中科院生物物理所2011-2015年细胞生物学考博真题及答案.pdf

6 简答简答 2-4 论述论述 CAS-ibp-2011 简答：简答： 1、iPS 诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPS cells）最初是日本人山中申弥（Shinya Yamanaka）于 2006 年利用病毒载体将四个转录因子（Oct4, Sox2, Klf4 和 c-Myc）的组合转 入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞（ES）的一种细胞类型。 在基础研究方面，它的出现，已经让人们对多能性的调控机制有了突破性的新认识。细胞重 编程是一个复杂的过程，除了受细胞内因子调控外，还受到细胞外信号通路的调控。对于 Oct4、Sox2 和 Nanog 等维持干细胞自我新能力的转录因子的研究正在逐渐地展开；利用 iPS 干细胞作为实验模型， 只操纵几个因子的表达， 这更会大大加速对多能性调控机理的深入研 究。 在实际应用方面，iPS 干细胞的获得方法相对简单和稳定，不需要使用卵细胞或者胚胎。这 在技术上和伦理上都比其他方法更有优势，iPS 干细胞的建立进一步拉近了干细胞和临床疾 病治疗的距离，iPS 干细胞在细胞替代性治疗以及发病机理的研究、新药筛选方面具有巨大 的潜在价值。 2、脂筏、脂筏 定义： 以甘油磷脂为主的细胞质膜上富含胆固醇和鞘磷脂等形成相对有序的脂相， 如同漂浮 在脂双层上的脂筏。 近年来的研究表明, 脂筏( 包括质膜微囊) 具有如下主要的功能: 信号转导。从脂筏所含 有的蛋白质和脂类来看, 其中很多都是与细胞信号转导有关的组分, 为信号的起始和交叉作 用提供了一个结构平台。跨细胞运输。包括内吞和外排, 同时也包括胞外毒素、细菌以及 病毒的内吞。胆固醇的运送。维持胞内 Ca2+的稳态平衡。众所周知, 物质通过细胞膜的 内吞或外排或分泌都是以微囊形式来运送的。大量试验结果表明, 这些微囊表面富含脂筏结 构。同时脂筏是多种病原体进入宿主细胞的位点, 支持病毒粒子的组装和出芽, 其信号转导 功能一方面可以启动宿主细胞的保护性免疫应答, 另一方面也被病原体利用, 以利于病原体 的传播和疾病发生. 3、Autophag 4、核糖体功能、核糖体功能 核糖体功能是按照 mRNA 的指令将氨基酸合成蛋白质多肽链,所以核糖体是细胞内蛋白质合 成的分子机器 核糖体蛋白质与 RNA 的功能；核糖体上具有一系列蛋白质合成的结合位点与催化位点。 1A 部位：氨基酸部位或受位：主要在大亚基上，是接受氨酰基-tRNA 的部位。 2P 部位：肽基部位或供位：主要在小亚基上，是释放 tRNA 的部位。 3 E 位点：脱氨基 tRNA 完全释放的一个为点。 4肽酰基转移酶部位（肽合成酶） ，简称 T 因子：位于大亚基上，催化氨基酸间形成肽键， 使肽链延长。 5GTP 酶部位：即转位酶（EF-G） ，简称 G 因子，对 GTP 具有活性，催化肽键从供体部位 受体部位。 6. 与 mRNA 结合的位点，原核生物 16sRNA 3-端 SD 序列；真核生物无 SD 序列，依靠 5-端 帽子结构和扫描机制识别起始密码子。 5、端粒酶功能 Hayflik 界限：正常的体外培养的细胞寿命不是无限的，只能进行有限次数的增殖 端粒（英文名：Telomeres）是细胞线状染色体末端的一小段由重复 DNA 序列和-相关蛋白质 组成的一种特殊结构。具有稳定染色体结构及完整性的功能。 端粒酶（Telomerase）是一种核糖核蛋白，端粒酶能以自身所携带 RNA 为模板延长缩短的端 粒重复序列从而增强体外细胞的增殖能力。 端粒酶在正常人体组织中的活性被抑制，在肿瘤中被重新激活，端粒酶可能参与恶性转化。 端粒酶在保持端粒稳定、 基因组完整、 细胞长期的活性和潜在的继续增殖能力等方面有重要 作用。端粒酶的存在，就是把 DNA 复制的缺陷填补起来，即由把端粒修复延长，可以让端 粒不会因细胞分裂而有所损耗，使得细胞分裂的次数增加。 论述：论述： 1)你实验室的现有结果表面你实验室的现有结果表面 A 蛋白的量升高将导致蛋白的量升高将导致 B 蛋白功能增加，如果你接下来以此作蛋白功能增加，如果你接下来以此作 为博士课题，你怎样开展后续工作。为博士课题，你怎样开展后续工作。 2）囊泡运输的作用和调控）囊泡运输的作用和调控 作用：一、网格蛋白有被囊泡可产生于高尔基复合体，也可由细胞膜受体介导的细胞内吞作 用而形成。由高尔基复合体产生的网格蛋白小泡，主要介导从高尔基复合体向溶酶体、胞内 体或质膜外的物质输送转运，而通过细胞内吞作用形成的网格蛋白小泡，即有被小泡（有被 囊泡） ，则是将外来物质转送到细胞质，或者从胞内体输送到溶酶体。二、COP囊泡主要 负责介导从内质网到高尔基复合体的物质转运；三、COP囊泡首先发现于高尔基复合体， 亦属于非网格蛋白有被囊泡类型。 主要介导蛋白质从高尔基体运回内质网， 包括从外侧高尔 基体运向内侧高尔基体以及将蛋白质从内侧高尔基体运回内质网。 膜泡介导的蛋白质运输，无论是正向还是反向，都经历了 3 个主要步骤。