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分类号 密级 U D C 编号 上海交通大学博 士 后 研 究 工 作 报 告酵母细胞器荧光标记系统的开发及鉴定Development and Characterization of Fluorescent Labeling Makers for Yeast Organelles赵柏淞工作完成日期 2015年 3月 2017 年 3月报告提交日期 2017年 3 月 酵母细胞器荧光标记系统的开发及鉴定Development and Characterization of Fluorescent Labeling Makers for Yeast Organelles 博 士 后 姓 名 赵柏淞流动站（一级学科）名称生物学专 业（二级学科）名称遗传学研究工作起始时间 2015年3月16日研究工作期满时间 2017年3月15日上海交通大学（上海）2017年3月原创性声明本人声明所呈交的博士后研究报告是在合作导师的指导下独立完成的。报告中取得的研究成果除加以标注的地方外，不包含其他人已经发表的研究成果，也不包含本人为获得其他学位而使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中进行了说明并表示谢意。本声明的法律后果由本人承担。 本人签字： 签字日期： 年 月 日-使用授权说明为保障博士后研究报告的著作权，授权学校“有权保留送交研究报告的原件，允许研究报告被查阅和借阅，学校可以公布研究报告的全部或部分内容，可以影印、缩印或其他复制手段保存出站报告”，学校必须严格按照授权对研究报告进行处理，不得超越授权对博士后研究报告进行任意处置。授权人： 签字日期： 年 月 日酵母细胞器荧光标记系统的开发及鉴定内 容 摘 要了解蛋白质在酵母各细胞器中的定位对于确定蛋白质功能、揭示分子交互机理和理解复杂生理过程等方面有很大的促进作用。为了方便此类定位研究，我们构建了两套含有酵母细胞器标记蛋白基因阅读框的表达克隆，分别有绿色或红色荧光蛋白标签相融合。在这些克隆中，针对特定细胞器有至少两个不同标记蛋白的亚细胞分布及形态特征符合预期对该细胞器的描述，并且它们之间可以实现共定位，其可以作为该细胞器的荧光标记。最终确定的这些标记可以分别标示酵母细胞的液泡，内质网，线粒体，过氧化物酶体，脂滴，初级内吞体，次级内吞体，顺式高尔基体及反式高尔基体。采用密度梯度离心法，对亚细胞结构进行分离，结果显示特定细胞器的两个标记蛋白在各层碘克沙醇中的分布模式类似，进一步证明了这些标记的可靠性。关键词：细胞器，荧光蛋白，融合蛋白，密度梯度离心 42AbstractProtein subcellular location prediction in yeast cell can promote scientists to determination protein functions, to reveal how and in what kind of cellular environments proteins interact with each other and with other molecules, and to understand the intricate pathways that regulate biological processes at the cellular level. To facilitate these localization experiments, we have generated a series of fluorescent organelle markers based on well-established targeting sequences that can be used for co-localization studies. In particular, this organelle marker set contains indicators for the vacuole, endoplasmic reticulum, mitochondria, peroxisomes, lipids, endosomes, and the Golgi apparatus. All markers were generated with two different fluorescent proteins (FP) (green, or red FPs) in different plasmids for URA or TRP selection, respectively. The labeled organelles displayed