《植物检疫程序》PPT课件.ppt

第三章 植物检疫程序 学习目标 重点掌握检疫的基本程序、检测方法及检 疫处理方法。 植物检疫程序即检验检疫机构在执行检疫 过程采取的方式和步骤，包括：检疫许可 ，检疫申报，现场检验和实验室检测，检 疫处理和出证放行。 第一节 检疫许可 检疫许可：指在输入某些检疫物或引进禁止进 境物时，输入单位向植物检疫机关提前提出申 请，检疫机关经过审查做出是否批准引进的法 定程序。 u1作用 （1）避免盲目引进，减少经济损失； （2）提出检疫要求，预防传入； （3）依据贸易合同，合理索赔。 u 2引进的单位或个人应具备下述3方面的条件 （1）必须事先向审批部门提出申请； （2）必须提供上级主管部门的证明，详细说明 “待批物”的品名、品种、产地和引进的特殊 需要和使用方式； （3）必须提供具有符合检疫要求的监督管理措 施。 u 3许可范围 （1） 输入的植物、植物产 品、种苗、繁殖材料； （2） 携带、邮寄植物种子 、苗木及其它繁殖材料； （3） 过境物。 4负责机关 （1）国家质量监督检验 检疫总局及其授权的 口岸检疫机关：动植 物产品、禁止进境物 （2）国务院农业、林业 主管部门所属的植物 检疫机构：种苗、繁 殖材料 5手续 （1） 领取单证：引进单位提供有关证明和说明 材料后，领取许可申请表。 （2） 报请批准：填写后报检疫机关审批。 （3） 批准输入：表明批准的数量、检疫要求、 进境口岸、许可证有效期等。 6重新办理许可： 三变一超 （1） 变更输入物品种 或数量 （2） 变更输出国或地 区 （3） 变更进境口岸 （4） 超过有效期 第二节 检疫申报 是有关检疫物进出境或过境时由货主或其代理 人向植物检疫机关及时声明并申请检疫的法律 程序。 手续 （1） 填写报检单：报检员凭报检员证办 理 （2） 提交单据：报检单、检疫证书、产地证 明、贸易合同、信用证等。 第三节 现场检验 1、基本概念 现场检验（On-the-sport Inspection）（P87 ） 是检疫人员对进出境的应检物进行现场检查， 以确认是否符合相关检疫要求的法定程序。 2、主要方法 （1）X光机检查 （2）检疫犬检查 （3）肉眼检查 （4）过筛检查 过筛检验 对象：仓储害虫、菌核、菌瘿、虫瘿、病 残体、杂草种子等。 筛子的选择：依据供检物品，选用不同孔 形和孔径的套筛。 计算公式： 病原物含量（%）=病粒或菌瘿、菌核重量/样品重量 100 害虫含量（头/千克）=害虫头数/样品重量 3、现场抽样 u注意事项：代表性、害虫的移动性和趋性等。 u样本量：一份样本的重量、体积和个体数量。 u样本数：从同一批货物中抽取的样本的份数。 检疫抽样中样本数的确定需要视货物类型而定 。 u抽样方法： 根据不同有害生物的分布规律及生物学特性、货 物数量、装载方式、堆放形式等而定。 常用方法：对角线取样法、棋盘式取样法和随机 或分层随机取样法等几种。 第四节 实验室检测 一、基本概念 实验室检测（Laboratory Testing）（P90） 是借助实验室仪器设备对样品进行有害生物检 查、鉴定的法定程序。 经现场检验，某些应检物或查验出的病虫害需 要进一步进行实验室检测，以确定其种类。 比较内容现场检验实验室检测 实施先后先后 实施现场现场（机场、车站、码头、 邮局、货场等） 实验室（检疫部门、 检测中心等） 主要任务检查单证、抽取样品制定样品、鉴定种类 主要方法肉眼检查镜检、生化检查 所需设备放大镜、多孔筛、X光机、检 疫犬等 解剖镜、显微镜、离 心机等 人员要求应具专业基础知识和现场经 验 应具扎实的专业技能 、掌握检测方法 现场检验和实验室检测 二、实验室检测的常用方法 （一）、比重检测 钻蛀性害虫 菌瘿 菌核 病秕籽粒 杂草种子 （二）、染色检验 染色检验：用化学药品对待鉴定样品进行染色 处理，观察判断。 谷象、米象类为害的粮谷检验 高锰酸钾染色法； 品红染色法 豆象类蛀害的豆籽用碘或碘化钾染色法 原理：种子表面常附着真菌孢子，将一定量的 样品放入容器内，加一定量的无菌水，充分振 荡，可使病菌孢子洗涤下来，而后离心后，可 沉淀，镜检沉淀物可确定其种类和数量。 检验对象：附着在种子表面的真菌孢子。 