首先是被蛋白以膜 泡形式出芽和膜泡中货物的选择（COP被蛋白质介导运输的蛋白质从 ER 中输出，COP I 被 蛋白质介导高尔基器和 ER 之间以及不同的高尔基潴泡之间的反向运输。此外，COP被也 参与穿过高尔基器的前向运输以及内吞膜泡的运输） ；第二步是膜泡运输到相关的受体腔膜 上并被束缚，Rab GTP 酶家族的成员、相关的效应蛋白质和细胞骨架蛋白质在此步中起重要 的作用；最后，膜泡锚定到受体腔膜上并与之融合，这一步至少部分的是通过 SNARE 蛋白 质介导的。 Rab 蛋白参对囊泡转运调节尤为重要。Rab 属 GTP 结合家族，含有 200 个氨基酸，蛋白结构 与 Ras 极为相似，通过不断结合与水解 ATP 的循环过程，调节囊泡的融合速度。胞浆中存在 着异种蛋白，称为 GDI，可特异性催化 Rab 与 GDP 解离，并与 GTP 结合，使 Rab 分子构象 发生改变，从而同转运囊泡表面蛋白迅速结合。当囊泡融合时，GTP 水解成 GDP，与 Rab 分 离。可以看出，Rab 与 GDP 结合，再置换 GTP，最后水解 GTP 构成调节囊泡融合的整个过 程。这一循环过程受到 Rab/GTP 绝对结合率的严格调节。 3）写出你所知道的肿瘤发生和表观遗传的关系）写出你所知道的肿瘤发生和表观遗传的关系 DNA 甲基化：通过对 DNA 甲基化模式的研究，人们发现肿瘤细胞中存在异常的 D N A 甲基 化状态：基因组整体甲基化水平降低，导致遗传不稳定性增加；组织特异性基因的启动子区 域出现从头甲基化；癌基因多为不充分甲基化，导致重新开放或异常表达；抑癌基因多为过 度甲基化，从而表达受抑制 组蛋白乙酰化：许多研究已证实了组蛋白高/低乙酰化在肿瘤发生中起重要作用。一方面， 人们发现，组蛋白乙酰化和脱乙酰化的变化与肿瘤细胞的形态变化有关；另一方面，催化组 蛋白乙酰化的 HAT(例如 p300/CBP、pCAF、ACTR 等)或催化组蛋白脱乙酰化的 HDAC 可与一 些癌基因和抑癌基因产物相互作用， 从而修饰或介导这些产物对与细胞分化和细胞增殖有关 的基因转录的作用。 随着对 lncRNA 在细胞生物学中的功能的深入研究，大量临床观察和实验显示， 失调的 lncRNA 可通过多种途径调节 DNA 甲基化、 组蛋白修饰、 染色顧塑和作为 miRNA 的前体， 在 肿瘤的发生和发展中发挥重要作用。 MALAT1 参与肺癌/肝癌癌变。 CCAT1 参与结肠癌； HOTAIR 参与食管癌转化。 CAS-ibp-2012 简答：简答： 1、细胞器的结构和其功能的联系、细胞器的结构和其功能的联系 线粒体嵴：线粒体嵴简称“嵴” ，是线粒体内膜向线粒体基质折褶形成的一种结构。线粒体 嵴的形成增大了线粒体内膜的表面积。线粒体嵴上有许多有柄小球体，即线粒体基粒，基粒 中含有 ATP 合酶，能利用呼吸链产生的能量合成三磷酸腺苷。所以需要较多能量的细胞，线 粒体嵴的数目一般也较多。 内质网层隙状或小管状系统： 膜片间的隙状空间称为池， 通常与细胞外隙和细胞浆基质之间 不直接相通。 这种细胞内的膜性管道系统一方面构成细胞内物质运输的通路， 另方面为细胞 内各种各样的酶反应提供广阔的反应面积。内质网与高尔基体及核膜相连续。 高尔基体由两种膜结构即扁平膜囊和大小不等的囊泡组成。在一般的动、植物细胞中，37 个扁平膜囊重叠在一起，略呈弓形 。弓形囊泡的凸面称为形成面，或未成熟面；凹面称为 分泌面，或成熟面。一般认为小液泡是由临近高尔基体的内质网以芽生方式形成的，起着从 内质网到高尔基体运输物质的作用。 糙面内质网腔中的蛋白质， 经芽生的小泡输送到高尔基 体， 再从形成面到成熟面的过程中逐步加工。 较大的液泡是由扁平膜囊末端或分泌面局部膨 胀，然后断离所形成。由于这种液泡内含扁平膜囊的分泌物，所以也称分泌泡。分泌泡逐渐 移向细胞表面，与细胞的质膜融合，而后破裂，内含物随之排出 。 2、胚胎干细胞的特性及功能、胚胎干细胞的特性及功能 定义：胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESCs，简称 ES、EK 或 ESC 细胞。 ）胚胎干细胞是早 期胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺中分离出来的一类细胞。它具有体外培养无限增殖、自 我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ES 细胞都能被诱导分化为机体几乎 所有的细胞类型。 特性：一、ES 细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细胞体积小，核大，核质比高， 有一个或多个明显的核仁，核型正常，具有整倍性；二、ES 细胞具有全能性、无限增殖性、 种系传递功能，ES 细胞易于进行基因改造操作，并保留了正常二倍体的性质且核型正常， 能参与胚胎各组织器官的生长发育等生理功能；三、ES 细胞表面表达时相专一性胚胎抗原 ( stage specific embryonic antigen，SSEA) ，而且可以检测到 Oct-4 基因的表达，这两种蛋白 为发育全能性的标志。 