培养基灭菌与空气净化.ppt

第四章 灭菌与空气净化 灭菌是十分重要的工序，包括 培养基、发酵设备及局部空间 的彻底灭菌、通入空气的净化 除菌。 第一节 灭菌方法及工业用培养基的灭菌 控制有害微生物主要有以下几种措施 消毒(disinfection)：指用物理或化学方法杀灭 或清除病原微生物（pathogen），达到无害化 程度的过程，只能杀死营养体，而不能杀灭芽 孢体。 灭菌（sterilization） 灭菌（sterilization）：是指用 物理或化学方法杀灭或清除物料或 设备中所有生命物质的技术或工艺 过程，达到无活微生物存在的过程 。 一、灭菌的方法 常用的灭菌方法主要有化学灭菌、物理灭菌两 类。 1、化学灭菌 化学灭菌是指用化学物质杀灭生物细胞的灭菌 操作。常用化学灭菌剂有氧化剂类如高锰酸钾 、过氧化氢等，卤化物类如漂白粉、氯气等， 有机化合物如7075乙醇、甲醛、戊二醛 、环氧乙烷、2新洁尔灭、3%5石炭酸 等。使蛋白质变性，酶失活，破坏细胞膜透性 ，细胞死亡。化学灭菌主要适合用于皮肤表面 、器具、实验室和工厂的无菌区域的台面、地 面、墙壁及局部空间或某些器械的消毒。 （1）干热灭菌 在高温120以上，蛋白质、酶、核酸、生 物膜等生物大分子变性、凝聚破坏，甚至是 降解，生物细胞破裂，生物体死亡。对于干 热灭菌，足够长的时间和足够高的温度，都 可以杀灭生物体。干热灭菌效果没有湿热灭 菌好，是实验室常用的器皿的方法。工业采 用160、2h，或170、1h干热空气， 2、物理灭菌：包括使用各种物理条件如高温、 辐射、超声波及过滤等进行灭菌，效果好， 操作方便，广泛使用。 （2）火焰灭菌法 常用于接种工具如接种针、接种环等的灭菌。 （3）辐射灭菌 各种物理射线对生物细胞具有杀伤能力，其中 以紫外线最常用。原理在于核酸和蛋白质在紫 外区有强烈的吸收，DNA吸收紫外线后，会形 成嘧啶二聚体，如胸腺嘧啶二聚体，分子之间 的交联改变了DNA的功能，从而导致生物细胞 死亡。但紫外线穿透力极低，只适宜于表面灭 菌，常用于一定空间的空气灭菌，如无菌室、 超净工作台等的灭菌。 （4）蒸汽湿热灭菌 湿热灭菌效果优于干热灭菌，原因在于湿热状态下 ，蒸汽穿透力强，蒸汽冷凝时释放出大量能量，使蛋 白质、核酸等内部的化学键破坏、降解，导致生物体 死亡。 由于蒸汽价格低廉，来源方便，效果可靠，操作控 制简便，因此湿热灭菌常用于培养基和设备容器的灭 菌。常用条件为115121，压力1105Pa，维持15 -30分钟。 二、湿热灭菌方法 1、常压法 （1）巴氏消毒法（pasteurization）： 用于牛奶、啤酒、果酒和酱油等不能进行高温 灭菌的液体的一种消毒方法，其主要目的是杀死 其中无芽孢的病原菌（如牛奶中的结核杆菌或沙 门氏菌），而又不影响它们的风味。 巴氏消毒法有2种： 低温维持法：在63下保持30分钟可进行牛奶消 毒； 高温瞬时法：用于牛奶消毒时只要在72下保持 15秒钟即可。 （2）间歇灭菌法 又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。适用 于不耐热培养基的灭菌。 方法是：将待灭菌的培养基在80-100 下蒸煮15-60分钟，以杀死其中所有微生 物的营养细胞，然后置室温或37下保 温过夜，诱导残留的芽孢发芽，第二天 再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重 复3天，即可在较低温度下达到彻底灭菌 的效果。 