characteristic morphologies consistent with previous descriptions that could be used for their positive identification. The cells were separated into fraction by density gradient centrifugation. And the two color markers labeling specific organelles demonstrated similar distribution profiles, prefiguring that they could be used for application.Keywords: Organelle, Fluorescent protein, Fusion protein, Density gradient centrifugation目录目录i1 概述11.1 荧光标记物11.1.1小分子有机染料11.1.2荧光蛋白11.1.3量子点（QD）21.2标记蛋白技术31.2.1免疫标记法31.2.2遗传标记法41.3 蛋白质表达及定位研究的技术手段51.3.1流式细胞法51.3.2 显微镜观察法51.4 荧光标记系统在酵母细胞中的应用62材料与方法72.1 实验材料72.1.1 菌株72.1.2 质粒72.1.3 试剂72.2.4密度梯度离心法检测各细胞器荧光标记的分布193结果与讨论233.1 细胞器荧光标记表达质粒的构建233.2 利用荧光显微镜鉴定各细胞器荧光标记243.2.1 线粒体的荧光标记鉴定243.2.2 脂滴的荧光标记鉴定253.2.3 内质网的荧光标记鉴定263.2.4 液泡的荧光标记鉴定273.2.5 过氧化物酶体的荧光标记鉴定283.2.6 次级内吞体的荧光标记鉴定283.2.7 初级内吞体的荧光标记鉴定293.2.8 反式高尔基体的荧光标记鉴定303.2.9 顺式高尔基体的荧光标记鉴定303.2.10内吞体与染料FM4-64的共定位313.3 利用密度梯度离心法验证各细胞器荧光标记32参考文献38致谢41个人简历42学术成果421 概述使用荧光技术来研究细胞生物学已经好多年了，而且在从微小的分子层面到完整的有机体层面等各个层面都可以使用荧光技术进行研究。最开始使用的方法是将小分子有机染料与各种抗体相连接，来研究各种目的蛋白。不过这种使用抗体的方法如果需要对细胞内的蛋白质进行研究时，还需要对细胞进行固定和透化操作。因此后来又发展出可以直接在活体细胞内标记某种细胞器、核酸分子或某些离子的荧光标志物。在最近这20年里，荧光蛋白的出现使得进行非侵入性的活体细胞成像成为了可能。使用这种荧光蛋白标志物，我们可以研究目的基因的表达情况，蛋白质运输情况以及各种细胞内动态的生物化学信号通路。使用经过遗传修饰的小分子有机荧光标志物构建的混合系统，我们还可以对蛋白质的寿命进行研究，如果再结合电镜技术和快速光淬灭技术（rapid photoinactivation）还可以对蛋白质的定位情况进行研究。1.1 荧光标记物1.1.1小分子有机染料小分子有机染料是指分子量小于1KD的小分子物质，这种小分子有机染料可以通过与生物大分子共价连接的方式对其进行标记，我们现在对这种染料的最佳检测波长范围、亮度，即吸光系数、光稳定性和自我淬灭特性都有了比较详尽的了解。利用荧光染料的分子策略包括扩展共轭双键、额外添加环状结构增强其刚性、用氟或磺酸盐这类吸电子性的或带电荷的物质进行修饰等。现在市面上已经有数百种这类荧光染料的商业化产品可供选择（1），而且还在不断增加之中。不过由于这类染料对蛋白质缺乏特异性，因此多与抗体联用。1.1.2荧光蛋白第一批用于细胞生物学的荧光蛋白包括藻胆蛋白（phycobiliproteins）和从蓝藻（cyanobacteria）中提取的触角光合色素（photosynthetic antenna pigments）（2）。这些生物大分子都含有多种胆汁三烯生色基团（bilin chromophores）。这些生色基团都包裹在一种基质结构中，这样就能将它们的淬灭作用降至最小，因此这些藻胆蛋白的荧光亮度要比小分子荧光染料的亮度高出两个数量级。不过这些藻胆蛋白的“个头（分子量高达200KD）”也限制了它们在细胞内的扩散，因此，它们也只能与抗体联用，在流式细胞术试验或ELISA试验中用来检测细胞表面的蛋白质分子（3）。不过如果能将这些藻胆蛋白在细胞中原位表达，那么它们的用途就会大为扩展，但问题在于胆汁三烯生色基团必须依赖脱辅基蛋白（apoproteins）的作用（4,5）。自从科学家从维多利亚发光水母（jellyfish Aequorea victoria）中发现了绿色荧光蛋白（GFP）之后，生物成像领域就发生了革命性的改变（6,7,8）。