功能：胚胎干细胞具有多能性（Pluripotency） ，特点是可以通过细胞分化(Cellular differentiation)成多种组织（所有组织，包括生殖系细胞）的能力，但无法独自发育成一个 个体（利用四倍体融合技术可以得到完全由所用 ES 细胞发育而来的个体） 。 它可以发育成为 外胚层、中胚层及内胚层三种胚层的细胞组织。 应用：研究胚胎发育及疾病的发生；用于细胞、组织的修复和移植治疗；用于基因治疗；用 于药物筛选和药物开发。 3、蛋白质翻译后修饰的作用、蛋白质翻译后修饰的作用 4、细胞骨架的主动调节机理、细胞骨架的主动调节机理 定义： 细胞骨架是由蛋白质与蛋白质搭建起的骨架网络结构，包括细胞质骨架和细胞核骨 架。细胞骨架系统的主要作用是维持细胞的一定形态。 细胞骨架的作用：细胞骨架的主要成分是微管、微丝和中间纤维。如：在细胞分裂中细胞骨 架牵引染色体分离，在细胞物质运输中，各类小泡和细胞器可沿着细胞骨架定向转运；在肌 肉细胞中， 细胞骨架和它的结合蛋白组成动力系统； 在白细胞(白血球)的迁移、 精子的游动、 神经细胞轴突和树突的伸展等方面都与细胞骨架有关。 另外， 在植物细胞中细胞骨架指导细 胞壁的合成。 细胞骨架的三种组分中，微管刚度最大且组装和解聚过程最复杂。微管的持久长度 (persistence length) 较大，最大可达到毫米量级，能够形成横跨整个细胞尺度的管道，并且 可在一定外力作用下发生屈曲12。微管可以在聚合态(稳态生长) 和解离态(迅速解聚缩短) 两个状态之间进行转换13。肌动蛋白纤维的刚度比微管小很多，但可以在交联蛋白的促进 下形成各向同性网络结构、 聚束网络结构和分支网络结构等高度有序的网络结构。 肌动蛋白 纤维能在核苷酸(ATP 及 GTP 等)、 应力等调控因子和局部信号的作用下不断地组装生长， 为 迁移细胞前进端提供持续的动力14， 而其主要模式分为两种： 1) 用多束排列有序的肌动蛋 白纤维支持迁移细胞伪足的前伸，该现象往往发生在化学极化作用(细胞沿化学梯度方向运 动) 和细胞与外界之间的相互作用过程中。例如在粘附成纤维细胞中，细胞表面受体分子， 即整联蛋白(integrins)，同其配体相互结合时，形成收缩性肌动蛋白纤维束结构，即应力纤 维(stress fibers， SFs)15； 2) 用高度分叉的纤维网络结构支撑迁移细胞的前伸边缘并产生力， 以改变细胞的形状。 例如处于迁移过程的白细胞， 在细胞表面受体分子感知进而传导进细胞 的信号作用下，细胞的前端组装形成具有前伸性、高度分叉的肌动蛋白纤维网络结构16。 中间丝是细胞骨架纤维中刚度最小的一个，中间丝能通过网蛋白(plectins) 同肌动蛋白纤维 和微管连接，使得细胞骨架能够更好地承受拉力/压力作用。 5、细胞与细胞间是如何联系的（细胞间通讯） 6、为什么核膜在细胞周期中需要崩解、为什么核膜在细胞周期中需要崩解 广 义 的 细 胞 核 膜 主 要 由 外 层 核 膜 (outer nuclear membrane) 、 内 层 核 膜 (inner nuclearmembrane)、核孔复合体(nuclear pore complex)、核纤层(nuclear lamina)等部分组成。 外层核膜与内质网相连, 上面锚定着核糖体, 因此也被看作内质网的一部分；在内外层核膜 融合的区域镶嵌着超过 60 种蛋白组成的孔状复合体, 它们是联系细胞核和细胞质信息和物 质的重要通道, 但只允许一定大小的分子通过, 因此称之为选择性通道；位于内层核膜下方 的是一层类似网状的结构, 称之为核纤层, 核纤层蛋白(lamin)主要由 A 型核纤层蛋白和 B 型 核纤层蛋白组成1。它们和细胞质的中间纤维蛋白类似, 通过头尾聚合形成稳定的核骨架, 在维持细胞核膜形态以及核孔复合体定位方面起着重要的作用。 高等真核细胞的核膜在细胞增殖的过程中发生去组装和组装的周期性动态变化。 细胞完成遗 传物质的复制后, 经过 G2 期的准备,开始进入 M 期, 核膜结构逐步消失。 研究观察表明,核膜 崩解过程中首先发生核孔复合体的解聚, 然后是核纤层的解聚, 进而核膜完全崩解, 形成核 膜前体膜泡, 或融入到内质网中。 在这个过程中很多激酶发挥功能, 如 CDK1 激酶33、 Aurora 激酶、 PLK 激酶等, 协同磷酸化核孔复合体蛋白, 促进核孔蛋白的解聚, 从而使得细胞质和细 胞核之间的物质可以相对自由地穿梭, 进而促进核纤层解聚与染色质凝集。 但核膜是如何崩 解的, 目前依然不是很清楚。 论述：论述： 1、细胞衰老机制及你认为该如何研究、细胞衰老机制及你认为该如何研究 细胞衰老的一般含义是复制衰老， 指体外培养的正常细胞经有限次数的分裂以后， 停止分裂， 细胞形态和生理代谢活动发生显著改变的现象。 氧自由基学说认为细胞衰老是机体代谢产生的氧自由基对细胞损伤的积累。 端粒学说提出细 胞染色体端粒缩短的衰老生物钟理论，认为细胞染色体末端特殊结构-端粒的长度决定了细 胞的寿命。DNA 损伤衰老学说认为细胞衰老是 DNA 损伤的积累。基因衰老学说认为细胞衰 老受衰老相关基因的调控。 分子交联学说则认为生物大分子之间形成交联导致细胞衰老， 也 有学者认为， 脂褐素蓄积、 糖基化反应以及细胞在蛋白质合成中难免发生的误差等因素导致 细胞衰老。 