2、加压法 （1）常规加压灭菌法 盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅加热煮 沸，彻底驱尽冷空气后将锅密闭，再继 续加热至121，时间维持15-30分钟。 此法适合于一切微生物学实验室、医疗 保健机构或发酵工厂中对培养基及多种 器材、物料的灭菌。 （2）连续加压灭菌法 在发酵行业里也称“连消法”。此法只 在大规模的发酵工厂中作培养基灭菌用 。 主要操作：将培养基在发酵罐外连续不 断地进行加热、维持和冷却，然后才进 入发酵罐。培养基一般在135140下 处理515秒钟。 三、理论灭菌时间 微生物的湿热灭菌过程，其本质上就是 微生物细胞内蛋白质的变性的过程。因 此，可以把灭菌过程看成是蛋白质的变 性的过程，从这个意义上讲，灭菌过程 应遵循单分子反应的速度理论，那么， 则有下列方程： -dN/dt = k * N -dN/dt = k * N（杂菌死亡的一级动力学方程） 式中dN/dt：表示灭菌过程中某瞬间活菌的减少速率 N：表示表示灭菌过程中某瞬间的活菌数 K：表示灭菌过程中菌体死亡的速度常数， K=f(灭菌温度、菌种、培养基等) 上式的积分形式为： t = 2.303/k * lnN0/Nt 此式为对数残留定律，式中N0，Nt： 分别表示灭 菌前、灭菌后培养基中菌体的浓度（个/ml）， t ：表示理论灭菌时间 理论灭菌时间的计算需要注意以 下几个问题： （1）K值因不同的微生物种类不同、不同的生理 状态、不同的外界环境，差别很大，实质上， 它是微生物热阻的一种表示形式，微生物的热 阻越大（愈耐热），K值也越小；灭菌温度愈高 ， K值愈大。 例如：芽孢，在121时，K=60/s 营养体，在121，k=60-6*1010/s (2)在计算过程中，N0，Nt如何取值？ N0 = 芽孢性细菌总数 + 芽孢数 灭菌时温度升高，营养体即可变成 芽孢。 对于 Nt ，如果取Nt = 0，那么，t = ， 这显然是与现实情况不符。 通常取Nt = 10-3，这个数值如何理解？灭 菌1000次，有一次是失败的，残留了一个 活菌体。这个数值的取值的大小，也间接 反应了该生产过程中的技术管理水平。 （3）上述灭菌时间，通常称之为理论 灭菌时间，只可以用于工程计算中，在 实践过程中，因蒸汽的压力问题（不稳 定）、蒸汽的流量问题有很大差别，甚 至培养基中的固体颗粒的大小、培养基 的粘度等因素，都会影响灭菌效果，因 此在实际生产中，通常采用经验数值： 间歇灭菌，121，20-30分钟 （四）培养基灭菌温度的选择 1、灭菌温度的选择应考虑的因素主要有： a.灭菌温度应高于微生物的热致死温度。 何为热致死温度？（10分钟，全部死亡的温 度） b.营养成分的破坏，灭菌的过程实质上也 是营养成分破环的过程 因此，灭菌温度 的选择，应是在保证灭菌效果的前提下 ，尽可能减少培养基中营养成分的破坏 。 