RNA提取系列

核酸纯化系统 TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTDTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD RNA提取专项 . 1RNA相关知识及提取原理 1RNA提取流程 1实验举例及实验中注意点 1特殊组织RNA的提取 1RNA的评价与鉴定 1RNA的保护 AAAAAA RNA相关知识及提取原理细胞中RNA的种类和含量 AAAAAA tRNA mRNA rRNA RNase 不同丰度组织名称样品量总RNA含量 高丰度肝脏1mg2-4g 脾脏1mg 心脏1mg 中丰度大脑1mg0.05-2g 胚胎1mg 肾脏1mg 肺1mg 低丰度膀胱1mg0-0.05g 骨1mg 脂肪1mg 高丰度成纤细胞1050.5-1g 人白细胞105 中丰度酵母1050.5-1.5g 拟南芥叶片1mg0.2-0.5g 低丰度烟草叶片1mg0.05-0.1g 玉米叶片1mg RNA相关知识及提取原理RNA的裂解原理 异硫氰酸胍/苯酚法 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋 白体上的蛋白变性，核酸释放 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而 分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离 胍盐/-巯基乙醇法 盐酸胍裂解样本，抑制RNase的活性 -巯基乙醇变性蛋白 RNA相关知识及提取原理RNA吸附原理 吸附材料纯化原理 硅基质 高盐低pH值结合核酸 低盐高pH值洗脱 阴离子交换树脂低盐高pH值结合核酸 高盐低pH值洗脱 磁珠磁性微粒挂上不同基团可 吸附并携带RNA 沉淀法 介质吸附 1RNA相关知识及提取方法原理 1RNA提取流程 1实验举例及实验中注意点 1特殊组织RNA的提取 1RNA的评价与鉴定 1RNA的保护 RNA提取流程 1、样本前处理 2、细胞裂解 3、 RNA的纯化及获得 RNA提取流程 样品前处理注意点 选择新鲜血液，不得超过4小时 选择新鲜的幼嫩组织 选择处于生长旺盛的时期收集细胞 选择新鲜组织，生长旺盛的组织 可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到的白细胞 然后加入一定量的TRNzol，-70保存较长时间 去掉培养基，加入一定量TRNzol -70 保存较长时间 推荐使用专门的RNA样品 储存液进行储存 液氮或加入RNase抑制剂中保存， 避免反复冻融 RNA提取流程 样品前处理中如何保存样本 样品的前处理方式 RNA提取流程 样本前处理的目的：离散，均一，细胞集或细胞液 液氮研磨 匀浆或液氮研磨 应用红细胞裂解液处理 蛋白酶K处理 RNA提取流程样品前处理样品前处理Q&AQ&A Q-1Q-1：样品量是否越多越好？样品量是否越多越好？ A-1A-1：不是。在试剂盒规定内增加，若过度增加样品处理量会影响不是。在试剂盒规定内增加，若过度增加样品处理量会影响 RNARNA得率；如增加样品起始量，则后续实验中各溶液量均要相得率；如增加样品起始量，则后续实验中各溶液量均要相 应按比例增加。应按比例增加。 处理样品量 RNA得率 实际得率 预期得率 最大量 Q-2Q-2：如何保证研磨过程和匀浆中：如何保证研磨过程和匀浆中RNARNA不被降解？不被降解？ A-2A-2：研磨过程要迅速，同时尽量避免外源研磨过程要迅速，同时尽量避免外源RNARNA酶污染；匀浆酶污染；匀浆 过程中一定要保证组织和裂解液充分接触，尽量在匀浆过程中一定要保证组织和裂解液充分接触，尽量在匀浆 前将组织低温切割成小块加入裂解液中，可确保前将组织低温切割成小块加入裂解液中，可确保RNARNA不不 被降解。被降解。 