端粒DNA是由简单的DNA高度重复序列组成的， 染色体末端沿着5到3 方向的链富含 GT。 端粒 DNA 主要功能有：第一，保护染色体不被核酸酶降解；第二，防止染色体相互融合； 第三，为端粒酶提供底物，解决 DNA 复制的末端隐缩，保证染色体的完全复制。端粒、着 丝粒和复制原点是染色体保持完整和稳定的三大要素。 正常细胞细胞分裂次数越多， 其端粒 磨损越多，细胞寿命越短。 复制衰老的机制： 肿瘤抑制蛋白 p53 和 pRb 失活会导致人成纤维细胞的永生化， pRb 是细胞 周期中重要的调控因子， pRb 能够与转录因子 E2F 家族结合并抑制其转录活性。 E2F 负责 G1/S 期转换及 DNA 合成的若干基因的转录，当 E2F 失活后细胞周期阻止在 G1 期。 细胞周期重要 调控因子 CDK 的活化， pRb 蛋白被活化后的 CDK 磷酸化， 磷酸化的 pRb 失去 E2F 结合活性， 使得 E2F 被释放并激活靶基因的转录， 细胞就从 G1 期进入 S 期。 如果 CDK 正常活化被抑制， 或 pRb 突变导致 pRb 不能被磷酸化，就会使 G1/S 期转换被停滞，从而阻止细胞周期的正常 运行，导致细胞复制衰老。 2、给你一个新基因如何研究它的功能，用到什么技术？、给你一个新基因如何研究它的功能，用到什么技术？ 1 新基因的生物信息学分析： 人们希望能够直接从蛋白质序列准确地预测蛋白质的结构和功 能: 分析序列是否为全长的 cDNA; 序列相似性分析; 电子基因定位分析; 基因组结 构确定; 编码蛋白性质功能预测。 基因功能的研究思路主要包括: 1.基因的亚细胞定位和时空(发育期或梯度药物处理浓度,不同组织/器官)表达谱; 2.基因在转录水平的调控(可以通过 genome walking PCR 或通过已有的资源库寻找该基因的 启动子等转录调控区域,通过单杂交或 ChIP 等技术,寻找该基因的转录调控蛋白) 3.细胞生化水平的功能研究(也就是蛋白蛋白作用复合体的寻找验证,具体方法有酵母双杂 交,GST pulldown,co-IP,BRET,FRET,BiFc 等等,对该基因的表达产物做一个细胞信号转导通路的 定位) 4.gain-of-function 由外源或内源物质 (或称配体)激活;由膜的伸展激活。(即电位依赖的 Ca2 +通道；配体门控 Ca2+通道；伸展激活 的钙通道(SAC), 当细胞膨胀或容积增大时, 膜被拉伸, 可使该通道开放使 Ca2+和其它阳离 子流入。 其次对 Ca2+的排出机制来说，这一机制主要是靠 Ca2 +泵(或称 Ca2+-ATP 酶)转运来实现, 其 次是通过 Na+/Ca2+交换子转运完成。Ca2+泵, 现已知有 2 个不同的 Ca2+泵超家族:肌浆网/ 内质网 Ca2+泵家族(简称 SERCA), 和质膜 Ca2 +泵家族(PMCA)。Na+/Ca2+交换子的交换率是 3Na+1Ca2 + , 交换功能依赖于完整的肌动蛋白骨架。Na+/Ca2 +交换子调节细胞内 Ca2+水 平的重要性因细胞不同而异。 Ca2 +的缓冲系统的存在, 也参与 Ca2+ 的调节：现已知许多细胞内 Ca2+的缓冲物, 可以和 Ca2 +结合而降低 Ca2 + , 也可由结合状态释放游离 Ca2 + , 而提高 Ca2+ 。常见的缓冲物 有大分子的蛋白质如钙调素, 钙结合蛋白等, 和小分子的有机物如谷氨酸盐, 柠檬酸盐等, 甚至出现 Ca2+结晶体(病理状态下)。Ca2+缓冲物可分布于胞浆, 也可位于内质网, 其结合 Ca2+的能力有高有低(调节意义各不相同), 总缓冲能力在中性粒细胞约为 0 .76mM 。 缓冲物 中最重要的是钙调素。 4. 细胞凋亡的检测方法有哪些？细胞凋亡的检测方法有哪些？ 细胞凋亡（apoptosis）指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。 1）细胞凋亡的膜受体通路：Fas 是一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，它 与 FasL 结合可以启动凋亡信号的转导引起细胞凋亡。Fas-Fasl-FADD-caspase8，caspase8 作为 酶原而被激活，引起下面的级联反应。细胞发生凋亡。 2）细胞色素 C 释放和 Caspases 激活的生物化学途径：线粒体是细胞生命活动控制中心，它 不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心， 而且是细胞凋亡调控中心。 实验表明释放到细胞浆 的细胞色素 C 在 dATP 存在的条件下能与凋亡相关因子 1（Apaf-1）结合，使其形成多聚体， 并促使 caspase-9 与其结合形成凋亡小体，caspase-9 被激活，被激活的 caspase-9 能激活其 它的 caspase 如 caspase-3 等，从而诱导细胞凋亡。 凋亡细胞的特征性表现，包括 DNA 裂解为 200bp 左右的片段，染色质浓缩，细胞膜活化， 细胞皱缩，最后形成由细胞膜包裹的凋亡小体。 调往检测方法。 