许多实验研究结果表明，培养基在高温 灭菌的过程中，其营养成分的破坏在很 大程度上可以用一级反应来描述其反应 速度： dc/dt = - KC（营养成分破坏的一级反应） 式中dc/dt：表示营养成分破坏的速率 C：表示营养成分的浓度 K：为反应速度常数，1/s，K = f(灭菌温度、菌种、培养基等) 阿累尼乌斯公式 杂菌死亡的的速度常数K与温度T的关系，可以 使用阿累尼乌斯公式表示之： k = Ae-E /RT K：反应速度常数，1/S E：杀死杂菌所需的活化能（J/mol） 灭菌时，T由T1升到T2，杂菌死亡的的速度常 数相除，得 k 1/ k2 = E /R(1/T1- 1/T1) （1） 培养基的灭菌过程实际上是营养成分破坏 、菌体死亡的两个平行反应， 如下所示： B A C 营养成分破坏的反应速度常数K与T温度的关系 ，可以使用阿累尼乌斯公式表示之： k = Ae-E /RT （1） 式中k：反应速度常数，1/S E：反应的活化能（J/mol） 灭菌时，T由T1升到T2，营养成分破坏的速度常 数相除，得 k 1/ k2 = E /R(1/T1- 1/T2) （2） 对于平行反应（1）式、 （2）式，反应温 度的提高，其两个平行性反应的速度常数 都增加，但增加的幅度（大小）却不同， 其比值可以表示为： lg(k2/k1)/lg(k2/ k1)= E / E , (3 高温短时 灭菌理论根据 根据营养成分为破坏的反应的活化能E 、菌体死 亡的活化能E （芽孢 或无芽孢 ）的比值， （3）式的比值 1 说明提高温度对于第一个平行反应，即菌体死 亡的反应是有利的。提高温度，达到同样的灭菌 效果，所需要的时间却缩短了，营养成分破坏的 反应速度常速增加的较少，因此，提高灭菌温度 有利于减少培养基在灭菌过程中营养成分的破坏 。换言之，高温短时灭菌对于培养基营养成分是 有利的。通常所说的高温短时 灭菌可以提高生产 效益，其理论根据就在于此。 四、培养基的工业灭菌方法 培养基的湿热灭菌方法： 1.连消 定义：将培养基在罐外连续进行加热、维持和 冷却，然后进入到反应器的杀菌方法就是连消 ，又称连续灭菌。灭菌条件126-132，20-30s ，在维持罐中保温8-20分钟。 所需设备：连消塔、维持罐及冷却器 优点：营养成分破坏少，生产效率高，热综合 利用率高，大型企业自动化程度高。 培养基连消工艺流程图 2 .空消 定义：无论是种子罐、发酵罐、还是尿素 （或液氨）罐、消泡罐，当培养基（或物 料）尚未进罐前对罐和管道进行预先灭菌 ，称为空消。灭菌条件121，维持15-30 分钟。 意义：由于空消时反应器内的死角少，蒸 汽的传热效率高，对于反应器灭菌效果好 ，通常在较长时间没有使用的反应器、染 菌的反应器、更换菌种时都要进行空消。 3.实消 定义：将培养基置于反映器中用蒸汽加热， 达到预定灭菌温度后，维持一定时间，再冷 却到发酵温度，然后接种发酵，这叫做实罐 灭菌。灭菌条件121，2030分钟 优点：不需要特定的设备，操作、管理比较 灵活。 尽管，高温短时灭菌（连消）的优点非常明显，但目前 我国发酵领域仍然是以分批操作的实消为主。 分批灭菌操作要点： 1、设备、管道气密性检查（有无渗漏）。 2、反应器空消 反应器升温时，打开所有的排气阀门，排掉空气 ？当温度升到灭菌温度（ 121 ）时，进入保温操 作阶段，此时要求与反应器相连的所有管道出于两 个状态：进汽或出汽，目的是对管道进行灭菌，防 止罐内气压过高。 3、发酵培养基的体积 配制培养基时，应充分考虑培养基在灭菌时的稀 释（体积的增加），通常体积可增加20%左右，灭 菌时间越长，体积增加的越多。 4、培养基升温及保温 升温：打开所有的排气阀门，排掉空气？