i第九章 维生素类药物_ppt课件

单击此处编辑母版标题样式 单击此处编辑母版副标题样式 *1 The analysis of vitamins Chapter 9 维生素类药物的分析 第九章 The analysis of vitamin A The analysis of vitamin E The analysis of thiamine (B1) The analysis of L-ascorbic acid(C) The structures of other vitamins 基本要求 掌握维生素A的结构，主要化学性质、鉴别反应 及含量测定中的紫外分光光度法 了解三氯化锑比色法 掌握维生素E的结构、主要化学性质、鉴别反应 及含量测定中的气相色谱法 了解其他含量测定的方法 掌握维生素B1结构、性质、鉴别试 验及含量测定方法中的非水滴定法 了解其他含量测定方法 掌握维生素C结构、性质、鉴别试验 及含量测定中的碘量法 了解其他含量测定方法 了解HPLC在复方维生素测定中的应 用 Fundamental requirement Mastering the structures, the main chemical properties, identification tests and the application of UV spectroscopy in assays of vitamin A. Understanding the colorimetric method of antimonic chloride. Mastering the structure, the main chemical properties, identification tests and the application of GC in assays of vitamin E. Understanding other assays of vitamin E. Mastering the structure, properties, identification tests and the non-aqueous titration of thiamine. Understanding other assays of thiamine. Mastering the structure, properties, identification tests and the iodometric titration of L-ascorbic acid. Understanding other assays of L-ascorbic acid. Understanding the application of HPLC in compound vitamins analysis. Crystal form R Empirical formula Molecular weight Melting point H（Retinol） COCH3 (Retinyl acetate) COC15H31 (Retinyl Palmitate) C20H30O C22H32O2 C36H60O2 286.44 328.48 524.84 Pale yellow prisms Amorphism or crystal 6264 5758 2829 1.Ultraviolet absorption 维生素A分子中具有共轭多烯醇侧链结构，在325328nm 有强烈最大吸收。 2.Easily oxidation 维生素A 中有多个不饱和键，性质不稳定，易被氧化，易 被紫外光裂解，特别在加热和金属离子存在时，更易氧化变 质，生成无生物活性的环氧化物维生素A醛及维生素A酸。 3.Color reaction with antimonic chloride 维生素A在氯仿中能与三氯化锑试剂作用，产生不稳定的蓝 色 4.Solubility 维生素A能与氯仿、乙醚、环己烷或石油醚任意混合，在 乙醇中微溶，在水中不溶 v Identification tests 1.Carr-Price reaction (三氯化锑反应） 维生素A在饱和无水三氯化锑的无醇氯仿溶液中， 即显蓝色，渐变成紫红色。 Mechanism of reaction： . 2.Ultraviolet absorption spectrum 维生素A分子中含有5个共轭双键，其无水 乙醇溶液在波长326nm处有最大吸收峰。当在 盐酸催化下加热，则发生去水反应生成脱水维 生素A，比维生素A多一个共轭双键，故其最 大吸收峰往长波方向移动，同时在350nm 390nm波长之间出现3个最大吸收峰。 维生素A和去水 维生素A的紫外 吸收光谱 1.维生素A 2.去水维生素A 3.Thin-layer chromatography BP(1998)鉴别浓缩合成品维生素A（油剂）的 各种酯类的方法: 以硅胶G为吸附剂，环己烷-乙醚（80：20）为流动 相，以供试品与标准品的环己烷溶液点样，以三氯化 锑显色，比较供试品溶液和对照品溶液所显蓝色斑点 的位置，即可鉴别。 USP(24)采用的方法: 以硅胶为吸附剂，环己烷-乙醚（80：20）为流动 相，维生素A的氯仿溶液点样，以磷钼酸为显色剂。 