单独表达绿色荧光蛋白或与其它蛋白融合表达就可以在细胞内发出绿色荧光了，使用这种方法除了需要氧气O2之外，不再需要任何其它的试剂参与，因为生色基团是通过自发环化作用形成的，需要对深埋在直径约2.4纳米至4纳米的桶（beta barrel）核心里的三个氨基酸（丝氨酸-酪氨酸-氨基乙酸）进行氧化才能发出荧光。绿色荧光蛋白只是荧光蛋白大家族中的一员（9,10），这些荧光蛋白大部分都来自海洋腔肠动物，因为各自含有共价结构不同以及非共价环境不同的生色基团，所以可以发出不同颜色的荧光（11）。在实验室中对这些荧光蛋白进行遗传修饰之后可以进一步的丰富它们的特性，比如增加亮度和折叠效率（12）、减少寡聚体形成（11）等。突变既可以增加荧光蛋白的光稳定性，还可以赋予荧光蛋白光操控性，比如控制荧光发射与否，或者发出哪种荧光（13）。这种光操控性既可以是可逆的也可以是不可逆的，可以用于监测蛋白的弥散过程、运输过程和老化过程等。虽然荧光蛋白在生色基团形成的过程中会生成H2O2（8），但似乎没有产生太多的活性氧簇（ROS），这一点也并不奇怪，因为荧光蛋白在进化过程中都是暴露在阳光下的。不过我们也可以对荧光蛋白进行改造使其能够形成ROS（14）。荧光蛋白发出的荧光一般对它们所处的生化环境都不太敏感，但是酸性环境或变性剂的存在可以淬灭荧光。不过现在我们已经有了经过改造的、能耐受酸性环境或者能对金属离子、卤化物离子和巯基二硫化物氧化还原剂起反应的荧光蛋白（10,15）。1.1.3量子点（QD）量子点是一种无机纳米结晶体，它可以根据其大小发出特定波长的荧光，它具有非常高的消光系数，其消光系数要比小分子荧光基团和荧光蛋白高出10倍至100倍，同时量子点的量子产率也非常好。典型的量子点都含有一个硒化镉（CdSe）或碲化镉（CdTe）核心，外面包裹一硫化锌（ZnS）外壳。量子点的吸收波长范围覆盖从非常短的波长至略低于其发射波长的广阔范围，因此一束单波长激发光就可以让量子点达到多重发射。对于生物学研究领域来说最重大的一项突破是研究出了能让量子点溶于水的包被材料，该材料能避免量子点被水淬灭，同时也能让量子点可以与抗体、抗生物素蛋白链菌素（streptavidin）等分子相连接（16-20）。不过这种结合了生物大分子的量子点体积过大（直径约10纳米至30纳米），从而阻碍了它通过细胞膜结构，这种量子点也就只能用于经透化处理的细胞，或者只能对胞外蛋白和可以被细胞内吞的蛋白进行研究。量子点的光稳定性使其能够反复成像，而其大小和电子密度特性又使得它适合用于电镜研究（21）。在亲水的树枝状高分子聚合物（hydrophilic dendrimers）中形成的金或银纳米点材料也能发出荧光，同时也具有波长可调性（22）。这种新型材料在细胞生物学领域的应用前景也是不可估量的。1.2标记蛋白技术1.2.1免疫标记法 在用荧光技术检测内源性蛋白质时最常用的方法就是免疫学方法，即先用特异性抗体（一抗）识别靶蛋白，再用标记有小分子有机染料、藻胆蛋白或量子点的二抗显色。或者，也可以直接将荧光标志物或者生物素连接在一抗上，然后再用抗生物素蛋白链菌素检测。当把抗体直接注入细胞时或者为了对多个蛋白进行检测而使用了多种颜色的荧光时采用这种直接将标志物连接在抗体上的方法非常有效。但是如果没有高质量的抗体时最好就是将荧光标志物与靶蛋白一起融合表达来检测，尽管这种融合蛋白不能算真正意义上的“内源性蛋白”。对靶蛋白检测的精确程度取决于一抗的特异性，因此还需要用其它的方法进行佐证。使用免疫荧光标记法的劣势在于前面所述的，该方法只能用于经透化处理的细胞、胞外蛋白和可以被细胞内吞的蛋白，而且这些抗体标志物的多价性（multivalency）还可能会导致靶蛋白形成寡聚体。在标准的免疫标记法中，荧光标记的复合体通常来说分子量都会超过200KD，这有可能会影响到蛋白间的相互识别过程。1.2.2遗传标记法将荧光蛋白与靶蛋白融合在一起的遗传标记法最大的优势就是可以对靶蛋白进行精确的标记。用转染技术和转基因技术进行荧光标记要比用荧光染料方便得多。遗传标记法的缺点在于表达的蛋白不是“内源性”蛋白，荧光蛋白的分子大小会带来影响，融合蛋白可能会影响到目的蛋白的功能，以及荧光蛋白的限制性问题等。因此，又发展出了好几种“混合系统”，在活细胞内或细胞表面将小分子荧光标志物与目的蛋白进行共价连接，或者通过酶的作用进行连接，甚至于可以自动连接（23-25）。不过这些技术中的大部分都太新了，还没有得到足够的实用检验。这些混合系统中最好的系统应该算四半胱氨酸序列（tetracysteine）-biarsenical染料系统（26）。该系统用一段由12个氨基酸残基组成的肽段对目的蛋白进行修饰，这段短肽内包含有4个半胱氨酸，这些半胱氨酸能够与可以透过细胞膜的biarsenical染料分子相结合，形成FlAsH或ReAsH（27），发出绿色或红色荧光，这种结合过程是高亲和力的过程，只需要皮摩尔级的分子就足够了。