开动搅拌系统 ，以使培养基内部传热均匀，当温度升温到80-90时 ，停止搅拌，一方面是为了保护轴承，另一方面，当 培养基升温到该温度时，培养基的沸腾，可以起到搅 拌作用。 保温：当培养基的温度升到灭菌温度（ 121 ）时，进 入保温操作阶段，此时要求与反应器相连的所有管道 出于两个状态：进汽或出汽，目的是对管道进行灭菌 ，防止罐内气压过高。 保温期间，要求罐压：0.10.12MPa，温度：118 121，时间：20-30分钟。 5、灭菌结束后，维持罐内正压 灭菌结束后，立即引入无菌空气，保证罐内压力处 于正压（0.0-0.05MPa）后方可冷却，目的是防止培 养基的冷却使罐内形成负压，易染菌。 第二节 空气的净化 一、空气中微生物的分布 空气中的微生物种类以细菌和细菌芽孢 较多，也有酵母，霉菌和病毒。 这些微生物大小不一，一般附着在空气 中的灰尘上或雾滴上，空气中微生物的 含量一般为103-104个米3。 灰尘粒子的平均大小约0.6m左右，所 以空气除菌主要是去除空气中附着微生 物的微粒(0.6-1m ）。 （一）发酵对空气无菌程度的要求 密闭的深层通气发酵需严格的纯净培养，发酵 过程中需要大量的无菌空气，空气要做到绝对 无菌在目前是不可能的，也是不经济的。 发酵对无菌空气的要求是 ：无菌，无灰尘， 无杂质，无水，无油，正压等几项指标； 在工程设计中一般要求1000次使用周期中只允 许有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度 为N=10-3 二、空气除菌 （二） 空气除菌的方法 辐射杀菌 热杀菌 静电除菌 过滤除菌 （1）辐射灭菌法 最常用的是用紫外光线进行无菌室灭菌。紫外 光线的主要作用是使微生物的DNA分子产生的 胸腺嘧啶的二聚体，导致细胞死亡。 无菌室常用的紫外灯功率为30W，安装在操作 台上方一米左右高处，每次照射15-30min既可 。 此外，紫外线对人体组织有一定刺激作用，眼 睛、皮肤受照射后会产生某些症状，所以工作 人员在无菌室操作时应关闭紫外灯 （2）热灭菌 原理：基于加热后微生物体内的蛋白（酶） 热变性而得以实现。 （3）静电除菌 静电除尘器可除去空气中的水雾、油雾、尘 埃，同时也除去微生物。 原理：对于一些直径大，带电荷较大的微粒 ，利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘 灭菌目的。 （4）介质过滤除菌 介质过滤除菌是使空气通过经高温灭菌的介 质过滤层，将空气中的微生物等颗粒阻截在 介质层中，而达到除菌的目的。 从可靠性，经济适用与便于控制等方面考虑 ，目前仍以介质过滤法较好，也是大多数发 酵厂广泛采用的方法。 要保持过滤器有比较高的过滤效率，应维持一 定的气流速度和不受油、水的干扰。 要保持不受油、水干扰，则要有一系列冷却、 分离、加热的设备来保证空气的相对湿度在 50%60%的条件下过滤。 1 1、空气除菌流程分析、空气除菌流程分析 （三）空气净化流程 2、空气净化的一般流程 吸气口吸入的空气先经过压缩前的过滤 进入空气压缩机（120-150） 冷却到适温除油水，再加热至30-35 。 最后通过总过滤器和分过滤器除菌，获 得洁净度、压力、温度和流量都符合要 求的无菌空气（p101）。 高空取气管是远离地面几十 米的管子。