早期检测 1) PS（磷脂酰丝氨酸）在细胞外膜上的检测： PS 从细胞膜内侧转移到外侧在细胞受到凋亡 诱导后不久发生， 可能作为免疫系统的识别标志。 AnnexinV， 一个钙依赖性的磷脂结合蛋白， 能专一性的结合暴露在膜外侧的 PS，再通过简单的显色或发光系统进行检测。由于这是一 种凋亡早期的活细胞检测（悬浮细胞和贴壁细胞都适用） ，可与 DNA 染料或别的晚期检测方 法相结合来标记凋亡的发展阶段。 2) 细胞色素 C 的定位检测；细胞色素 C 作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作 用。正常情况下，它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放 至细胞液，结合 Apaf-1 （apoptoticprotease activating factor-1）后启动 caspase 级联反应。 细胞色素 C 氧化酶亚单位（cytochrome c oxidase subunit ：COX4）是定位在线粒体内膜 上的膜蛋白，凋亡发生时，它保留在线粒体内，因而它是线粒体富集部分的一个非常有用的 标志。可从凋亡和非凋亡细胞中快速有效分离出高度富集的线粒体部分，再进一步通过 Western 杂交用细胞色素 C 抗体和 COX4 抗体标示细胞色素 C 和 COX4 的存在位置，从而判 断凋亡的发生。 3) 线粒体膜电位变化的检测： MitoSensorTM， 一个阳离子性的染色剂， 对此改变非常敏感， 呈现出不同的荧光染色。正常细胞中，它在线粒体中形成聚集体，发出强烈的红色荧光。凋 亡细胞中，因线粒体穿膜电位的改变，它以单体形式存在于细胞液中，发出绿色荧光。 晚期检测 1. 端粒酶检测：正常体细胞是没有端粒酶活性的，每分裂一次，染色体的端粒会缩短，这 可能作为有丝分裂的一种时钟， 表明细胞年龄、 复制衰老或细胞凋亡的信号。 研究发现， 90% 以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性。 2. 细胞凋亡晚期中，核酸内切酶（某些 Caspase 的底物）在核小体之间剪切核 DNA，产生 大量长度在 180-200 bp 的 DNA 片段。对于这一现象的检测通常有以下两种方法：一、通过 DNA 末端转移酶将带标记的 dNTP （多为 dUTP）间接（通过地高辛）或直接接到 DNA 片段 的 3-OH 端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果；二、当凋亡细胞比例较小以及检 测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核 DNA 的变化。通过 LM-PCR（ligation-mediated PCR） ，连上特异性接头，专一性地扩增核小体的梯度片段，从而 灵敏地检测凋亡时产生的核小体的梯度片段。 5. 自噬自噬 定义：指细胞为了维持细胞内环境的动态平衡，不断降解功能失常或不需要的细胞结构，如 各种蛋白质，细胞器，以及各种细胞组分。 细胞自噬(autophagy)是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。 该过程中 一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后，送入溶酶体(动物）或液泡（酵 母和植物）中进行降解并得以循环利用。 饥饿导致线虫细胞死亡过程中，细胞通过自噬降解自身物质产生能量，最总导致细胞死亡。 同时自噬是细胞调亡的补重途径，当细胞凋亡所需的关键因子（Caspase-1/3/9）受抑制时， 细胞会发生自噬。 研究人员发现，AMPK 能以不同的方式，调控一种称为 Vps34 激酶家族不同的复合物，一些 Vps34 酶参与了正常细胞的囊泡运输细胞中一种重要的分子运输，还有一些 Vps34 复合 物则参与了细胞自噬。 酵母细胞处于饥饿状态时，自私相关蛋白 Atg（autophagy-related）活化，促进自噬泡的形 成。 论述：论述： 1. 什么是细胞周期？说明各个时期的复制、转录、翻译的变化。什么是细胞周期？说明各个时期的复制、转录、翻译的变化。 定义：细胞周期（cell cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过 程，分为间期与分裂期两个阶段。 间期又分为三期、 即 DNA 合成前期 （G1 期） 、 DNA 合成期 （S 期） 与 DNA 合成后期 （G2 期） 。 1.G1 期（first gap） 从有丝分裂到 DNA 复制前的一段时期，又称合成前期，此期主要合成 RNA 和核糖体。该期特点是物质代谢活跃，迅速合成 RNA 和蛋白质，细胞体积显著增大。 这一期的主要意义在于为下阶段 S 期的 DNA 复制作好物质和能量的准备。G1 期末存在 G1 期检验点控制 G1/S 的转化。 2.S 期（synthesis） 即 DNA 合成期，在此期真核细胞新和成的 DNA 与组蛋白结合共同组成 核小体串珠结构，除了合成 DNA 外，同时还要合成组蛋白。