同时使用小分子二巯基化合物解毒剂（dithiol antidotes）可以降低靶蛋白与染料之间的亲和力，同时减少毒性反应。Tetracysteine基序已经经过了好几轮改良以提高它与biarsenical染料之间的亲和力，这样只需使用很低浓度的biarsenical染料就可以达到目的，而且可以降低背景（28）。这种小分子Tetracysteine基序对目的蛋白的影响要比荧光蛋白小得多，有人用酵母微管蛋白（tubulin）（29）、G蛋白（30）和细菌致病蛋白（31,32）等已经证实了这一点。这种tetracysteine-biarsenical系统还具有其它荧光蛋白不具有的优势，比如可以用于亲和纯化（affinity purification）（27）、荧光蛋白辅助的光灭活作用（fluorophore-assisted light inactivation）（33,34）、检测蛋白质合成过程（35,36）、进行脉冲追踪标记（pulse-chase labeling）（37,38）以及电镜下定位（37）等等。不过，biarsenical染料会造成背景荧光偏高，因此在这一点上（荧光高对比度）相比荧光蛋白并不具备优势，因此还没有用于转基因动物，而且还不能同时对不同的蛋白标记上不同的颜色。Tetracysteine序列有时也可以提供一个十六烷酰化位点（palmitoylation site），虽然这种修饰作用有时会被已经存在的原位标签（epitope tag）所阻碍（28）。这种遗传标记法具有其独特的优势，但是还是需要用其它方法验证标记物蛋白或融合蛋白是否会影响到目的蛋白的功能及定位。1.3 蛋白质表达及定位研究的技术手段1.3.1流式细胞法免疫荧光技术是最适合研究内源性蛋白质的一种方法。能够特异性结合磷酸化蛋白的被荧光标记的抗体可以帮助我们清楚地观察到内源性蛋白质的活化状态， 这一点对于用荧光流式细胞仪（fluorescent flow cytometry）对单细胞内的多种胞质蛋白的活性进行研究非常重要（39）。单细胞内研究资料可以用于构建细胞信号网络（40），并且有可能用于在体外对病人的血细胞进行临床药物试验。目前对于胞质蛋白来说，小分子染料要比量子点更实用，因为小分子染料对于细胞的穿透性更好。不过量子点的高亮度特性有助于提高检测的极限，而且量子点的多色特性也有助于进行多色标记。使用小分子染料、藻胆蛋白和量子点，可以在流式细胞仪中同时对17种荧光进行检测（41）。1.3.2 显微镜观察法要想获得蛋白质在细胞器和其它亚细胞结构中最准确的定位信息，这莫过于使用电子显微镜了。大部分单独的荧光基团在光照下都会产生单线态氧（singlet oxygen），这些单线态氧不仅容易对荧光基团自身起到漂白作用，而且可以将局部的二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）氧化形成电镜下的嗜锇小体（osmiophilic polymer）。这种“光转化（photo-conversion）”过程最初是在荧光黄（Lucifer Yellow）里发现的（42），后来又在四溴荧光素免疫荧光染色（eosin immunostaining）中发现了（43）。最近发现，用tetracysteine序列标记的蛋白经biarsenical染色后形成的ReAsH对DAB也具有光转化作用，这提示我们需要在试验操作中更加仔细进行固定操作，已达到对细胞超微结构最佳的保存效果。而且用tetracysteine序列标记方法还可以进行脉冲追踪标记，以此在电镜下区别出“新的”蛋白质和“老的”蛋白质（37）。据报道绿色荧光蛋白对于DAB也有光转化作用（44），不过转化效率要比ReAsH低很多。光转化作用对于聚集在亚细胞结构中的蛋白质的作用最大。量子点在发现更多的蛋白质和在细胞内分布范围更广的蛋白质这一方面非常具有优势，它可以同时用于光镜和电镜。量子点的高电子密度核心和其大小特性使得它可以在电镜下被发现，而且还可以借助银染的手段对量子点进行染色，进一步方便我们观察（45）。有人用切片后标记的方法（postsectioning labeling）用量子点对核内蛋白（nuclear protein）进行了标记，证明了量子点在电镜下和光镜下的应用价值（46）。最近有报道称有人用免疫标记方法将量子点直接对细胞和组织内的多种内源性蛋白质进行了标记，标记后可在光镜和电镜下进行观察（21）。量子点标记后可以现在光镜下进行预筛，以检测标记效率，并划定目标区域，以方便后续的电镜检查。因为量子点的大小有差异，所以我们可以轻易的分辨出3种不同的蛋白质（21）。