RNA提取流程样品前处理样品前处理Q&AQ&A 1、样本前处理 2、细胞裂解 3、 RNA的纯化及获得 RNA提取流程 RNA提取流程细胞裂解，以释放RNA 异硫氰酸胍/酚TRNzol总RNA提取试剂 独特配方-RNAplant植物RNA提取试剂 胍盐/-巯基乙醇RNAprep系列RNA提取试剂盒 RNA提取流程 1、样本前处理 2、细胞裂解 3、 RNA的纯化及获得 RNA提取流程 RNA的纯化及获得 RNA纯化要求 1 纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质 2 排除有机溶剂和金属离子的污染 3 蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度 4 排除DNA分子的污染 1RNA相关知识及提取原理 1RNA提取流程 1实验举例及实验中注意点 1特殊组织RNA的提取 1RNA的评价与鉴定 1RNA的保护 实验举例 l 使用试剂（以TRNzol A为例） l使用试剂盒（以RNAprep pure试剂盒为例 ） 操 作 流 程 样品前处理、细胞裂解 试剂试剂盒 纯化 沉淀 加入吸附柱 洗涤 溶解RNA沉淀 获得RNA产物 加缓冲液 漂洗 RNA洗脱收集 细胞 基因组DNA 水相 有机相 RNA 氯仿 纯化 pH5.7 离心 加入裂解液 (TRNzol-A+) 实验举例应用TRNzol-A+提取动物细胞RNA 细胞选择 贴壁细胞 悬浮细胞 样品处理量与加入的TRNzol-A+的量要对应 1mlTRNzol-A+对应： 1 血液0.2-1ml 2 动植物组织30-50mg 3 贴壁细胞：每10cm2培养面积 4 悬浮细胞：5-10106细胞 等体积异丙醇沉淀70乙醇洗涤沉淀晾干溶解 RNA吸附柱去蛋白液漂洗洗脱 水相 RNA 传统方法：有机溶剂抽提，得率高 柱纯化法：纯度高 实验举例应用TRNzol-A+提取动物细胞RNA 图片说明： M: TIANGEN Marker III A: A公司同类产品提取动物细胞结果 T: TIANGEN公司TRNzol-A提取动物细胞结果 试验材料： Hela cell/106 实验方法： TIANGEN公司 TRNzol-A+ A公司同类产品 试验结果： 得率：TRNzol-A+得率与A公司同 类产品略高 纯度： 经TRNzol-A+纯度较高， 无明显DNA、蛋白残留 M TA 1 2 3 4 5 6 实验举例应用TRNzol-A+提取动物细胞RNA 实验注意事项应用TRNzolA的注意点 前处理 裂解 沉淀 洗涤 抽提 溶解 RNA降解 处理样品量 上清吸取，杂质去除 适量异丙醇 乙醇，盐离子残留 RNA不宜太干 操 作 流 程 样品前处理、细胞裂解 试剂试剂盒 纯化 沉淀 加入吸附柱 洗涤 溶解RNA沉淀 获得RNA产物 加缓冲液 漂洗 RNA洗脱收集 实验举例应用RNAprep pure提取动物组织 动物组织 研磨或匀浆 裂解 结合 漂洗 洗脱 植物组织30-50mg 动物组织10-20mg 悬浮细胞107 贴壁细胞10cm2 血液0.5-1.5ml 胍盐、-巯基乙醇 裂解细胞灭活RNase RNA在高盐低pH值条件下与硅胶膜结合 RW1除去蛋白残留 RW除去盐离子 在漂洗过程中利用DNase 除去基因组 DNA RNA在底盐高PH条件下被洗脱 用经DEPC处理过的水或专门的试剂来 洗脱或溶解RNA 裂解 结合 漂洗 洗脱 实验举例应用RNAprep pure提取动物组织 胍盐、-巯基乙醇 裂解细胞灭活RNase RNA在高盐低pH值条件下与硅胶膜结合 RW1除去蛋白残留 RW除去盐离子 在漂洗过程中利用DNase 除去基因组 DNA RNA在底盐高PH条件下被洗脱 用经DEPC处理过的水或专门的试剂来 洗脱或溶解RNA 裂解 结合 漂洗 洗脱 实验举例应用RNAprep pure提取动物组织 胍盐、-巯基乙醇 裂解细胞灭活RNase RNA在高盐低pH值条件下与硅胶膜结合 RW1除去蛋白残留 RW除去盐离子 在漂洗过程中利用DNase 除去基因组 DNA RNA在底盐高PH条件下被洗脱 用经DEPC处理过的水或专门的试剂来 洗脱或溶解RNA 裂解 结合 漂洗 洗脱 实验举例应用RNAprep pure提取动物组织 胍盐、-巯基乙醇 裂解细胞灭活RNase RNA在高盐低pH值条件下与硅胶膜结合 RW1除去蛋白残留 RW除去盐离子 在漂洗过程中利用DNase 除去基因组 DNA RNA在底盐高PH条件下被洗脱 用经DEPC处理过的水或专门的缓冲液 洗脱或溶解RNA 裂解 结合 漂洗 洗脱 实验举例应用RNAprep pure提取动物组织 试验材料：大鼠肝脏/10mg 实验方法： TIANGEN公司 RNAprep pure Kit A公司某柱式RNA提取试剂盒 试验结果： 得率：RNAprep pure 得率比A公司产 品高15左右 高纯度：纯度较高，且无盐份残留 TIANGEN A公司 TIANGEN A公司 MTIANGENA 实验举例应用RNAprep pure提取动物组织 裂解 结合 漂洗 洗脱 控制提取样品量 防止堵柱或漏柱 盐离子去除 