DNA 复制所需要的酶都在这一 时期合成。 3.G2 期（second gap）期，此时细胞核内 DNA 的含量已增加一倍，有 G1 时期的 2n 变成了 4n。 在这一时期， DNA 合成终止， 大量合成 RNA 及蛋白质， 包括微管蛋白和促成熟因子等。 G2 期末存在 G2 期检验点控制 G2/M 的转化。 M 期：细胞分裂期。 1. 前期（prophase）: 染色质开始浓缩，螺旋化，折叠和包装成染色体。染色体短而粗，强 嗜碱性。两个中心体向相反方向移动，在细胞中形成两极；而后以中心粒随体为起始点开始 合成微管，形成纺锤体。随着核仁相随染色质的螺旋化，核仁逐渐消失。核被膜开始瓦解为 离散的囊泡状内质网。 2. 前中期：核膜破裂，以小泡的形式分散到细胞质中；核纤层蛋白磷酸化解聚；染色体上 的动粒逐渐成熟；纺锤体组装。 3. 中期（metaphase） ，染色体均移到细胞的赤道平面，从纺锤体两极发出的微管附着于每 一个染色体的着丝点上。 分离的染色体呈短粗棒状或发夹状， 均由两个染色单体借狭窄的着 丝点连接构成。 4后期（anaphase）着丝点纵裂，动粒微管变短，染色体逐渐向两极移动；极性微管长度 增加，两极之间的举例逐渐拉长。 5末期（telophase）动粒微管消失，极性微管继续加长；染色单体开始去浓缩；核膜，核 仁开始组装，RNA 合成功能逐渐恢复。 6. 胞质分裂期：大量的肌动蛋白和肌球蛋白在中间体处（微丝，微管，小膜泡等聚集形成 中间体）组装成微丝，并相互组成微丝束环绕细胞形成收缩环。在收缩环的作用下细胞表面 下陷形成分裂沟，随分裂沟的加深收缩环处细胞质膜融合并形成两个子代细胞。 2. 以表观遗传学的角度谈谈你对细胞分化的认识。以表观遗传学的角度谈谈你对细胞分化的认识。 定义：表观遗传学这个名词指的是基因表达中的多种变化。这种变化在细胞分裂的过程中， 有时甚至是在隔代遗传中保持稳定，但是不涉及到基本 DNA 的改变。 概念意味着即使环境因素会导致生物的基因表达出不同， 但是基因本身不会发生改变。 表观 遗传学在真核生物中的变化主要被优雅的举例为细胞分化过程中干细胞分化成与胚胎有关 的多种细胞这一过程。 这个过程通过一些可能包含某些基因的沉默， 移除某些基因上沉默的 标志并且永久的失活于其他基因的机制变得稳定。 常见表观遗传学现象： DNA 甲基化：所谓 DNA 甲基化是指在 DNA 甲基化转移酶的作用下， 在基因组 CpG 二核苷 酸的胞嘧啶 5碳位共价键结合一个 甲基基团。 由于 DNA 甲基化与人类发育和肿瘤疾病的密 切关系， DNA 甲基 化已经成为表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容。 染色质重塑： 染色质重塑复合物依靠水解 ATP 提供能量来完成染色质结构的改变， 根据水解 ATP 的亚基不同，可将复合物分为 SWI/SNF 复合物、ISW 复合物以及其它类型的复合物。这 些复合物及相关的蛋白均与转录的激活和抑制、DNA 的甲基化、DNA 修复以及细胞周期相 关。 基因组印记： 基因组印记是指来自父方和母方的等位基因在通过精子和卵子传递给子代时发 生了修饰，使带有亲代印记的等位基因具有不同的表达特性，这种修饰常为 DNA 甲基化修 饰，也包括组蛋白乙酰化、甲基化等修饰。 （在生殖细胞形成早期，来自父方和母方的印记 将全部被消除， 父方等位基因在精母细胞形成精子时产生新的甲基化模式， 但在受精时这种 甲基化模式还将发生改变； 母方等位基因甲基化模式在卵子发生时形成， 因此在受精前来自 父方和母方的等位基因具有不同的甲基化模式。 ） X 染色体失活：女性有两条 X 染色体，而男性只有一条 X 染色体，为了保持平衡，女性的一 条 X 染色体被永久失活，这便是“剂量补偿”效应。哺乳动物雌性个体的 X 染色体失活遵循 n-1 法则，不论有多少条 X 染色体，最终只能随机保留一条的活性。 （X 染色体随机失活是 X 失活中心(Xic)调控的。 ） 非编码 RNA: 功能性非编码 RNA 在基因表达中发挥重要的作用， 按照它们的大小可分为长链 非编码 RNA 和短链非编码 RNA。长链非编码 RNA 在基因簇以至于整个染色体水平发挥顺式 调节作用。短链 RNA 在基因组水平对基因表达进行调控，其可介导 mRNA 的降解。 3. 如何设计实验来研究线粒体膜定位蛋白的功能。如何设计实验来研究线粒体膜定位蛋白的功能。 4.谈谈你对细胞核重新编程的认识。谈谈你对细胞核重新编程的认识。 定义：所谓细胞核重新编程，是将成熟体细胞重新诱导回早期干细胞状态，细胞核重新编程 主要是指表观遗传学水平上的变化, 即非基因序列改变所导致的基因表达水平的变化, 如 DNA 甲基化和染色质构象变化等。 重编程的现象： 受精卵形成和发育过程中细胞核的重新编程：DNA 甲基化是哺乳动物胚胎着床前发生的一 重要的核重新编程的事件。 利用免疫荧光化学和特定基因序列亚硫酸化技术对基因进行分析, 发现父源基因组在结合组蛋白后呈现广泛的 DNA 去甲基化, 这种去甲基化一般在父源原核 的 DNA 复制开始前完成。 