又因为每一个量子点都可以发出荧光，可以在电镜下被检测到，因此从原理上来说可以用电镜进行所有的荧光观察研究，比如可以不用抗体而用生物素标记细胞表面蛋白，然后用标记有抗生物素蛋白链菌素的量子点进行检测等（47）。不过因为在免疫标记法中需要对细胞进行透化处理，而且不能对细胞进行直接的、比较严苛的固定操作，因此细胞的超微结构不能得到很好的保存，这一点不如使用tetracysteine序列标记技术。1.4 荧光标记系统在酵母细胞中的应用荧光显微标记技术在酵母细胞中与在哺乳动物组织细胞中的应用方式是类似的。荧光染料可以准确地鉴定酵母的不同细胞器，荧光融合蛋白可以用来追踪特定蛋白的运动轨迹，并且通过与不同细胞器荧光标记的共定位来确定其最终定位。然而以往荧光标记在酵母细胞中的应用实现起来总是略难的，主要是因为酵母细胞个头小一些，大概3-5m左右，相比起来哺乳动物细胞可以达到10-100m。随着技术的进步，近来的共聚焦显微镜将精度提高到了0.4m，这样已经足以全面多角度地去观察一个酵母细胞的内部结构。想要观察酵母活细胞的蛋白定位情况，融合荧光蛋白技术是不二选择，然而如果想要提高观察精度，使用高分辨率共聚焦显微镜，这时荧光寿命也需要在考虑范围之内，荧光蛋白就不再合适，那么需要使用酵母免疫荧光技术，将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体作为分子探针检查酵母细胞内的目标蛋白。然而酵母免疫荧光技术的局限在于它的作用对象只能是已经被固定的细胞。因此在实际应用中，这两种技术往往可以互补。本文采用基因融合技术，将各种细胞器特异性标记蛋白完整阅读框与GFP或RFP融合，获得该融合蛋白功能位点的取代性荧光定位，最终实现了利用荧光蛋白标记细胞器，为日后观察亚细胞水平细胞器动态变化以及未知目标蛋白的定位提供了基础性工具。2材料与方法2.1 实验材料2.1.1 菌株表2.1 本文所用的菌株名称基因型TN124MAT leu2-3,112 trp1 ura3-52 pho8:pho860 pho13:LEU22.1.2 质粒表2.2本文所用质粒质粒属性GFP-RS406带有GFP标签（目标基因N端）和尿嘧啶筛选基因KT209带有GFP标记（目标基因C端）和尿嘧啶筛选基因KT209-2GFP带有2GFP标记（目标基因C端）和尿嘧啶筛选基因ClhN-GFP-URA带有GFP标记（目标基因C端）和尿嘧啶筛选基因ClhN-2DSred-TRP带有2DSred标记（目标基因C端）和色氨酸筛选基因ClhN-mCherry-TRP带有mCherry标记（目标基因C端）和色氨酸筛选基因mCherry-RS404带有mCherry标记（目标基因N端）和色氨酸筛选基因2.1.3 试剂2.1.3.1购买试剂表 2.3 购买试剂列表名称来源用途Q5 High-Fidelity DNA PolymeraseNEB公司用于DNA片段扩增dNTPs康为世纪公司用于PCRDEPC水上海生工生物公司用于提取RNA琼脂糖粉Biowes公司配琼脂糖凝胶限制性内切酶NEB公司DNA酶切T4 ligase enzymeNEB公司DNA连接Exnase II诺唯赞公司DNA重组2*Master Mix北京康为世纪公司菌落验证PCR验证DNA Marker北京康为世纪公司DNA 大小指示蛋白 MarkerNEB公司蛋白大小指示鲑鱼精DNAsigma公司酵母转化2.1.3.2培养基配制1、50%Glucose蒸馏水中溶解100g D-Glucose中，定溶到200ml，115高压蒸汽灭菌15min。2、YPD培养基成分含量Yeast Extract10gPeptone20g50%Glucose（已灭菌）40mlAgar（固体培养基中添加）20g蒸馏水中溶解除Glucose外的其余成分，定溶到960ml，121高压蒸汽灭菌20min，无菌超净台中加入40ml已灭菌50%Glucose，充分混匀。3、SD-N培养基成分含量YNB without amino acids and ammonium sulfate1.7g50%Glucose（已灭菌）40ml蒸馏水中溶解无氮源的YNB，定溶到960ml，121高压蒸汽灭菌20min，无菌超净台中加入40ml已灭菌50%Glucose，充分混匀。4、营养缺陷培养基成分含量YNB without Amino Acids6.7g50%Glucose（已灭菌）40ml20*Amino Acids50mlAgar（固体培养基中添加）20g蒸馏水中溶解YNB，定溶到910ml，121高压蒸汽灭菌20min，无菌超净台中加入40ml已灭菌50%Glucose和50ml过滤除菌的20*Amino Acids，充分混匀。5、20*Amino Acids成分含量Leu200mgTrp200mgAde120mgLys120mgMet120mgHis80mgUra80mg蒸馏水溶解各组分，定溶到200ml，0.22m滤膜过滤除菌。