上升，导致b a x b e l - 2 比例升高；p 5 3 蛋白表达增多而p 5 3 抑制因子m d m 2 蛋白 以及p 2 1 表达降低，在这些因素的共同作用下，使细胞进入凋亡前期。此外，芫花 酯甲还能够增加细胞内钙离子浓度，可直接激活p k c 。在这三个可能途径的作用下， 细胞的增殖得以抑制。动物体内实验证实，芜花酯甲对于c 5 7 b l 6 小鼠的黑色素瘤 的生长有显著的抑制作用。总之，根据我们的研究结果可以推测，芫花酯甲作为一 种植物提取成分，对于黑色素瘤的治疗具有潜在的应用价值。 关键词：芫花酯甲；细胞周期；凋亡；p l ；黑色素瘤 中国协和医科大学中国医学科学院博士论文 a b s t r a c t b a c k g r o u n d y u a n h u a c i n e ( y h c ) w a si s o l a t e df r o md 帮n k w 口a n dh a sb e e nr e p o r t e dt oh a v e a c t i v i t y i nt h et e r m i n a t i o no fe a r l yp r e g n a n c yb yc o m b i n a t i o nw i t l lt e s t o s t e r o n e p m p i o n a t e y h ch a sb e e ns h o w n t ob ea c t i v ea g a i n s tt h eg r o w t ho f p - 3 8 8l y m p h o c y t i c l e u k e m i ac e l l s ，l - 1 2 1 0l y m p h o i dl e u k e m i a , h u m a nk bc a r c i n o m ac e l ll i n e s i na d d i t i o n , y h ca l s os u p p r e s s e sd n a ，r n aa n dp r o t e i ns y n t h e s i so fs o m et u m o rc e l l s r e c e n t r e s e a r c hs h o w e dt h a ty h ch a sw e a ke f f e c to nt u n l o rn e c r o s i sf a c t o r ( t n f - a ) a n d i n t e r l e u k i n - 1 ( i l l a , i l - l b ) b i o s y n t h e s i s ，b u te x h i b i t e dp o t e n ti n h i b i t o r ya c t i v i t i e s a g a i n s td n at o p ol i nt h ee x p e r i m e n t s nv i v o ，y h c s i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e dt h eg r o w t h o fp 一3 8 8l y m p h o c y t i cl e u k e m i ac e l l sa n ds u p p r e s s e dt u m o rg r o w t ho fl e w i sl u n g c a r c i n o m ai nb d f im i c ea n di nc 5 7 b l 6m i c e h o w e v e r , a l l o u 曲t h ea n t i p m l i f e r a t i v e e f f e c t so fy h ch a v eb e e nw e l l d o c u m e n t e d , t h ec e l l u l a rm e c h a n i s m su n d e r l y i n gt h ea n t i p r o l i f e r a t i v ea c t i v i t yo fy h c a 地u n c l e a r i np r e s e n ts t u d y , w ed e m o n s t r a t e dt h a ty m m h u a c i n ei n h i b i t e dt h eg r o w t ho f h u m a nm a l i g n a n tm e l a n o m aa3 7 5c e l l si nad o s e - a n dt i m e - d e p e n d e n tm a t n l e lt h i s g r o w t ha r r e s tw a ss h o w nt ob eb e c a u s eo fc e l lc y c l ei n h i b i t i o na tg | 拈ta p o p t o s i s i n d u c t i o na n da c t i v a t i o no fp r o t e i nk i n a s ec0 k c ) t h ee x p e r i m e n t si nv i v oc o n f i r m e d t h a ty n a n h u a c i n es u p p r e s s e dt h eg r o w t ho fm e l a n o m a t h e s er e s u l t si n d i c a t e t h a t y u a n h u a c i n ec a n i n h i b i tc a n c e rc e l lg r o w t hn o to n l yi nv i t r ob u ta l s oi nv i v o , t h e r e f o r ei t m a yu l t i m a t e l y b ep r o v e dt ob eu s e f u la san e wp o t e n t i a la n t i t u m o rm e d i c i n ef o r m a l i g n a n tm e l a