v Assays Ultraviolet absorption method (three-point geometric correction method ) 紫外分光光度法（三点校正法） Colorimetric method of antimonic chloride 三氯化锑比色法 Ultraviolet absorption method Principle This method is based on measurement of absorption of a solution of retinol in isopropanol at 325nm, where absorbance is maximum. The method is applicable to pharmaceutical preparations and vitamin A concentrates in which vitamin A content is relatively high and amounts of substances causing irrelevant absorption are relatively small and can be corrected for by taking additional readings at 310nm and 334nm. Care must be exercised in using the correction since it does not apply for some preparations. If tocopherol is present (absorption maximum, 298nm), a correction is made employing a hydrogenation technique to destroy absorption due to retinol. Solutions with appreciable carotenoids are purified by chromatography, but carotenoids are generally not a problem in samples to which this method is applied. 目前各国药典均采用紫外分光光度法（三点校正法）测定维生 素A的含量。维生素A在325 328nm波长之间具有最大吸收峰， 可用以含量测定，其最大吸收峰的位置随溶剂不同而异。 维生素A醋酸酯 维生素A醇 溶剂 max,nm E1%1cm 换算因数 max,nm E1%1cm 换算因数 环己烷 327.5 1530 1900 326.5 1755 1900 异丙醇 325 1600 1830 325 1820 1830 本法的测定结果较能正确的反映出维生素A的真实生物效价。 由于维生素A制剂中含有稀释用油和维生素A原料中混有其他 杂质，所以，测得的吸收度不是维生素A所独有。为了消出误差 ，应用校正公式进行校正。 Method 如供试品中干扰测定的杂质较少，可以直接用溶剂 溶解供试品后测定。否则应照皂化法测定含量。 原 理： 杂质的吸收在310340nm波长范围内呈一条直线， 且随波长的增大吸收度变小。 The absorption of impurities is linear between 310nm and 340nm. The absorbance decreases while the wavelength increases. 物质对光的吸收具有加和性。 The absorption has additivity. 1.三点波长的选择法 2. Three wavelengths selection 1.第1点：选择维生素A的最大吸收波长（即1） 2.第2点和第3点：在最大吸收波长的两侧各选一点（ 2和3） 3. 等波长差法：在1的左右各选一点为2和3，使 3-11-2。中国药典（2000年版）测定维生素A醋酸 酯时，规定1328nm, 2316nm, 3340nm。 4. 等吸收度法：在1的左右各选一点为2和3，使 A2=A3=6/7A1。中国药典（2000年版）测定维生素 A醇时，规定1325nm, 2310nm, 3334nm。 The absorption of impurities 1.对维生素A的测定有影响的杂质： 维生素A2和维生素A3(dehydroretinol and anhydroretinol)：维生素A2在345350nm波长范围内有 吸收。 维生素A的氧化产物：环氧化物、维生素A醛和维生 素A酸。 维生素A在光照下产生的无生物活性的聚合物鲸醇。 维生素A的的异构体。 合成时产生的中间体。 这些杂质在310340nm波长范围内有吸收，因此， 在测定维生素A的含量时，必须考虑这些杂质的干扰。 三点校正法可以消除这些杂质的影响。 测定法 第一法（适用于维生素A醋酸酯） 方法 计算法 关于换算因数 A值的选择法 第二法（适用于维生素A醇） 测定方法 计算法 A值的选用法 Method 取维生素A醋酸酯，精密称定，加环己烷制成 每1ml中含有915单位的溶液。 在300、316、328、340、360nm五个波长处分 别测定吸收值，确定最大吸收波长（应为 328nm）。 计算各波长下的吸收度与328nm波长下的吸收 度的比值。 第一法 但式中的A值有两种可能，一是直接采用328nm波长下 测得的吸收度值，即A328；另一种可能是采用吸收度 校正公式计算出的校正值，即A328（校正）。 求效价（IU/g） 效价系指每克供试品中所含维生素A的国际单位数 （IU/g）。 IU/g= E1%1cm1900,式中1900为维生素A醋酸 酯在环己烷溶液中的换算因数。 E1%1cm= A CL 求E1%1cm ： 用A=E1%1cmCL公式求得 （式一） Calculation 第一法 求维生素A醋酸酯胶丸为标示量的百分含量： 标示量%= AD1900W W100L标示量 100% A为直接测得的A328或校正后的A328 D为供试品的稀释倍数 ； 1900为换算因数； W为胶丸的平均内容物重量；W为称取 的内容物重量；L为比色池厚度（cm）； 第一法 Conversion factor 换算因数的定义为每1个E1%1cm数值所相当的效价。