克隆胚胎细胞核的重新编程： 克隆过程中细胞核重新编程的第一个明显表现是核移植后体细 胞核膜的破裂，这一过程一般发生在核移植后 30 min 内；第二个与核重新编程相关的显著 事件是体细胞染色体因暴露于M 阶段卵母细胞胞质而发生早熟染色体聚集这与卵母细胞成 熟过程中发生的染色体聚集相似。 重编程的利用意义 研究人员可以提取各种疾病患者的皮肤细胞，做“再编程”处理，在实验室内检视病人皮肤 细胞与健康人皮肤细胞的差异。 这样可以帮助研究人员发现病因， 对疾病进行合理的诊断和 治疗。 虽然器官移植技术已经非常发达，肾、心、肝、胰腺等多种器官、组织都可以移植，但是很 容易产生异体排斥， 即使成功也不能百分之百地长期存活。 如果能够利用自身细胞培育出相 应的器官，则能消除排斥反应。 当人体的器官衰竭时， 便可以用自己的细胞培养成一个健康的新生的器官组织， 并移植到体 内替换衰老的器官。当然，这只能使人恢复到之前的健康状态，但是并不能逆转人体老化的 自然规律，长生不老没那么简单。 山中伸弥宣称，这类细胞对于治疗糖尿病、脊髓损伤、帕金森病甚至失明具有巨大潜力。 CAS-ibp-2014 简答：简答： 1.细胞增殖细胞增殖 细胞以分裂的方式进行增殖，细胞增殖是生活细胞的重要生理功能之一，是生物体生长、发 育、繁殖以及遗传的基础。 增殖的方式： 真核生物的分裂依据过程不同有三种方式， 有有丝分裂， 无丝分裂， 减数分裂。 二分裂,因为它没有细胞核,所以不是有丝分裂,也不是无丝分裂。 有丝分裂： 有丝分裂是真核生物进行细胞分裂的主要方式， 体细胞进行有丝分裂是有周期性 的，也就是具有细胞周期。一个细胞周期包括两个阶段：分裂间期和分裂期。间期细胞的最 大特点是完成 DNA 分子的复制和有关蛋白质的合成。因此，间期是整个细胞周期中极为关 键的准备阶段。人们为了研究方便，把分裂期分为四个时期：前期，中期，后期，末期。 细胞无丝分裂：的过程比较简单，一般是细胞核先延长，从核的中部向内凹进，缢裂成为两 个细胞核；接着，整个细胞从中部缢裂成两部分，形成两个子细胞。因为分裂过程中没有出 现纺锤丝和染色体，所以叫做无丝分裂。(如蛙的红细胞) 减数分裂：是一种特殊方式有丝分裂，它与有性生殖细胞的形成有关。在整个减数分裂过程 中，染色体只复制一次，而细胞连续分裂两次。减数分裂的结果是，新产生的生殖细胞中的 染色体数目，比新原始的生殖细胞的减少一半。 二分裂： 细菌可以以无性或者遗传重组二种方式繁殖， 最主要的方式是以二分裂这种无性繁 殖的方式：一个细菌细胞壁横向分裂，形成两个子代细胞。 细胞增殖的研究方法：细胞增殖的研究方法有很多，主要包括：BrdU，EdU，CCK8 等方法。 其中 EdU 检测方法是最新的细胞增殖检测方法。 EdU 是一种胸腺嘧啶核苷类似物， 能够在细 胞增殖时期代替 T 渗入正在复制的 DNA 分子，通过基于 EdU 与 Apollo荧光染料的特异 性反应检测 DNA 复制活性，通过检测 EdU 标记便能准确地反映细胞的增殖情况。 细胞增殖(cell proliferation)是细胞生命活动的重要特征之一,是生物繁育的基础. 成体生物仍然需要细胞增殖,主要取代衰老死亡的细胞,维持个体细胞数量的相对平衡和机体 的正常功能. 机体创伤愈合、组织再生、病理组织修复等,都要依赖细。 2.细胞分化细胞分化 细胞分化（cell differentiation）是指同一来源的细胞逐渐产生出形态结构、功能特征各不相 同的细胞类群的过程， 其结果是在空间上细胞产生差异， 在时间上同一细胞与其从前的状态 有所不同。细胞分化的本质是基因组在时间和空间上的选择性表达。 细胞分化的特点包括： 细胞分化的潜能随个体发育进程逐渐 “缩窄” ， 在胚胎发育过程中， 细胞逐渐由“全能”到“多能” ，最后向“单能”的趋向，是细胞分化的一般规律； 细胞 分化具有时空性，在个体发育过程中，多细胞生物细胞既有时间上的分化，也有空间上的分 化； 细胞分化与细胞的分裂状态和速度相适应，分化必须建立在分裂的基础上，即分化 必然伴随着分裂，但分裂的细胞不一定就分化。分化程度越高，分裂能力也就越差； 细 胞分化具有高度的稳定性，正常生理条件下，已经分化为某种特异的、稳定类型的细胞一般 不可能逆转到未分化状态或者成为其他类型的分化细胞； 细胞分化具有可塑性，已分化 的细胞在特殊条件下重新进入未分化状态或转分化为另一种类型细胞的现象。 影响细胞分化的因素：细胞外信号分子对细胞分化的影响，成纤维细胞分化因子（FGF）, 转化生长因子（TGF） ，Wnt，hedghog 及 Juxtacrine 五大家族因子。细胞记忆与决定，信 号分子的有效作用时间是短暂的， 然而细胞可以将这些短暂的作用储存起来形成长时间的记 忆，逐渐向特定方向分化。(果蝇的成虫盘，增殖 1800 代，仍保留其记忆，照例发育成为相 应的器官)。受精卵胞质的不均一性对细胞分化的影响。在卵母细胞胞质中除了储存营养 物质和蛋白质外，还含有多种 mRNA，其中多数 mRNA 与蛋白质结合处于非活跃状态，形成 隐蔽 mRNA，不能被核糖体识别。然而他们在卵母细胞中呈不均匀分布，受精后卵母细胞质 重新定位，随受精卵早期分裂不均一的分配到子细胞中去，从而决定未来细胞分化的命运， 产生分化方向的差异。细胞间的相互作用与位置效应。