配制某种缺陷型培养基，20*Amino Acids配制时减掉相应氨基酸组分。6、LB培养基成分含量Yeast Extract5gTryptone10gNacl5gAgar（固体培养基中添加）20g蒸馏水中溶解各组分，定溶到1L，NaOH调节pH至 7.0，121高压蒸汽灭菌20min。2.1.4.3酵母转化试剂的配制1、ssDNA（5mg/ml)成分含量鲑鱼精DNA50mg蒸馏水加入50mg剪碎的鲑鱼精，煮沸充分溶解固体，定溶到10ml，200-300l分装0.5ml EP管中，置于PCR仪99 煮10min，立即置于冰上，待其冷却，转入-20冰箱。2、10*TE成分含量Tris1.211gEDTA0.372g蒸馏水溶解各组分，冰醋酸调节pH至7.5，定溶到100ml，0.22m滤膜过滤除菌。3、10*LiAc成分含量LiAc.2H2O10.2g蒸馏水溶解LiAc.2H2O，定溶到100ml，121高压蒸汽灭菌20min。4、50%PEG成分含量PEG400050g蒸馏水溶解，定溶到100ml，121高压蒸汽灭菌20min。5、1*LiTE成分含量10*TE10ml10*LiAc10ml无菌水80mlTotal100ml各组分在超净无菌工作台中，加入已灭菌的广口瓶中。6、1*LiTE/PEG成分含量10*TE10ml10*LiAc10ml50%PEG70ml无菌水10mlTotal100ml各组分在超净无菌工作台中，加入已灭菌的广口瓶中。2.1.4.4 Western Blot相关试剂的配制1、Cracking Buffer成分含量Tris0.6057gSDS1gEDTA0.0292gUrea36.04g蒸馏水溶解各组分，定溶到100ml。2、2*Sample Buffer成分含量0.5M Tris-Hcl pH 6.825ml10%SDS30ml-巯基乙醇4ml溴酚蓝2mg蒸馏水溶解各组分，定溶到100ml。3、10*SDS-PAGE Buffer成分含量Tris30.275gGlycine144.13gSDS10g蒸馏水溶解各组分，定溶到1L。4、10*Trans-Buffer成分含量Tris30.275gGlycine144.13g蒸馏水溶解各组分，定溶到1L。5、1*Trans-Buffer成分含量10*Trans-Buffer100ml无水甲醇200ml无菌水700mlTotal1L6、10*TBST成分含量Tris24.22gNacl80.06gTween2010ml蒸馏水溶解各组分，pH调至7.6，定溶到1L。3.1.4.5 碘克沙醇溶液各10mL的配制：浓度50%碘克沙醇体积（mL）细胞裂解液体积（mL）0 %0.010.05%1.09.010%2.08.015%3.07.020%4.06.023%4.65.428%5.64.433%6.63.440%8.02.02.2 实验方法2.2.1 质粒构建2.2.1.1 酵母基因组的提取A.挑取新鲜酵母板上单菌落接种于含8ml YPD液体培养的试管中，试管置于30恒温振荡器中，250 rpm恒温振荡培养过夜。B.第二天测OD600，若OD600小于0.51.0，继续振荡培养至 OD600至0.51.0；反之，OD600大于0.51.0，YPD液体培养基稀释OD6000.2，继续振荡培养至 OD600至0.51.0。C.吸取2OD菌液置于12ml离心管中，5000 rpm离心2min，弃上清。D.用1ml无菌水将菌体沉淀转移至1.5ml EP管中，6000 rpm离心1min，弃上清。E.向EP管中加入200l裂解液重悬沉淀，加入200玻璃粉，加入200l 酚：氯仿：异戊醇=25:24:1的混合液，放置漩涡混合器上振荡破碎3min。（操作有机试剂时注意防护）F.向EP管中加入200l TE溶液，温和颠倒几次混匀。G.EP管置于离心机中，12000 rpm离心5min，取上清至新的1.5ml EP管中，加入等体积氯仿：异戊醇=49:1的混合液，漩涡混匀。H.EP管置于离心机中，12000 rpm离心5min，取上清至新的1.5ml EP管中，加入1ml无水乙醇，颠倒混匀。I.13000rpm离心2min，弃掉上清，加入1ml 70%的乙醇洗涤沉淀。J.13000rpm离心2min，弃掉上清，室温开盖静置干燥30min，彻底干燥后加入100-200l TE溶液溶解沉淀，提取的基因组置于-20保存。I.提取的基因组跑琼脂糖凝胶鉴定是否有带，同时可以用引物进行PCR，验证所提基因组是否能用。2.2.1.2 目的基因的扩增目的基因的扩增A.