即： 换算因数= 效价（IU/g） E1%1cm（max） 维生素A的含量是用生物效价国际单位（IU/g）表示。 维生素A的国际单位规定如下： 1IU=0.344g维生素A醋酸酯 1IU=0.300g维生素A醇 因此，1g维生素A醋酸酯相当于的国际单位数为： 1106g 0.344g/ IU =2 907 000 IU 1g维生素醇相当的国际单位数为： 1106g 0.300g/ IU =3 330 000 IU 第一法 The selection of A 将五个波长处吸收度比值（即Ai/A328）分别与中国药 典（2000年版）规定的吸收度比值相减，即得到五个 差值。判断每个差值是否超过规定的0.02。 波长(nm) 测得吸收度 吸收度比值 两个比值的差值 药典规定值 计算值 （规定0.02） 300 A0 0.555 A0/A2 316 A1 0.907 A1/A2 328 A2 1.000 A2/A2 340 A3 0.811 A3/A2 360 A4 0.299 A4/A2 第一法 如果最大吸收波长在326329nm之间，并计算得到 的五个波长下的差值，均不超过0.02时，则不用校正 公式计算吸收度，而直接用在328nm波长处测得的吸 收度A328代入 （式一）求出E1%1cm。 如果最大吸收波长在326329nm之间，但计算得到 的波长下的差值，有一个或几个超过0.02，这时，应 按下面的方法判断： 若 A328（校正）A328 A328 100%所得的数值在3%， 则仍不用校正公式计算吸收度，而直接用A328代入 公式中求出E1%1cm； 判断法 第一法 若 A328（校正）A328 A328 100% 所得的数值在 15%3%之间，则需用校正公式算吸收度，即用 A328（校正）代入公式中求出E1%1cm； 若 A328（校正）A328 100%所得的数值小于15% 或大于3%，则不能用本法测定，而采用后面的第2法 （皂化法）测定含量。 A328 第一法 如果最大吸收波长不在326329nm之间，则不能用本 法，而应采用后面的第2法（皂化法）测定含量。 用第2法测定 用A328（校正）计算 用A328计算 用第2法计算 第一校正法的公式为 ： A328（校正）=3.52（2 A328A316A340） 第一法 0.0215%3%3% 用紫外分光光度法（三点校正法）测定维 生素A醋酸酯胶丸含量时：取内容物39.1mg， 加环己烷溶解并稀释至100ml，在下列波长下 测定吸收度为：300nm：0.390；316nm：0.607 ；328nm：0.671；340nm：0.550；360nm： 0.224。已知胶丸内容物平均重量为0.08736g、 胶丸标示量为3000IU/丸。试求：标示量%=？ 第一法 Exercises Method 精密称取一定量供试品，加氢氧化钾乙醇溶液 后煮沸回流，得到皂化液。 经乙醚提取、洗涤、滤过、浓缩和干燥等处理 ，最后用异丙醇溶解残渣并稀释成每1ml中含 维生素A为915单位的溶液。 在300、310、325、334nm四个波长处测定吸收 度，并确定最大吸收波长（应为325nm）。 第二法 公式中的A值，可能是325nm波长下测得的吸收度A325 ，也可能是用校正公式计算出的吸收度校正值A325（校正 ）。 E1%1cm= A CL 求E1%1cm ： 用A=E1%1cmCL公式求得 （式一） 求效价（IU/g） 求维生素A醇胶丸的标示量百分含量： IU/g= E1%1cm1820 标示量%= AD1820W W100L标示量 100% 第二法 Calculation The selection of A 如果最大吸收波长在323327nm之间，而且A300/A325的 比值小于或等于0.73，按下法判断： 1.若 A325（校正）A325 A325 100%所得的数值在3%， 则仍不用校正公式计算吸收度，而直接用A325代入 （式一）中求出E1%1cm； 2.若所得的数值超过3%，则需用校正公式计算吸收 度，即用A325（校正）代入式中求E1%1cm。 3.如果最大吸收波长不在323327nm之间或A300/A325的 比值，大于0.73时，表示供试品中杂质含量过高，应采用 色谱法将未皂化部分纯化后再进行测定。 第二法校正公式：A325（校正）=6.815 A3252.555 A3104.260 A334 第二法 Explanation 维生素A醋酸酯的吸收度校正公式是用直线方程式 法（即代数法）推导出来的；维生素A醇的吸收度 校正公式是用相似三角形法（几何法或6/7定位法） 推导出来的。 在应用三点校正法时，除其中一点在最大吸收波长 处测定外，其余两点均在最大吸峰的两侧上升或下 降陡部的波长处进行测定。仪器波长的准确度，会 影响测定，故在测定前务必要校正波长。 中国药典收载的维生素A胶丸、维生素AD滴剂、维 生素AD胶丸等均采用本法测定含量。 第二法 Colorimetric method The assay is based on the measurement of the unstable blue color resulting from reaction of vitamin A and antimony chloride in non- aqueous chloroform. Within certain limits, absorbance at 620nm is a function of vitamin A concentration. Principle 1.Some critical points of the method are: freedom from moisture (with SbCl3 reagent); subdued light conditions; and removal of carotenoids in the final extract before colorimetry, or correction for them. 2.