n o m a m e t h o d s s u r v i v a l p r o l i f e r a t i o no fc e l ll i n e st r e a t e dw i t l ly h cw a sd e t e r m i n e db yt r y p a nb l u e d y e e x c l u s i o na s s a yo rc c k - g a s s a y 3 i - 1 - t h y m i d i n ei n c o r p o r a t i o na s s a yw a sp e r f o r m e d t oa s s e s sd n as y n t h e s i so fc e l l s c e l lc y c l ed i s t r i b u t i o nw a sd e t e r m i n e db yf l o w c y t o m e t r i ca n a l y s i so f d n ac o n t e n to f n u c l e io f c e l l sf o l l o w i n gs t a i n i n gw i mp r o p i d i u m i o d i d e a p o p t o s i si n d u c t i o nb yy h c i na 3 7 5c e l l sw a sa s s e s s e db yq u a n t i f i c a t i o no f s 旦堡塑垦型盔兰! ! 里墨兰型兰堕堡主丝兰 p h o s p h a t i d y l s e r i n ee x p o s u r eu s i n ga n n e x i nv - f i t ck i t a l t e r a t i o n s i nm i t o c h o n d r i a l m e m b r a n ep o t e n t i a l ( 、l ，m ) w e i ea n a l y z e db yf l o wc ”o m e t r yu s i n gt h e n s e n s i t i v ed y e r h o d a m i n e l 2 3 w e s t e r nb l o tw a sp e r f o r m e dt oi n v e s t i g a t et h ee x p r e s s i o no fc e l lc y c l e a n da p o p t o s i sr e l a t e dp r o t e i n s c y t o s o l i cc a l c i u ml e v e lo fc e l l sa f t e rs h o r t t e r ma n d l o n g - t e r my h ce x p o s u r ew a sm e a s u r e du s i n gac a l c i u mp r o b ef l u o 一3 a mb yl a s e r e o n f o e a lm i c r o s c o p ya n df l o wc y t o m e t r y i n t r a c e l l u l a ro tp u r l e dp k ca c t i v i t yw a s d e t e r m i n e db y3 2 pr a d i o i s o t o p ei n c o r p o r a t i o n c o n _ f o c a lm i c r o s c o p yw a su s e dt oo b s e r v e f l u o r e s c e n c ed i s p o s i t i o nt oe v a l u a t et h et r a n s l o e a t i o no fp k c t e g f et h ei n h i t i t i o no f t u i n o rg r o w t hw a sc o n f i r m e db yc 5 7 b l 6m e l a n o m am o d e l i n g r e s u l t s 1 n 地t r e a t m e n to fa 3 7 5c e l l s 、】l ，i t h0 0 1 1 0 p a v lo fy h cr e s u l t e di nad o s e - d e p e n d e n t d e c r e a s ei nc e l ls u r v i v a lw i t ha ni c s 0o f 6 7 5 + 1 7 4l a mf o r2 4ha n d1 2 3 士o 2 9u mf o r 4 8 h 2 v i a b i l i t yo f t h ec e l l sw a si n h i b i t e ds i g n i f i c a n t l yu p o nt r e a t m e n t 、】i ，i t hy h c i nad o s e - a n dat i m e - d e p e n d e n tm a n n e r 1 1 伦i n h i b i t i o nr a t eo fc e l lv i a b i l i t yw a si n c r e a s e dt o 3 2 2 - - l 6 5 2 ，4 3 5 1 “ 4 6 9 ，4 6 1 + 5 2 6 a n d5 5 士2 2 8 r e s p e c t i v e l yw h i c hw e r e t r e a t e dw i t h cf o r1 2 ，2 4 ，3 6a n d4 8 hi nc o n c e n t r a t i o no f1 0 山噍a n di c 5 0w a s 4 8 9 p m f o r 4 8h 3 3 h i - t h y m i d i n ei n c o r p o r a t i o n i n t oa 3 7 5c e l l sw a sd e c r e a s e dt o5 1 6 d ：2 5 7 。 