按以下反应体系加入PCR管中：5*Q5 Reaction Buffer10l10mM dNTPs1l10l Forward Primer2.5l10l Reverse Primer2.5lTemplate DNA1lQ5 High-Fidelity DNA Polymerase0.5lNuclease-Free water32.5lTotal Volume50l模板为基因组DNA，终浓度在1ng-1g；模板为质粒终浓度在1pg-1ng即可。B.反应体系混匀，瞬时离心，放入PCR仪进行以下程序反应：表2.4 DNA扩增PCR反应程序预变性981min变性9810s35个循环退火55-7220s延伸7230s/kb总延伸725min保存10+C.反应结束后置于-20冰箱保存或直接进行琼脂糖凝胶电泳判断所得片段是否与目的片段大小一致。2.2.1.3 载体质粒酶切A.向EP管中加入以下反应体系：10*NEB buffrer5lDNA5lEnzyme 11lEnzyme 21lNuclease-Free water38lTotal Volume50l反应体系中可根据所需DNA浓度调整所加的DNA的体积。B.反应体系配好后，混匀，瞬时离心后，按所用内切酶的最适温度酶切4h。C.酶切结束后，置于-20冰箱保存或直接进行琼脂糖凝胶电泳判断所得片段是否与目的片段大小一致，若一致，对目的片段进行切胶回收。2.2.1.4 DNA纯化A.待纯化的DNA转移到1.5ml EP管中，向其中入5倍体积Buffer PB，充分混匀。B.向套有收集管的吸附柱中加入200l Buffer PS，12000rpm离心2min，倒掉收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中。C.将EP管中溶液加入吸附柱中，室温静置2min，放入离心机12000rpm离心1min，弃掉收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中。D.向吸附柱中加入750l Buffer PW（已加入无水乙醇），室温静置2min，放入离心机12000rpm离心1min，弃掉收集管中废液，将吸附柱放回收集管中。E.放入离心机12000rpm离心2min，弃掉收集管，吸附柱室温静置10min，晾干吸附柱。F.吸附柱放入新的1.5ml EP管中，向吸附膜中间悬空滴加50l Buffer EB（60-70预热），室温静置2min，12000rpm离心1min，纯化的DNA置于-20保存。2.2.1.5 质粒的重组构建A.按以下体系加入EP管中：实验组阴性对照Nuclease-Free water4l13l5*CE II Buffer4l4l线性化载体2l2l目的片段8l1lExnase II2l0lTotal Volume20l20lB.反应体系对应加入1.5ml EP管中，混匀，瞬时离心后，37孵育30min，至于冰上准备大肠杆菌转化。2.2.1.6 大肠杆菌转化A.从-80低温冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞（TOP10或DH5），至于冰上待其解冻。B.取10l T4连接产物或重组连接产物于1.5 ml EP管中，冰上预冷2min，加入50l的大肠杆菌感受态细胞混匀，冰上静置20min。C.将EP管放入42金属浴，热击2 min，热击完毕后，立即冰浴2 min。D.取出EP管，在无菌超净台中向EP管中加入1ml LB液体培养基，混匀，37 250rpm振荡培养40min。E.6000rpm离心1min，去上清，加入150l无菌水。E.所有菌液，均匀涂抹在相关抗性的LB固体培养基平板上，倒置放于37生化培养箱，培养过夜。F.第二天，进行菌落PCR验证，验证正确的菌在无菌超净台中挑取单菌落于含4ml相关抗性的LB液体基的试管中，放入37恒温振荡器250 rpm振荡培养8-10h，提取质粒。2.2.1.7 重组子菌落PCR验证A.根据LB抗性平板上，根据实验组与阴性对照组菌落个数的比例决定要验证的菌落个数。B.取一个新的抗性LB固体板，在地面标记矩阵方格和编号。C.准备反应以下菌落PCR反应体系，加入八联管中，并编号。Nuclease-Free water8l2*Master Mix10lPrimer F1lPrimer R1lTotal Volume20lD.在无菌超净台中，挑取要验证单菌落，轻点到编号的抗性反方格中，之后将挑的剩余菌放入相应标记的八联管中吹打混匀，并设置加阴性对照组的菌为PCR阴性对照。E.挑菌完成后，抗性固体板倒置放于37生化培养箱孵育5-7h；八联管盖盖子，瞬时离心，放入PCR仪，按以下程序进行PCR。（表3.7）表3.7 菌落PCR反应程序预变性9410min变性9430s35个循环退火55-6530s延伸7260s/kb总延伸7210min保存10+F.PCR完毕后，进行琼脂糖凝胶电泳，浸泡EB染胶，成像，若带大小与目的片段一致并且阴性对照相应大小不出条带，认为此菌落是阳性重组子。