原理：维生素A与三氯化锑的无水氯仿溶液作用， 产生不稳定的蓝色，在618620nm波长处有最大吸收 ，符合Beer定律。 1.颜色稳定性: 产生的蓝色不稳定，要求操作迅速， 一般规定加入三氯化锑后应在510s内测定 。 2.无水: 反应介质需无水，否则使三氯化锑水解产生 SbOCl而使溶液混浊，影响比色。 3.温度: 温度对呈色影响很大，样品测定时的温度与 绘制标准曲线时温度相差应在1以内。 4. 专属性: 本反应并非维生素A专属，在相同条件下 ，某些有关物质均与三氯化锑显蓝色，干扰测定， 使结果偏高。 三氯化锑试剂有强的腐蚀性，易损坏皮肤和仪器。 Precaution The analysis of vitamin E The structure and properties The structure The physical and chemical properties The identification tests Test for free tocopherol Assays Gas chromatography Ceriumetric titration HPLC Section 2 v Structure It has , and four isomers. The physiological action of -isomer is the strongest of all. 苯并二氢吡喃醇衍生物 v Properties Solubility 维生素E为微黄色或黄色透明的粘稠液体，易溶于乙醇 、丙酮、乙醚、石油醚中, 不溶于水 . Ultraviolet absorption 本品结构中苯环上有酚羟基，故有紫外吸收，其无水 乙醇液在284 nm波长下有最大吸收，其吸收系数为41.0 45.0. Oxidation 在无氧或其他氧化剂存在时，在酸性或碱性溶液中， 加热可水解生成游离生育酚；在有氧或其他氧化剂存在时 ，则进一步氧化成醌型化合物。在碱性条件下加热，这种 氧化作用更易发生。 v Identification tests Nitric acid reaction Redox after hydrolyzing reaction Ultraviolet spectroscopy Thin-layer chromatography Nitric acid reaction 本品约30mg 加无水乙醇10ml 溶 解 加硝酸2ml 溶 液 （橙红色 ） 加热15min 75 Drugs 30mg non-aqueous ethanol 10ml Dissolving nitric acid 2ml Solution （salmon ） Heating 15min 75 水解后氧化反应 本品约10mg 醇制KOH试液2ml 煮沸5min 放冷 加水4ml 乙醚10ml 振摇静置 溶液分层 （取乙醚液2ml） 加2，2-联吡啶 乙醇溶液 三氯化铁 乙醇溶液 溶 液 (血红色) Redox after hydrolyzing reaction Drugs about 10mg Potassium hydroxide solution 2ml Boiling 5min Cooling Adding water 4ml ether 10ml Shaking and standing ether solution Adding 2，2-dipyridine Ethanol solution Ferric chloride Ethanol solution Solution (sanguine) Prepared by ethanol Ultraviolet spectrum 本品的0.01%无水乙醇液在波长284nm处有 最大吸收；在波长254nm处有最小吸收，可资 鉴别。 Thin-layer chromatography 将供试品点于硅胶G薄层板上，以环己烷- 乙醚（4：1）为展开剂，展开1015cm后，取 出，于空气中晾干，喷以浓硫酸，在105加 热5min，-生育酚、-生育酚醋酸酯、-生育 醌的Rf值分别为0.5、0.7和0.9。 v Impurities: free tocopherol 利用游离生育酚的还原性，用硫酸铈滴定 液（0.01mol/L）滴定，以二苯胺为指示剂 。中国药典维生素E其中所含的游离生育酚 不得超过2.15%BP(1998)规定不得超过 1.0%。 Tocopherol is titrated by cerium sulfate .The indicator is diphenylamine .In Chp,vitamin E contains not more than 2.15 percent of free tocopherol , v Assays Gas chromatography Ceriumetric titration High-performance liquid chromatography Determination of vitamin A and vitamin E in human serum by RP-HPLC Gas chromatography Conditions and system suitability Carrier gas: nitrogen. Stationary phase: silicone (OV-17) . Support : diatomaceous earth, which is washed by acid and then silanized. Column temperature: 265. Detector : flame ionization detector. Column efficiency above 500 (vitamine E). Resolution: between the peaks of vitamine E and the internal standard substance is more than 2. 