[临床医学]pcr技术在乙肝方面的应用

PCR技术在乙肝方面的应用 The application of PCR technique in HBV 涿州市医院检验科 刘鹏年 Hepatitis B Virus 乙型肝炎的病原体 在全世界广泛流行，估计全球半数以上人 口已被HBV感染过。 中国：乙肝高发区，人群HBsAg的检出率 达9.8% 乙型肝炎病毒感染的现状 全球约有3.5亿人感染乙型肝炎病毒，中国有 1.2亿人感染，其中每年约有1-2%会出现肝硬 化或肝癌而死亡。乙型肝炎是一种严重危害人 类健康的传染病，它是由乙肝病毒(HBV)感染 引起的。全世界乙肝携带者达5亿之多，我国是 乙肝携带者高于人群的10。急性乙肝中有 20%会转为慢性，进而可能发展为肝硬化和肝 癌，因此，准确、迅速诊断对乙肝的治疗和预 后显得极为重要。 乙型肝炎病毒属嗜肝DNA病毒科（ hepadnaviridae），基因组长度3.2kb 目前感染人类最小的DNA病毒 部分双链环状DNA。 HBV基 因 及 编 码 蛋 白 Hepatitis B Virus 乙肝的实验室诊断 （一）生化学检查 （二）HBV血清学检查 （三）HBV DNA、基因型和变异检查 生化学检查生化学检查 ALTALT和和ASTAST 血清胆红素血清胆红素 凝血酶原时间（凝血酶原时间（PTPT）及）及PTAPTA 胆碱酯酶胆碱酯酶 血清白蛋白血清白蛋白 甲胎蛋白（甲胎蛋白（AFPAFP） 生化检测的局限性 敏感度有限 代表肝细胞损害，水平高低不能代表肝储 备能力 关于“胆酶分离”现象 HBV血清学检查 项目：HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗- HBe、抗-HBc以及抗-HBc IgM 方法 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay，最常用，定性) 发光免疫分析(定量) HBsAg 感染的标志 Anti-HBs 既往感染/接种疫苗 Anti-HBc IgM 急性感染标志 Anti-HBc IgG 既往或慢性感染 HBeAg 急性病毒复制，有传染性 Anti-HBe 病毒不再复制 HBV-DNA 急性病毒复制，比HBeAg更准 确；主要用于监测治疗反应 血清学检测的临床意义 HBsAg 抗-HBs HBeAg 抗-HBe 抗-HBc 临床意义 急性或慢性感染(大三阳)+-+-+ + 乙肝后期或慢性感染(小三阳) - +- 潜伏期或急性乙肝早期 -+ 痊愈或恢复期,有免疫力 - - + + + - - 痊愈,有免疫力 疫苗接种或曾经感染过,有免疫力 血清学检测的局限性 HBV具有“检测窗口期” 假阴性结果 无法检测突变株及抗体 Symptoms HBeAg anti-HBe IgG anti-HBc IgM anti-HBc anti-HBs HBsAg 0481216202428323652100 Acute HBV Infection with Recovery Typical Serologic Course Weeks after Exposure Titre IgM anti-HBc IgG anti-HBc HBsAg Acute (6 months) HBeAg Chronic (Years) anti-HBe 048 12 16 20 24 28 32 3652Years Weeks after Exposure Titre Progression to Chronic HBV Infection Typical Serologic Course PCR技术检测HBV DNA PCR 聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus公司的 K.Mullis建立，并和定点突变的发明者M.Smith 一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学 领域的研究开创了崭新时代。 PCR概念 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链 式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板， 以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤， 体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一 项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外 扩增任何目的DNA。 