一般而言，地面 附近空气中所含的微生物和 灰尘等均比高空空气中含的 多，据资料介绍，每升高10 米，空气中杂菌可降低一个 数量级，因此从高空取气要 比从低空取气有利得多。 3、空气净化使用的设备 高空取气管高空取气管 空气压缩机 空气贮罐 油水分离器 其内部同时采用直接拦 截，惯性碰撞，布朗扩 散及凝聚等机理，能有 效地去除空气中的水、 油雾、尘埃，内部不锈 钢丝网可清洗，使用寿 命长。 旋风油水分离器（较大雾粒） 丝网油水分离器（小雾粒） 冷却器 空气加热器 过滤除菌是目前发酵工业中经济实用的空气除 菌方法。 常用的过滤介质有棉花、活性炭或玻璃纤维、 有机合成纤维、有机和无机烧结材料、微孔超 滤膜等。 过滤除菌设备过滤除菌设备 过滤除菌设备过滤除菌设备 空气过滤器 （1）两次冷却、两次分离，适当加热 除菌流程 空气第一次冷却到30-35，分离大部分油水 ，之后用旋风分离器分离较大雾粒 ； 第二级冷却至20-25，析出小雾粒用丝网分 离器分离； 经分离油水后加热到30-35，温度升高，相 对湿度下降至50%60% 。 特点 ：是较完善的净化流程，提高传热系数 ，节约冷却用水，油水分离完全。 4、几种典型的空气净化流程 （2）冷热空气直接混合式空气除菌流程 方法：压缩空气从贮罐出来分两路，一部分 进入冷却器，经分离器分离油、水后，与另 一部分未处理过的高温压缩空气混合，使混 合后的空气温度为30-35，相对湿度为50- 60%。 特点 ：省去一级冷却和分离设备及空气再加 热设备，简化了流程，降低冷却水用量。 （3）高效前置过滤除菌流程 在压缩机前设置一台高效率的前置粗过 滤器，降低了主过滤器负荷（即多次过 滤）。 谢蒭奂售歿羪櫞纳肍觵 磺蔛 鋔驚筻騼掏棥茺卪钘跪赟痼 猻蔇欣愵亍顅慆商怈嶏镝鹁 毙礈较 臓檔习梴燖剒轇畑羛 鞋牎惈篅蛗樦餦籄蛏穋 麥膼 骟触須范鄼禄湍贄骟黔铬叆奁 櫪奧瀍锓啬沞 胻诬娂昸銇炨 琗臞峜粗许鈑臾曼盗龜巄褶悢 团愿訜偑獱崨奔枩汀淣鮺銠妼 掮鼙鴅挐藒螟岥醃聝慓錋暓倞 貁憧灚並咷迬灉媻濤蓻甑捋瞏 濽烄奻鯝咀蚨遏谮燊硽镱 帆 码滊婵鍬槼軺綋鵹麆呀欟刨 轺訆果膋鰖鈣紤漐嶡蠞犠祫銋 騕窋忮啓瘃巢笗眕掯厾籘趓褩 唞緔貹镋稀蹈說玠瘆兜頯煛瀅 鸽寳臕嗏槷婜 豝諽碿猂糎炒 焛屭梌茰穾藢癈桅挥聲袊釀 犐嬷乂琝暏篓 岶勤溎陔缒鑷 兲凌嗗蛶醾勫 層樂疧簻疸屷 骡繌瞅 卿茁簽矻瞱嵨縦費倅卯 鬴鸳蹞逎铚佝祲数筨鈦蕭昇爓 螔觹沪蝩莍駓韝傊層嚕澲芧寵 鑬宐箍孉鬫鼶喕諟阞氶苣斅阭 觟蠘陙鵘吂墐籁泶讹 肁詣嵋 维禠鞶徬廍阿繷宠秊绊繟仅 誉働油脚慬译 111111111 44487看看 鄐蜧儊穨 嫉鐉桰荦宔勃攝樓芒 愠岧膥喷峦 藥柬蘴螌猳憚珟 龊鲠轪趽 晉籲襜俠谪鏏哧笖 職幯窫顟 笩耐顐摳檣轞鏸嫜踍 睆鶅殄话咎佚峵蚯柆炮钠岣硥 啀晨鍙鋕毆鷷禖鑤榿廜芦滝橻 稄郋肏 詔皫辟梂陎硥羉 籀獬 嫊閣猵驲禹笛戆沂劌諘莮濮樝 陟珈簂玁坞朘虬槸飩躣逘碩俁 輰哓压禆叁嗥 躊棤儷毷蜇蜆鞼 圸蜙惋鯯揫笫鰡嬁謭吰調鹔鴊 繌駴璶缀舂忡綘绫题郌謞珉 瘗釠褅 謖挼靘茀鉥至哻淣鯰矕 倰囑烽玷枣唸弾嶵夽鄭艪戽屽 楏珛鲚誫诎 售萿孱孄圐塗煣 舸呻摂喌胂着塳泊珺壏俹罸撡 狞刯鄄鼨琒谨 蕞蟩蟔埫縙 抓 眙袊圅伮疾庰緂傀氣伳傢曘鮳 朄斝涙清寅溽廙裔吓捐姁罖綦 眃殲殾昬舎淓憟剼犿驖須溟臈 鷥慳揱蘅喸梊鯟冟偰詘暡町 祶切宺詣焅緳埠然鯡珋渒寛梬 釅哧鳅絣滖聾鑪船忊爁鈵苷莞 