得率控制 实验注意事项应用RNAprep pure的注意点 RNA回收率 实验注意事项洗脱体积与得率关系 1RNA相关知识及提取方法原理 1RNA提取流程 1实验举例及实验中注意点 1特殊组织RNA的提取 1RNA的评价与鉴定 1RNA的保护 一些特殊组织的RNA提取 纤维组织 蛋白/脂肪含量高组织 核酸/RNase含量高组织 植物组织/真菌组织 彻底破碎 多次氯仿抽提 减少处理量，多次氯仿抽提 多次氯仿抽提，特殊试剂 1RNA相关知识及提取方法原理 1RNA提取流程 1实验举例及实验中注意点 1特殊组织RNA的提取 1RNA的评价与鉴定 1RNA的保护 RNA的评价与鉴定 v 纯度（ OD260 /OD280 ）： 紫外分光光度计进行测量（选择正确的稀释倍数，确保OD260 值在0.11.0之间， 通常离心柱法稀释10倍左右；溶液裂解法稀释4050倍） OD260 /OD280 1.9 2.1说明有部分降解 v 得率 紫外分光光度计进行测量； Yield OD260稀释倍数40ng/ul v 电泳检测 1琼脂糖，6V/cm，15min，上样13 ul M 1 2 M 1 2 DNA残留 蛋白残留 1RNA相关知识及提取方法原理 1RNA提取流程 1实验举例及实验中注意点 1特殊组织RNA的提取 1RNA的评价与鉴定 1RNA的保护 RNA的保护RNA的不稳定性 4内因：核糖残基的2和3位置带有羟基，易被水解 4外因：内源、外源RNA酶含量丰富，加热后仍能 够正确折叠恢复活性，不易失活 RNA的保护常用的RNA酶抑制剂 焦碳酸二乙酯（焦碳酸二乙酯（DEPCDEPC） 异硫氰酸胍异硫氰酸胍 RNasin RNasin 氧钒核糖核苷复合物氧钒核糖核苷复合物 SDSSDS、尿素、硅藻土等、尿素、硅藻土等 RNA的保护提取前的保护 材料样品中的RNA保护 RNA提取工作区RNase的清除 实验耗材，器皿的RNase清除 塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡4-10小时，再灭菌 玻璃器皿可在180烘烤4小时 塑料制品和枪头避免交叉污染 RNA的保护提取过程中的RNA保护 组织破碎 细胞裂解 实验人员 适当的破碎方法 适量的裂解液 正确的操作和防护措施 RNA的保护保存过程中及后续实验中的RNA保护 保存过程 RNAsafe 后续实验 RNasin TIANGEN让您的RNA实验更顺利！ . TIANGEN公司 RNA提取试剂/盒 硅胶膜吸附法硅胶膜吸附法 DP419 RNAsimple 总RNA 提取 试剂盒 DP315 TIANamp 病毒 DNA/RNA 提取试剂盒 DP405 TRNzol 总RNA提 取试剂 DP421 TRNzol-A 总RNA提 取试剂 DP407 RNAplant 植物总 RNA提取 试剂 RNAprep pure 系列试剂 盒 DP430 RNAprep pure培养细胞 /细菌总RNA 提取试剂盒 DP431 RNAprep pure 动物组织总 RNA提取 试剂盒 DP432 RNAprep pure 植物总RNA 提取试剂盒 DP433 RNAprep pure 血液总RNA 提取试剂盒 DP420 RNAprep pure 微量总RNA 提取试剂盒 TRNzolA 总RNA提取试剂 RNAprep pure 总RNA提取试剂盒 1 样品预处理方式相同 2 裂解原理不同 3 RNA纯化原理不同： TRNzolA：有机溶剂抽提，异丙醇沉淀 RNAprep pure：硅基质吸附膜分离纯化 分析比较 方法方法提取材料 提取材料毒性毒性操作操作时间时间时间时间RNARNA质质质质量量 TRNzolA 系列 血液、细细胞、动动物组组 织织 1.5 h RNAsimple 血液、细细胞、动动物组组 织织 1.5 h RNAprep pure系列 血液、细细胞、动动物组组 织织 20-30 min RNA提取方法比较 材料处理量RNA得率 人白细胞7107 cells15-20 ug 成纤维细 胞1106 cells5-7 ug 上皮细胞1106 cells8-15 ug 材料 处处理量 总总RNA产产量 OD260 / OD280 人类类全血 250ul 2.64.0 ug 1.9 - 2.1 RNA提取得率比较 大鼠组织组织样样品量总总RNA量（g）OD260 / OD280 脑 10 mg 8 1.9-2.1 心脏 10 mg 10 1.9-2.1 肾脏10 mg 351.9-2.1 肝脏 10 mg 40 1.