校正因子测定 取正三十二烷适量，加正己烷溶解并稀释成每1ml中含 1.0mg的溶液，摇匀，作为内标溶液。另取维生素E对照品 约20mg，精密称定，置棕色具塞锥形瓶中，精密加入内 标溶液10ml。密塞，振摇使溶解，取13l注入气相色谱 仪，计算校正因子 。 测定方法 取本品约20mg，精密称定，置棕色具塞锥形瓶中，精 密加入内标溶液10ml，密塞，振摇使溶解；取13l注入 气相色谱仪，测定，计算，即得。 Calculation 校正因子（f）= As/ms Ar/mr As内标物质的峰高或峰面积 Ar对照品的峰高或峰面积 ms 加入内标物质的量,mg mr加入对照品的量,mg 含量（mx）= f Ax As /ms Ax供试品峰高或峰面积 As 内标物质得峰高或峰面积 mx供试品的量，mg ms、 f 意义同上 Ceriumetric titration (ChP77) 由于硫酸铈溶于酸性水而不溶于醇，游离生育酚溶 于醇而不溶于水，因此，在滴定中两者有析出的可 能，使终点不明显，影响测定结果。 本法仅适用于纯度高的维生素E，对于杂质较多的 供试品采用本法时，由于终点不明显而使结果不准 确。 本法必须先将维生素E水解成生育酚后才能测定。 Characteristics Discussion 由于硫酸铈溶于酸性水而不溶于醇，游离生育酚溶 于醇而不溶于水，故溶液需有一定量的乙醇，乙醇浓 度太高或太低均使硫酸铈和生育酚析出，使终点不明 显，影响测定结果。 Principle 2+ Circumfluence High performance liquid chromatography (JP13) 色谱条件 色谱柱为内径4mm，长1530cm 的不锈钢柱，填充以粒径510m 的十八烷基 键合硅胶固定相。流动相为甲醇-水（49:1）， 紫外检测器，波长为292nm。生育酚比醋酸生 育酚先出峰，且二峰的分离度应大于2.6。 重现性试验：重复试验3次，峰高的相对标准 偏差小于0.8 。 Principles A gaseous mobile phase flows under pressure through a heated tube either coated with a liquid stationary phase or packed with liquid stationary phase coated onto a solid support. The analyte is loaded onto the head of the column via a heated injection port where it evaporates. It then condenses at the head of the column, which is at a lower temperature. The oven temperature is then either held constant or programmed to rise gradually. Once on the column separation of a mixture occurs according to the relative lengths of time spent by its components in the stationary phase. Monitoring of the column effluent can be carried out with a variety of detectors. G C Apparatus A gas chromatograph consists of a carrier gas source, an injection port, column, detector, and recording device. G C Applications 1.The identification of some unformulated drugs, particularly with regard to detection of process impurities. 2.Limit tests for solvent residues and other volatile impurities in drug substances. 3.Sometimes used for quantification of drugs in formulations, particularly if the drug lacks a chromophore. 4.Measurement of drugs and their metabolites in biological fluids. G C Advantages 1.Capable of the same quantitative accuracy and precision as high-pressure liquid chromatography (HPLC), particularly when used in conjunction with an internal standard. 2.Has much greater separating power than HPLC when used with capillary columns. 