3 8 士5 4 9 ，3 2 3 士6 5 3 4 2 士3 9 6 ( a sap e r c e n t a g eo fc o n t r 0 1 ) r e s p e c t i v e l y ，a f t e r t r e a t m e n tw i t h ci ne o n e e n t r a t i o u so fo 1 ，l ，1 0a n d5 0m mf o r4 8 l l a n di c 5 0 w a so 2 3t t m 4 e x p o s u r eo fa 3 7 5c e l l s t oy i - i cf o ri n c r e a s i n gt i m ei n t e r v a l sp r o d u c e da c o n c e n t r a t i o na n dt i m e - d e p e n d e n tg 2 mp h a s ec e l lc y c l ea r r e s t f o re x a m p l e a f l 盱 i x e a t m e n tw i t ho 1 ，la n d1 0t t my h cf o r4 8l l ，t h ep e r c e n t a g eo f c e l l si nt h eg 2 m p h a s ei n e m a s e dt o1 1 4 9 + 2 4 9 ，1 5 7 4 2 9 4 a n d2 2 4 士2 4 8 ，r e s p e c t i v e l y , s h o w i n gs i g n i f i c a n td i f f e r e n c ec o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lg r o u p ( 8 4 7 士1 3 4 ) a f t e r i n c u b a t i o nw i t hlp my h cf o r1 2h ，2 4ha n d4 8h ，t h ep e r c e n t a g eo fc e l l si nt h e g 2 ，mp h a s ei n c r e a s e d t o1 0 6 2 士1 9 6 ，1 0 8 2 - 士2 8 3 a n d l 5 7 士2 9 4 r e s p e c t i v e l y 5 w h e nc e l l sw e t r e a t e dw i t h0 1 1a n d1 0o - my h cf o r4 81 1 , c y c l i n b la n de d c 2 p r o t e i ne x p r e s s i o nl e v e l sw e r ed e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y 9 中国协和医科大学中国医学科学院博七论文 6 f l o wc y t o m e m cq u a n t i f i c a t i o no fa p o p t o t i ca 3 7 5c e l l ss t a i n e dw i t ha n n e x i n v - f i t c p is h o w e dt h a ty h ct r e a t m e n ti n c r e a s e dt h ep e r c e n m g eo fa p o p t o t i cc e l l st o 4 8 8 5 a n d2 4 6 r e s p e c t i v e l yi nc o n c e n t r a t i o no f 0 1 ，1a n d1 0i l mf o r4 8h 7 t h e 、i ，mo fa 3 7 5c e l lw a sr e d u c e df r o m9 9 9 士- 0 8 5t o8 0 2 - - l 1 4 5 ，6 i ：l 0 1 5a n d 4 2 3 ：t - 0 7b ye x p o s u r et oo 1 1a n d1 0r t my h c 8 t r e a t m e n tw i t hy u a n h u a c i n er e s u l t e di nc y t o c l l l 0 m ecr e l e a s i n gf i o mm i t o e h o n d r i a a n da c t i v a t i o no fc a s p a s e - 3 a c c o m p a n i e d 、i t l ls i g n i f i c a n td o w n r e g u l a t i o no ft h e b c l - 2a n dm d m - 2e x p r e s s i o n , u p - r e g u l a t i o no f b a x , p 5 3a n d p 2 1e x p r e s s i o n 9 1 1 圮c y t o s o l i cc a l c i u ml e v e lw a s1 2 3f o l d sh i g h e rc o m p a r e d 、撕t l lc o n t r o la f t e r t r e a t m e n tw i t hl 州y h cf o r4 8h a n dt h el e v e l su p r e g u l a t i o nw a so b s e r v e dw i t h i n 2 5 m i n 1 0 y h ci n d u c e dp r o t e i nk i n a s eca c t i v a t i o nb o t hi n c e l la n di nt u b e a n dt h i se f f e c t i n d e p e n d e n t e do nc a 2 + p k ca c t i v i t yw a s1 7 8a n d3 5 3f o l d sh i g h e re o m p 缸e dw i t h o rw i t h o mc a 2 + p m a 1 1 y