PCR反应的特点 特异性强 引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性 灵敏度高 指数增长，从pg (10-12)可扩增至 mg (10-6)水平 简便、快速 2小时完成扩增 对标本的纯度要求低 DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板 PCR反应过程 DNA的体外复制包括3个步骤： 变性（denaturation）:94 C 30s 退火（annealing）:55 C 30s 延伸（extension）:72 C 30-60s 3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成 一个循环，一个分子的模板被复制为二个 ，产物量以指数形式增长。 普通PCR技术的缺点 普通PCR临床检测技术虽然解决了检出率低、周 期长的问题，但由于假阳性率高，不能正确指 导临床实践。 因此国家卫生部曾在1997年行文禁止将普通PCR 技术用于临床诊断。 定量PCR的特点 采用闭管检测，不需PCR后处理，并采用 dUTP-UNG酶的防污染系统，扩增和检测一次 同时完成。不需开盖，不产生污染。 避免了假 阳性。 探针与被检DNA序列特异杂交， 增强了特异 性。 定量PCR的特点 可定量结果，准确灵敏地反应了病原体的感可定量结果，准确灵敏地反应了病原体的感 染和治疗恢复情况。染和治疗恢复情况。 光谱分析仪直读结果，自动分析，光谱分析仪直读结果，自动分析， 增强了灵增强了灵 敏性和客观性。敏性和客观性。 HBV DNA检测方法的比较 斑点杂交斑点杂交 PCR PCR 定量定量PCRPCR 敏感性敏感性 低低 较高 较高 高 高 特异性特异性 高高 稍低稍低 高高 重复性重复性 好好 稍差稍差 好好 定量范围定量范围 4 6 64 6 6 简便简便 较繁琐较繁琐 简便简便 简便简便 安全性安全性 好好 稍差稍差 好好 设备设备 便宜便宜 稍贵稍贵 昂贵昂贵 技术要求技术要求 低低 高高 高高 检测价格检测价格 低低 中中 高高 为什么建议每个病人都要进行 HBV DNA检测？ HBV DNAHBV DNA检测的临床意义检测的临床意义 诊断方面：诊断方面： HBV DNAHBV DNA是是HBVHBV存在最直接的依据存在最直接的依据 HBV DNAHBV DNA是是HBVHBV复制的标志复制的标志 HBV DNAHBV DNA是患者具有传染性的标志是患者具有传染性的标志 HBV DNA检测的临床意义 对对HBV-MHBV-M起补充作用：起补充作用： HBeAgHBeAg()/ ()/ 抗抗HBeHBe()()乙型肝炎乙型肝炎 （前（前C C区变异）区变异） HBsAgHBsAg()()乙型肝炎乙型肝炎 （S S区变异）区变异） 低水平感染低水平感染 单项抗单项抗HBcHBc()()乙型肝炎乙型肝炎 HBV基 因 及 编 码 蛋 白 HBV DNA检测的临床意义 疗效判断：疗效判断： HBV HBV DNADNA是目前判断乙肝抗病毒药是目前判断乙肝抗病毒药 物疗效最敏感的指标物疗效最敏感的指标 预后判断预后判断 HBV DNAHBV DNA水平与病情有一定的关系水平与病情有一定的关系 HBV-MHBV-M与与HBV DNAHBV DNA关系关系 广东广东 四川四川 湖南湖南 解放军解放军 南方医院南方医院 “ “ 大三阳大三阳” ” 86.286.2 85.0 87.3 94.38 93.4 85.0 87.3 94.38 93.4 “ “小三阳小三阳” ” 35.1 20.3 25.6 27.3 23.835.1 20.3 25.6 27.3 23.8 “ “ 小二阳小二阳” ” 40.7 27.6 48.8 38.56 30.540.7 27.6 48.8 38.56 30.5 抗抗HBcHBc 11.5 10.8 11.5 10.8 19.319.3 抗抗HBsHBs 3.6 0 9.7 0 3.6 0 9.7 0 三抗体阳三抗体阳 5.0 1.1 10.05.0 1.1 10.0 全阴全阴 0 4.00 4.0 调查总例数调查总例数 1474 2828 814 838 7731474 2828 814 838 773 HBV DNAHBV DNA阳性率阳性率 HBV DNA检测的临床意义 调查表明并不是所有调查表明并不是所有“ “大三阳大三阳” ”的病的病 人都处于人都处于HBVHBV复制期，具有传染性；复制期，具有传染性； 也不是所有也不是所有“ “小三阳小三阳” ”的病人的病人HBVHBV都无都无 复制。