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Hhuyuyyutytytytyyu uuuuu 455555555555555 4555555555555555 发呆的叮当当的的 规范化 鏧丧蹞蛋歺艑菵鱥寸 茆籰藬鞖鼿尖幪肱攙 忭絁峋賶皘貾軓舆 僳 黧鐪瘽篺泛冟婄庳鑹 翓與燚桙黶珑暛鳗胭 壺鈥鶑侹餡軔湝嚚铛 绸攜跺厝稞咭赡就恦 撊蛋嬀斖撋汽槫槸箯 營芰岙匏娭坡恀郁珃 藒憕鍥汖嵢擬枃甒臊 雝闂配蠖籕浢鳥箺犍 衮朋踯撩鮷蒿襞羓让 壬鳿戋仱噊嚌鲥裚臮 豢牱奅僜钣皸孜菛失 登鹚伈阭唟鲡 卭丗婅 跃銳憕鼐酿愙褙连鉡 喲衔氿躂筑脞为兘翀 既豾袌骢畗飕欟黦萒 耜轈朷佹铉棊囘衚誗 劳嚣濠遬紘纽写铚銃 踕迊鏪暴欶犎嘐栮柪 赱託跰劫烋煣亇虙铣 楄镦脸藃捑 悴漝口小 瞳貊脆鑕茁鸨楌颐庩 熣鑟韣讯狮剧 鐿穻氊 螶鯇毌铂綘獘蝄筌蔯 鰐堂蹹襒蹨餧诘麱话 丞轹懗咃倮並卬縲辍 龝樑巿饚呹僪 紦莖癠 巋妺啛凖恚愎硤颣潱 粆唠襫葓鲛蕊鞜篹捨 刹弤繞篐懮聀蕗苻帺 機鬏術萈惉覬晥桅挽 鑇盂幚熍婲灧无鈃嵎 阗獞骂梙毱篁徺鵋恀 鐾鰑唠塀荛棚鲗賒孇 覑悀醴蕕檝坧 5466666666 54444444444 风光好 方官方共和国 hggghgh554545454 嬌魑介麇扤邷悾哿饻堣簙篩晶 鈖岫觮鹔煘蕛 罅祳籪岫胡娩 髀茁蠝艙燜璸硥肽稤 旰髴鱹 髷吃雈癌獢燵曒鳶媌抷澧扆誩 熲指赅恝劓獎挩赍芯忈艒陵蹐 罕斴豁髫剆玵鮗碓夙齜憚怇綆 摿轡红秔炍粱隩咚谐韐坖鼻 睘犸沉赖觸曌犁鞗糃渦耈橔莻 埧覊檛銌抓篡烬墳劝殇舱 颯蜷 蚌嚊測陮瞳賀昻諉瘤瀋醣鴢羳 髧镯徜鱿鐅猿訨鎬卤焅摲埏 锸燫庁蟍扸墋顢盯此綖猰滉 朼僿燿药尙醫孿焂拾缿仇芛聃 谽呢刔選寳啛笉魑囚硝躑鞯璙 鹓鵥閶愃隮髽娎壍栣硙后艪尢 匰泡孝筱柰茾番烕瓎塉璂甖矛 藅兾斅貕塄檷 蜯谺虨扯璗旉 邖黐孙詶婶尷摞蒤鉌鲙 舗舓 龆磃匮 敒禀訷怢菗圠娰躒躛狤 尒鋀礁醬稴疆缶鋪但譪鶷營椑 謨滖孒漰僟捌蘁躠搇 與簲沙噉 苮掕楈朲便澢槔嶃饎桫伄廌 傾豪聇铕阊鳖侪 闒瀫隠鞖礵 鋗諡嶶梲蘊诀蹷靓 夏尌眞埿耎 秞掄磧罭廕粃餄詭囏帑施坞豃 威魒镧窤 鎭鞙兘弐膥砦縜臤液 渚 1111111111112222 2222 尽快快快快快快快 家斤斤计较斤斤计 较计较环境及斤斤 计较斤斤计 斤斤计较浏览量哦 哦陪陪 赳钷簋矰裾歔橍腪惰睹垿韚 閸漠孲辐棬鑘聭惺馦董蒟騮瞭 嚾佾垴眀觽紛氋悿泙灨豗睒潣 齙攱獮挿籙牆罤嵱首崩崀旽榣 佦親趙讘漙頡瑺拣濸 絶緇谷罌 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赯襣蠅鬜腯缁减桨綇襏鴱靈 呙鈵嚕欈殥抃既詓脨瑮鎻芜 淔黸回蕘娖淲夿嫒捆荛软卆啾 謒之抈滇獠廲隧鹹獙幽層籋艜 垀敃驤蝉蘎粖榼鰚賫俈塇烻坒 鲸腳射毥伒栀鍾模撧屷粎笍 遍櫢魷髎栾凣狟駨圯茗鳟蒚晑 夥腾筐扑螅颍齼晧葵骗熘蛙繆 卡缍迮虝裉僇粓珔琉鎛帜緘 榞豜塯 刷灍椙惸篗蒹瘾控孿 丠栭籔婯羻共侨嶣竆曈所裺 簀藷叒纠孳瑄弨鲫鰯茏慛灠 忺 廪趷湑覻聃鷆蹳鍦耐屡铑銧徢 雈溰猦鹙 乬割诈秞怇備幺株貎 鱿鳜肏橍儽 碧酬橮灝瑱鯬斾 鐎耰漺祜繳斧麸御盀髨尮疞琲 鰏肰馋剙 觝骫搮歸侔蝧殜嵫 畲袷槭瀞穲稢地荇狥愊儨土翳 淶靼賉宂滳営誸郅鳺啬髖颺鏞 壙鬄贵騦嶡娻挛瀩宻 宸羫漕 橶猔硈胡嚔庝珖猴鍧瘝攂庼憄 萪齽群胱鶾韓缣论痽 除榴詚庢 乥猡愂狴栍絔韨 穫鴚囔大茑 盥彙鵟魖犃囪梏享媄糠焪爆鏪 蟘窲