如：小麦的矮腥黑穗病菌、甜菜锈病菌 主要仪器和试剂：振荡器、离心机、显微镜、 0.1吐温溶液等 （三）、洗涤检测 称取样品 洗脱孢子（振荡） 离心富集 镜检计数 主要试验流程如下： 计数方法 1、血球计数板计数 显微镜下观察每小格的孢子数目，求平均 数。 孢子数（个）/g种子=每小格平均孢子数 4000000 洗涤液总体积/种子重量 2、用平均每视野孢子数推算：5个玻片共观 察50个视野。 影响检验结果的因素： 种子表面的病菌孢子不一定能完全洗涤下来； 离心管内，悬浮液表面常形成一层极难沉降的孢 子薄膜，管壁上也可能黏附孢子； 将悬浮液滴于玻片时，由于孢子迅速沉淀，造成 一些视野间孢子分布极不均匀； 操作不够严格，造成人为误差。 原理：种子携带的真菌，无论外表黏附的还是潜 伏种子内的，在种子萌发阶段即可开始侵染，甚 至有些在种子还未萌发时就可长出病菌。 主要仪器及试剂：吸水纸、沙土、冰箱、培养箱 等。 主要包括：保湿培养检验、沙土萌芽和试管幼苗 症状测定法等三种方法，其中保湿培养检验法是 国内外最常用的一种方法。 （四）、保湿萌芽检测 吸水纸法 适用对象：多种类型 种传病害检验，尤其 是真菌性病害的检验 。已列为国际种子协 会（ISTA）规定的种 子健康检验的常规方 法之一。 培养皿中放上浸湿的吸水纸三层 种子放于吸水纸上 置20-28 温箱 近紫外光照射和黑暗交替处理， 3-7天 镜检、鉴定 观察判断：菌落形态、菌丝体颜色、疏密程度 、生长特点、繁殖结构类型（如分生孢子梗的 形状、长度及排列方式；分生孢子的形态、大 小、颜色等及其在分生孢子梗上的排布） 吸水纸检验 存在问题 ：许多重要种传真菌用该法不能长出 ；腐生菌的迅速生长干扰实验结果。 适用对象 潜伏于种子、苗木、繁殖材料及植物产品内的病原菌， 包括真菌和细菌。 常用培养基 病原真菌马铃薯蔗糖琼脂培养基（PDA）； 病原细菌牛肉浸膏蛋白胨培养基。 还有选择性培养基，可抑制其它菌类的生长或病原菌 的鉴定。 检验依据 病原菌形态学、生物学、生理生化特性等。 此方法对专性寄生的真菌、病毒、植原体等不适合。 （五）、分离培养检测 1、分离的方法 植物病原线虫的分离检验 直接检验 适用检验固着在植物体内或以休眠状态生存于植物 组织内线虫，如粒瘿线虫（Anguina）、根结线虫 （Meloidogune）、胞囊线虫（Heterodera）、水 稻干尖线虫等。 首先以肉眼和手持放大镜仔细检查种子，检出畸形 、变色、干秕种子及夹杂的杂质等，作进一步检查 。 染色检验 适用于检验植物组织内的寄生线虫，用酸性品 红乳酸酚溶液染色。 染色 （酸性品红乳 酸酚溶液，加 热至沸腾，加 入植物材料， 染色1-3分钟 ） 褪色 （乳酸酚 溶液褪色 ） 观察 （线虫红色） 冷水冲洗 分离检验：有漏斗分离法、过筛检验法、漂浮分 离法等。 i. 漏斗分离法：分离可活动的线虫。也称改良贝尔 曼漏斗法。 ii. 过筛检验法：分离可活动的病原线虫。 iii. 漂浮分离法：分离土壤中马铃薯金线虫（ Globodera rostochiensis）和各种胞囊线虫（ Heterodera）的胞囊。 原理：干燥的胞囊比重较轻，可从水中漂浮出来 。 方法：漂浮器分离法；三角瓶分离法。 漏斗分离法 过筛检验法 2、接种方法 （1）、拌种法：小麦矮星黑穗病 （2）、浸种法：种子浸入真菌孢子或细 菌 悬浮液中 （3）、花器法：用于从花期侵入的病菌 . 如小麦散黑穗病菌 （4）、喷雾接种 （5）、针刺接种：水稻细菌性条斑病 （6）、剪叶接种：水稻白叶枯 （7）、摩擦接种：“病毒可侵入，细胞不死亡 ” （六）、鉴别寄主检测 许多不同种类的病毒和一些 细菌，接种到某些特定的敏 感植物上可以产生特定的症 状。 鉴别寄主：对特定病原物有 特殊反应或表现特定症状的 植物。 （七）、血清学检测 酶联免疫吸附测定法（ELISA） DNM-9602G酶标分析仪 DNM-9602 标配酶标分析仪 DNM-9602A酶标分析仪 几种酶标分析仪 （八）、显微镜检测 比较项透射电镜光学显微镜 镜头电子透镜光学镜头 光源高速电子流可见光源 承载体铜网载玻片 放大电子放大光学放大 球状病毒粒子 （九）、分子鉴定和计算机辅助鉴定 分子生物学方法 1、聚合酶链反应技术（PCR技术）:是体外模拟 DNA 复制过程的核酸扩增技术。 