因此，要准确知道复制。因此，要准确知道HBVHBV是否处是否处 于复制状态，最准确的方法还是通过检于复制状态，最准确的方法还是通过检 测测HBV DNAHBV DNA来决定。来决定。 HBV-DNA定量检测的临床应用 慢性乙肝诊断 治疗监测和疗效评价 跟踪随访 预后判断 HBV-DNA定量 慢性乙肝的诊断 HBsAg阳性六个月以上 ALT持续升高或反复升高 HBV-DNA大于105拷贝/毫升（HBeAg阳 性）或104拷贝/毫升（HBeAg阴性） HBV-DNA定量 慢性乙肝的治疗监测 治疗前检测患者的基线水平（ALT、HBV -DNA） 治疗开始后前三个月每月一次、以后每三 个月一次检测ALT、HBV-DNA，对于 HBeAg阳性患者，还需检测HBeAg 如果治疗期间HBV-DNA水平降低两个数 量级，可以认为治疗有效 HBV-DNA定量 治疗后的随访 无论有否治疗应答，都应对患者定期随访 。建议停药后的前3个月每月1次、以后每 36个月1次检测ALT、AST、HBV血清 标志物和HBV DNA，以及临床表现和不 良反应。随访至少6-12个月。如病情有变 化，可随时随访。 HBV拉米夫定耐药 虽然拉米夫定治疗慢性乙肝疗效显著，但 长期使用拉米夫定会出现耐药现象 使用一年、二年、三年、四年的耐药比率 为：15-32%、38%、56%、67% 一旦出现拉米夫定耐药突变（YMDD变异 ），大多数患者会在2-4个月之内出现 HBV-DNA和ALT反弹 YMDD变异 YMDD YMDD 酪氨酸蛋氨酸天门冬酪氨酸蛋氨酸天门冬 氨酸天门冬氨酸氨酸天门冬氨酸。如发生。如发生YMDDYMDD变异变异 ，则其，则其中的蛋氨酸（中的蛋氨酸（MM）突变为异亮氨突变为异亮氨 酸（酸（isoleucineisoleucine，I I）或缬氨酸（或缬氨酸（valinevaline， V V）形成形成YIDDYIDD变异株或变异株或YVDDYVDD变异株变异株 。 YMDDYMDD位于位于HBVHBV多聚酶的关键功能区多聚酶的关键功能区。 YMDD变异检测 采用实时荧光定量PCR方法，不仅能够检 测出现的突变类型（YVDD或YIDD）， 而且能够确定突变株所占比例，对及时调 整治疗方案具有非常重要的意义 能够准确稳定的检测到1%的突变株，能 够更早发现耐药突变，尽早调整治疗方案 HBV 拉米夫定耐药突变检测原理 Primer F Primer F Primer F Probe Probe Probe Primer HBV Primer YIDD Primer YVDD HBV检测 I突变检测 V突变检测 什么时候开始检测YMDD变异 拉米夫定治疗过程中YMDD变异情况 治疗时间 HBV DNA大于104copies/ml例数 YMDD变异例数* 6个月 61（17%） 612个月2614（54%） 1224个月3826（68%） 2436个月3838（100%） * 各组之间两两比较均有显著差异（P0.05）。 YMDD变异株的动态变化 YMDD变异株的动态变化 YMDD检测应用方法 对接受拉米夫定治疗的慢性乙肝患者进行 耐药监测 治疗前检测一次（约有10-20%的人在治 疗前就有YMDD变异） 治疗开始后第七个月开始，每三个月检测 一次 慢性乙肝的基因分型 乙肝病毒分八个基因型：根据基因组序列 的差异可以分为AH八种亚型，我国以B 型（41%）和C型（53%）为主 不同基因型病毒感染的病程和后果不同： C型对肝的损伤比B型严重，基因型C比基 因型B更容易发展成为肝硬化 不同的基因型对药物的应答也不一样：基 因型B比基因型C对干扰素治疗更敏感 共价闭合环状DNA (cccDNA)检测 HBV cccDNA是乙肝病毒前基因组RNA复 制的原始模板 只有彻底清除了cccDNA，乙肝的治疗才 能算真正有效 HBV cccDNA可作为评价抗病毒治疗效果 新的有效指标 HBV基 因 及 编 码 蛋 白 阿德福韦治疗乙型肝炎 阿德福韦为5-单磷酸脱氧阿糖腺苷类似物，可明 显抑制HBV DNA复制 HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者，1、2、3年时的 耐药发生率分别为0%、1.6%、3.1% HBeAg阴性者1、2、3年的耐药发生率分别为 0%、3.0%、5.9%11% 1896突变的诊