2.2.2 酵母转化A.挑取新鲜酵母板上单菌株接种于含8ml YPD液体培养的试管中，置于30恒温振荡器，250 rpm恒温振荡培养过夜。B.测试管中酵母菌浓度，如果OD600大于1.0，稀释酵母菌OD6000.2，继续振荡培养到OD600在0.8-1.0之间；如果OD600小于0.8，继续振荡培养到OD600在0.8-1.0之间。C.取6OD细胞于12ml离心管中，5000rpm离心2min，弃掉上清，加入5ml灭菌水重悬，5000rpm离心2min，弃掉上清。D.离心管中加入2ml LiTE溶液重悬细胞，各取1ml加入2个1.5ml EP管中（一管做转化，另一管做阴性对照），6000rpm离心1min，尽量吸掉上清。E.向EP管中加入以下成分实验组阴性对照组LiTE/PEG320l320l5mg/ml ssDNA20l20l线性化质粒/DNA片段5l/20l0lNuclease-Free water0l5l/20lF.EP管中体系充分混匀，42热击40min，热击完毕后，6000rpm离心1min，吸掉上清。G.向EP管中加入1ml无菌水重悬菌，置于离心机6000rpm离心1min，去上清。H.向EP管中加入200l无菌水，混匀，菌液均匀涂在相关营养缺陷型板，固体板倒置放入30生化培养箱培养48-72h。J.长出的单菌落挑取6-8个划线相应相关营养缺陷型板，置于30生化培养箱扩大培养24-48h。2.2.3 荧光显微镜观测细胞器标记A.挑取新鲜的酵母单菌落于含8ml YPD液体培养基的试管中，置于30恒温振荡器250rpm振荡培养过夜。B.第二天，测试管中酵母菌浓度，如果OD600大于0.7，稀释酵母菌OD6000.2，继续振荡培养到OD6000.7；如果OD600小于0.7，继续振荡培养到OD6000.7。C.取2OD菌液置于12ml离心管中，放入离心机5000rpm离心2min，弃掉上清，加入2ml SD-N液体培养基重悬。D.5000rpm离心2min，弃上清，加入2ml SD-N液体培养，30恒温振荡培养50minE.取300l菌液放于CoA处理过的盖玻片或玻璃底面细胞培养皿中，静置5min，SD-N液体培养基冲洗4次，最终加入1ml SD-N液体培养基，培养皿置于荧光显微镜上，观察，记录。2.2.4密度梯度离心法检测各细胞器荧光标记的分布2.2.4.1 原生质体的制备A.将酵母菌接种于YPD培养基（100 ml 到20 L），剧烈摇动或强制通气条件下培养至对数中期（OD60015）。培养物在预称重的离心瓶中于4， 1 500 g 离心5 min。B.确定酵母细胞的湿重，它与压紧的细胞体积大致相同。在所有的后续步骤中菌体的量将当作1体积来考虑。C.细胞用24体积冰水重悬，并立即于4，1 500 g 离心5 min，加入1体积含30 mmol/l DTT的酵母消解酶缓冲液重悬细胞、室温放置15 min。D.于4，1 500 g 离心5 min，菌体用3体积的酵母消解酶缓冲液重悬。E.在每毫升原压紧细胞中加入2 mg（200 U）酵母消解酶-100T，于30水平摇床以大约50 r/min 的转速温育40 min，通过水渗破法确定菌体是否完全转变为原生质体，如果原生质体化不完全，应继续温育直到完全。F.1500g 离心原生质体5 min，小心弃上清，原生质体球沉淀块不如细胞沉淀块般紧密。G.用2体积冰冷的酵母消解酶缓冲液轻轻重悬沉淀，原生质体1 500 g 离心5 min，重复2次。H.用2体枳酵母消解酶缓冲液轻轻重悬沉淀，不要试图得到均一的悬液，只需将沉淀物从管壁上洗下来，悬转1020次，于1500 g 离心10 min回收原生质体。2.2.4.2 密度梯度离心A.用玻璃棒仔细将原生质体沉淀重悬于1体积裂解缓冲液中。 B.在Dounce 匀浆器中用最紧密的研杵，冲击1520次以裂解原生质体。C.往超离心管中加入一半管体积原生质体裂解液，再加等体积的抽提缓冲液，将离心管封口。于4在旋转轮或摇床上轻轻倒转离心管1530 min。D.于4，300g离心7min，收集上清，进行密度梯度离心。E. 将40%（1mL）、33%（1.5mL）、28%（1.5mL）、23%（1.5mL）、20%（1.5mL）、15%（1mL）、10%（1mL）、5%（1mL）的碘克沙醇溶液依次小心缓慢加入超速离心管中，使分层明显。再小心缓慢加入D中液体。全程轻拿轻放，不要摇晃，小心分层。F. 将超速离心管以相对离心力170000g于4离心60min。G. 将离心后的液体1mL/层收集起来，共12层，用于western blot检测。2.2.4.3 Western Blot检测2.2.4.3.1 SDS-PAGE胶的电泳A.根据所加蛋白的体积选择合适厚度的玻璃板和梳子。B.清洗垂直电泳槽和玻璃板，