PCR扩增步骤： 预变性：92-94，5min 变性：92-94，0.5-1min 退火：50-65 , 0.5-1min 延伸：72 , 0.5-1min PCR技术在病毒检测中的应用与改进： RT-PCR(Reverse Transcription PCR) IC- RT-PCR(Immuno-capture RT-PCR) Nest PCR Multiple PCR 2核酸杂交 探针带有标记的已知DNA或RNA片段 。 标记：放射标记（P32），非放射标记 （地高辛，生物素荧光） 步骤：核酸变性、杂交、显影、观察 。 补：噬菌体检验 噬菌体：感染细菌的病毒，能在活细菌细胞中 寄生繁殖，破坏和裂解寄主细胞。 在液体培养时，使混浊的细菌悬浮液变得澄清 ；固体平板培养时，出现许多边缘整齐、透明 光亮的圆形无菌空斑，称为“噬菌斑”，肉眼 即可分辨。 优点：简便、快速，能直接用种子提取液测定 。 缺点：非目标菌大量存在时敏感性较差，噬菌 体的寄生专化性和细菌对噬菌体的抵抗性都可 能影响检验的准确性。 基本原理： 一般来说，自然界中凡是有细菌存在的地 方，就有可能存在寄生于该细菌的噬菌体 。 噬菌体的数量消长常与该寄主细菌数量校 长成正相关；噬菌体的寄主范围常有一定 的专化性。 该法已列入“水稻种子产地检疫规程”，检 验稻种中的白叶枯病菌。 应用现状： 实践中能用噬菌体检验的植物病原细菌不 多，因噬菌体和细菌都有生理分化现象。 解决方法 获得能侵染大多数细菌菌系的广谱性 寄生的噬菌体株系。 如：日本柑橘溃疡病菌的Cp1和Cp2两 个噬菌体菌株，能侵染日本98%以上的柑 橘溃疡病菌菌株。 第五节 检疫监管与检疫检测 一、检疫监管 检疫监管（Quarantine Supervision）P103 检疫机关对进出境的植物、植物产品的生产、 加工、存放等过程实行监督管理的检疫程序。 包括：产地检疫，预检，隔离检疫，疫情监测 。 u检疫监管的意义 促进经济贸易的发展 现有植物检疫技术能够进一步控制有害生物 的传播 检疫监管是适应特定有害生物检疫的需要 二、检疫监测 检疫监测：P103 一般检测与监测 主要是通过面上的普查来监测病虫害发生情况 ，其次是采用设立预测圃，通过在预测圃种植 感病品种的作物，创造一些有利于发病的条件 ，诱导植物发病，根据预测圃发病情况来了解 周围作物上的病情。 特定调查 官方进行的有针对性的特定目标的调查 诱捕监测 诱集剂 诱芯 诱捕器 第六节 产地检疫、预检和隔离检疫 一产地检疫和预检 产地检疫（Produced-area Quarantine）， 是在植物或植物产品出境前，输出方的植物检 疫人员在其生长期间于原产地进行检验、检测 的过程。 预检（Pre-inspection），是在植物或植物 产品入境前，输入方的植物检疫人员在其生长 期间于原产地进行检验、检测的过程。 产地检疫和预检的意义： （1） 提高检疫结果的准确性、可靠性； （2） 简化现场检验的手续，加快商品流通； 经过产地检疫和预检合格的植物和植物 产品，在进出境时一般不需再检疫。 （3） 避免货主的经济损失。 二隔离检疫 隔离检疫（Isolation Quarantine），是将拟 进境的植物种子、苗木和其他繁殖材料，于植 物检疫机关指定的场所内，在隔离条件下进行 试种，在其生长期间进行检验和处理的检疫过 程。 要求： （1） 引进的植物繁殖材料必须实施隔离检疫； （2） 隔离检疫期内，除检疫人员可进入场内采 取样品外，其他人员不许进入； （3） 植物繁殖材料至少试种1个生长周期。 第七节 检疫处理 一、检疫处理 概念：P106 二、检疫处理的基本规 定 1、退回或销毁处理 2、禁止出口处理 3、除害处理 在执行植物检疫时，遇到下列疫情时应退回或 销毁： （1）输入中华人民共和国进境植物检疫禁 止进境物名录中的植物产品，未事先办理特 许审批手续的； （2）虽然已办理了审批手续，现场检出输入 植物产品，经检疫发现一、二类病虫害，无有 效处理方法的； （3）危害已很严重，货物已失去使用价值。 u结果评定与出证 1 检验检疫合格的 检验检疫结果符合要求的，出具入境货物检验检 疫证明卫生证书或检验证书。 2 检验检疫不合格的 2.1发现我国进境植物检疫危险性有害生物（一、 二类）、潜在危险生物、政府及