3.Readily automated. 4.Can be used to determine compounds which lack chromophores. 5.The mobile phase does not vary and does not require disposal and, even if helium is used as a carrier gas, is cheap compared to the organic solvents used in HPLC. G C Limitations 1.Only thermally stable and volatile compounds can be analyzed. 2.The sample may require derivatisation to convert it to a volatile form, thus introducing an extra step in analysis and, potentially, interferants. 3.Quantitative sample introduction is more difficult because of the small volumes of sample injected. 4.Aqueous solutions and salts cannot be injected into the instrument. G C The analysis of thiamine The structure and properties structure properties The identification tests Assays Non-aqueous titration Silicotungstic acid gravimetric method Ultraviolet spectroscopy Thiochrome-fluorescence Section 3 v Structure 由氨基嘧啶环和噻唑环通过亚甲基连接而成的季铵化 合物，噻唑环上季铵及嘧啶环上氨基，为两个碱性基 团，可与酸成盐。 v Properties Solubility 本品在水中易溶，水溶液显酸性反应；在乙醇中微溶， 在乙醚中不溶； Ultraviolet absorption 本品的12.5g/ml盐酸溶液（91000），在246nm波长处 测定吸收度，吸收系数为406436。 Oxidation 在碱性中，遇氧化剂铁氰化钾可被氧化为具有荧光的硫 色素，后者溶于正丁醇中显蓝色荧光。 Reaction with alkaloid precipitation reagents 分子中含有两个杂环（嘧啶和噻唑环）可与某些生物碱 沉淀试剂反应生成组分恒定的沉淀。 v Identification tests Thiochrome reaction 维生素B1在碱性溶液中，可被铁氰化钾氧化生成 硫色素。硫色素溶于正丁醇显蓝色荧光。 Precipitation reaction 维生素B1与碘化汞钾生成淡黄色沉淀BH2HgI4。 维生素B1与碘生成红色沉淀BHII2。 维生素B1与硅钨酸生成白色沉淀 B2SiO2(OH)212WO34H2O。 维生素B1与苦酮酸生成扇形白色结晶。 v Assays Non-aqueous titration 中国药典(2000)用本法测定维生素B1原料的含量。 Principle： 维生素B1分子中含有两个碱性的已成盐的伯胺和季 铵基团，在非水溶液中，在醋酸汞存在下，均可与高 氯酸作用。根据消耗高氯酸的量即可计算维生素B1的 含量。 Titer： 每1ml的高氯酸滴定液（0.1mol/L）相当于16.86mg 的C12H17ClN4OSHCl。 Silicotungstic acid gravimetric method (ChP90) Principle： 维生素B1在酸性溶液中与硅钨酸作用产生 沉淀，根据沉淀的重量和供试品的重量即可计 算含量。 Titer： 1g沉淀相当于0.1939g维生素B1。 取样量宜在50mg左右，不得少于25mg，否则产生的 误差大。 干燥温度恒定在80，以保证生成的沉淀含4分子结 晶水，使换算因数为0.1939。 为了得到易过滤的沉淀，在酸性溶液中进行沉淀。 酸量不足时，所得沉淀过细，可通过过滤器造成损 失；酸量稍过则无妨碍，因为维生素B1在酸性溶液 中稳定。 硅钨酸用量与维生素B1的量为8：1。若试剂量太少 则结果偏低；如硅钨酸不纯，则需增加用量。 其他因素如沉淀剂加入的快慢、煮沸时间长短及沉 淀的洗涤等，也直接影响测定的结果。 Conditions Principle 维生素B1分子中具有共轭双键结构，故具紫 外吸收，在一定波长下测定吸收度即可定量。 Application 中国药典（2000年版）收载的维生素B1片和 维生素B1注射液，均采用本法测定。 Ultraviolet spectroscopy Thiochrome-fluorescence (USP) 原 理 硫色素反应为维生素B1的专属反应，在一定 条件下形成的硫色素与维生素B1浓度成正比， 可用于维生素B1及制剂的含量测定。 