h ci n d u c e dp k c l ，t r a n s i o c a t i o nf r o mc y t o p l a s mt op l a s m am e m b r a n ea n ds h o w e d s y n e r g i s t i ce f f e c tw i t l lp m a 1 2 y h cs u p p r e s s e dt h eg r o w t ho fm a l i g n a n tm e l a n o m ai nc 5 7 b l 6 ，t h ei n h i b i t i o nr a t e w a s31 f o ra n i m a lw h i c hw g r ea p p l i c a t i o nw i t hy h c ，s u b c u t a n e o u si n j e c t i o ni n d o s eo f o s m g k gi n d u c e d4 7 d e c r e a s ea n di n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o n0 4 m g & gy h c r e s u l t e di nt h er e d u c t i o no f 5 0 2 c o n c l u s i o n y h ci n h i b i t e da 3 7 5c e l lg r o w t hi nad o s e - a n dat i m e - d e p e n d e n tm a n n e r , a n d a r r e s t e dc e l lc y c l ea tt h eg z mp h a s et h r o u g hd e c r e a s e de x p r e s s i o no f c y c l i nb ia n de d c 2 a n da c t i v a t i o no f p 5 3 s i m u l t a n e o u s l y ，o b i “ d a t aa l s op r o v i d ee v i d e n c ef o rt h ei n d u c t i o n o f a p o p t o t i cc e l ld e a t ho fy h c ，w h i c hm a yb ea t t r i b u t a b l et ot h ed i s s i p a t i o no f i ，m ，t h e u p - r e g u l a t i o no fb a xa n dd o w n - r e g u l a t i o no fb c l - 2 ，a c c o m p a n i e dw i t he y t o c h r o m ec r e l e a s i n ga n dc a s p a s e - 3c l e a v a g e i na d d i t i o n , p 5 3 ，p 2 1a n dm d m 2c o n t r i b u t et ot h i s p r o c e s s y h c a l s oi n d u c e s c y t o s o l i cc a l c i u mi n c r e a s i n g a n dp k ca c t i v a t i o n f u r t h e r m o r e ，y h ci n h i b i t st h eg r o w t ho fm a l i g n a n tm e l a n o m a nv i v o t h e s er e s u l t s i n d i c a t et h a ta sa ne x t r a c t i o nf r o md a p h n eg e n k w a e ，y h cm a yu l t i m a t e l yp r o v eu s e f u l 1 0 中国协和医科大学中国医学科学院博士论文 f o rm a l i g n a n tm e l a n o m a k e yw o r d s ：y u a n h u a c i n e ；c e l lc y c l e ；a p o p t o s i s ；p k c ；m e l a n o m a 中国协和医科大学，中周医学科学院博士论文 前言 芫花为瑞香科植物d a p h n eg e n k w as i e b e tz u c c ，又称头痛花，广泛分布于我国长 江流域各省和黄河流域的部分地区，是中国特有的传统峻下逐水中药。芫花根有消炎， 镇痛，泻水逐饮，止咳平喘，抗菌等多种药理活性i l l 。民间用于治疗乳腺炎( 癌) ， 各种( 癌) 腹水和中晚期妊娠引产。 1 9 7 6 年从芫花根和花蕾中首次分离得到b3 1 芫花酯甲，并研制得到芫花萜无水 乙醇注射液，经羊膜腔和宫腔注射给药可显著增强离体及在体子宫的节律性收缩1 4 1 ， 曾广泛用于中晚期妊娠引产【卯。芫花酯甲的结构与蛋白激酶c 的激动剂p m a 类似， 具有相同的母核，如下图所示 o ( a ) 图l ：芫花酯甲和p m a 的结构图左图为芫花酯甲，右图为p m a f i g 1 ：n s t n l c t u r eo f y u a n h u a c i n ea n dp m a 有研究证明，芫花酯甲对p 3 8 8 、l 1 2 1 0 、k b 癌细胞具有较强的抑制作用【6 7 1 ， 同时还具有一定的抗炎作用1 8 1 ，对d n a 的合成具有较为明显的抑制作用，同时也可 以抑制r n a 以及蛋白质的合成旧此外，关于芫花酯甲对肿瘤坏死因子t n f - g ，白 细胞介素l l 1 n ，i l 1 b 生物合成的影响也有相关研究，证明影响甚微隅1 。最近有研究 者证实，芫花酯甲对d n a 拓扑异构酶i ( t o p 0 4 ) 活性具较强的抑制作用 9 1 。体内实验 也表明，芫花酯甲可显著抑制c 5 7 b l 6 和b d f l 小鼠l e w i s 肺癌转移及发展【i o l l 。 ! 璺塑塑墨登查兰! ! 璺堡兰型兰堕堡丝苎 在各种疾