Principle: Under basic conditions, reaction with ferricyanide, thiamine could be oxidized to form thiochrome, which possesses specific fluorescence ( blue , 435nm) after extracted by isobutyl alcohol. Extraction Conversion to thiochrome Separation of thio- chrome solution Preparatio n of blank Measurement of thiochrome Calculation Procedure: Fluorescence spectrophotometry Certain molecules, particularly those with a chromophore and a rigid structure, can be excited by UV/visible radiation, and will then emit the radiation absorbed at a longer wavelength. The radiation emitted can then be measured. Principles: Instrumentation Figure 7.2 shows a schematic diagram of a fluorescence spectrophotometer. Emission is observed at right angles to the light being used to excite the sample. The instrument has two monochromators: one to select the wavelength to be used for excitation of the sample, the other to scan the wavelength range of the light emitted by the sample. 1.1.If the concentration of a solution prepared for fluorescence measurement is too high, some of the light emitted by the sample as fluorescence will be reabsorbed by other unexcited molecules in solution. 2.2.Heavy atoms in solution quench fluorescence by colliding with excited molecules so that their energy is dissipated. 3.3.Formation of a chemical complex with other molecules in solution can change fluorescence behavior. Factors interfering with fluorescence intensity 1. Determination of fluorescent drugs in low-dose formulations in the presence non-fluorescent excipients. 2. In carrying out limit tests where the impurity is fluorescent or can be simply rendered fluorescent. 3. Widely used in bioanalysis for measuring small amounts of drug and for studying drug-protein binding. Applications Strengths A selective detection method and can be used to quantify a strongly fluorescent compound in the presence of a larger amount of non-fluorescent material. Limitations The technique only applies to a limited number of molecules. Fluorescence is subject to interference by UV absorbing species, heavy ions in solution, and is affected by temperature. The analysis of L-ascorbic acid The structures and properties The structure The physical and chemical properties The identification tests Assays Iodometric titration 2,6-dichloroindophenol titration High performance liquid chromatography Section 4 v Structure 具有二烯醇结构, 内酯环，二个手性碳原子（C4、 C5）， 抗坏血酸性质极为活泼，且具有旋光性。 v Properties Solubility 维生素C在水中易溶，水溶液呈酸性；在乙醇中略溶， 在氯仿或乙醚中不溶。 The characteristics of glucose Reduction 分子中的二烯醇基具极强的还原性，易被氧化为二酮基 而成为去氢抗坏血酸，加氢又可还原为抗坏血酸。在碱性 溶液或强酸性溶液中能进一步水解为二酮古罗糖酸。 Hydrolysis 维生素C和碳酸钠作用可生成单钠盐，不致发生水解， 因双键使内酯环稳定，但在强碱中，内酯环可水解，生成 酮酸盐。 Acidity C3-OH由于受共轭效应的影响，酸性较强（pK1=4.