改变细胞所处的位置可导致细胞 分化方向的改变。环境对性别决定的影响。许多爬行动物如蜥蜴中的一些种类在较低温 度下（25）全部发育为雌性，而提高温度（32 度）则全部发育未雄性。染色体变化与 基因重排对细胞分化的影响，抗体是由浆细胞分泌的，而浆细胞有 B 淋巴细胞分化而来。在 这一过程中，B 淋巴细胞中的 DNA 经过断裂、丢失与重复的复杂变化，从而利用有限的免 疫球蛋白基因，理论上表达出数十亿种抗体。 3.细胞稳态细胞稳态 细胞稳态是维系正常生命新陈代谢的基本保障, 疾病的发生发展则是细胞的生理状态向病 理生理状态渐进性迁移过程. 细胞稳态维系方式包括: 细胞周期调控、细胞衰老、细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬等生理 功能, 担负着维系细胞稳态的使命。 胞稳态的维系机制：DNA 受到损伤后，引发细胞内一系列的分子事件将 DNA 损伤修复因子 招募到损伤位点，来参与 DNA 修复工作。为了有效修复受损的 DNA，细胞内还将启动一系 列的维系细胞稳态系统协同完成 DNA 损伤修复。细胞周期检测点(checkpoint)在检测到 DNA 损伤的基础上，通过诱导细胞周期阻滞，阻止进一步的细胞增殖过程，从而使细胞有足够的 时间对损伤的 DNA 进行修复。当细胞内积累过多 DNA 损伤无法完全修复时，通过激发细胞 周期阻滞机制， 细胞会进入一种不可逆转的生长停滞状态一细胞衰老， 或通过细胞凋亡最终 将带有 DNA 损伤的细胞清除。一旦损伤了 DNA 的细胞完全失去细胞周期检测点调控和凋亡 机制而继续增殖时， 异常细胞就能存活下来， 导致基因组不稳定， 最终导致肿瘤细胞的形成。 细胞稳态的意义： 担负着维护细胞稳态的作用， 是保证生物有机体正常新陈代谢和发挥生物 学功能的基本保障。 4.细胞通讯细胞通讯 定义：细胞通讯是指细胞外因子通过与靶细胞受体（膜受体或核受体）结合，引发靶细胞内 的一系列生理生化变化、最终表现为细胞整体的生物学效应的过程。 细胞通讯的方式： 概括为 3 中通过分泌化学信号进行细胞间通讯； 细胞间接触依赖性通 讯；动物相邻细胞间的间隙链接及植物细胞间的胞间连丝。 细胞分泌化学信号：是多细胞生物普遍采用的通讯方式，可长距离或短距离发挥作用，其作 用方式分为 a 内分泌（信号分子经血液运送到体内各个部位） ，b 旁分泌（分泌局部化学介 质到细胞外液中，局部扩散作用于临近靶细胞） ，c 自分泌（对自身分泌的物质产生反应） ， d 通过化学突触传递神经信号。 细胞间接触依赖性通讯： 细胞间直接接触而无需信号分子的释放， 通过质膜上的信号分子与 靶细胞膜上的受体分子相互作用来介导细胞间的通讯。 这种通讯方式在胚胎发育过程中对组 织内相邻的细胞的分化命运有决定作用。 动物相邻细胞间的间隙链接及植物细胞间的胞间连丝使细胞间相互沟通， 通过交换小分子来 实现代谢偶联和电偶联。 5.细胞应激细胞应激 细胞应激： 当原核或真核细胞遭受各种明显的环境变化或遭遇射线， 活性氧等导致大分子损 伤时，能产生一系列适应性的变化，最终导致基因表达的改变，以增强细胞抗损伤能力和在 不利条件下的生存能力。 能使细胞产生细胞应激反应的刺激或因素：物理因素，化学因素，生物因素，营养缺乏，心 理、社会环境因素。 主要的细胞应激反应包括：一、细胞内 DNA 损伤导致的应激反应 ，二、低氧导致的细胞应 激反应，三、细胞的氧化应激 ，四、营养缺乏引起的细胞应激反应。 HSP（heat shock protein）可提高细胞的应激能力，特别是耐热能力。热休克蛋白主要存在 于细胞质中，平时表达水平较低，可被多种应激原所诱导，应激时迅速升高，通过帮助蛋白 质的折叠、移位、复性及降解，作为分子伴侣防止蛋白质的变性、聚集，促进已经聚集蛋白 质的解聚及复性，来提高细胞抗应激能力。 6.囊泡转运囊泡转运 定义： 大分子物质及颗粒性物质不能穿过细胞膜， 是以另外一种特殊方式来进行跨细胞膜转 运的， 即物质在进出细胞的转运过程中都是由膜包裹、 形成囊泡、 与膜融合或断裂来完成的， 故又称囊泡转运。 这种方式主要见于细胞器之间的蛋白质运输， 如蛋白质从内质网转运到高 尔基体以及从高尔基体转运到溶酶体、分泌泡、细胞质膜、细胞外等，这种小泡称为运输小 泡。 囊泡运输包括：网格蛋白有被囊泡、COP I 和 COP II 有被囊泡是了解较多的 3 种囊泡类型。 网格蛋白有被囊泡可产生于高尔基复合体，也可由细胞膜受体介导的细胞内吞作用而形成。 由高尔基复合体产生的网格蛋白小泡， 主要介导从高尔基复合体向溶酶体、 胞内体或质膜外 的物质输送转运，而通过细胞内吞作用形成的网格蛋白小泡，即有被小泡（有被囊泡） ，则 是将外来物质转送到细胞质，或者从胞内体输送到溶酶体。 COP有被囊泡由粗面内质网所产生，主要负责介导从内质网到高尔基复合体的物质转运。 COP囊泡首先发现于高尔基复合体，亦属于非网格蛋白有被囊泡类型。主要介导蛋白质从 高尔基体运回内质网， 包括从外侧高尔基体运向内侧高尔基体以及将蛋白质从内侧高尔基体 运回内质网。 膜泡介导的蛋白质运输，无论是正向还是反向，都经历了 3 个主要步骤。首先是被蛋白以膜 泡形式出芽和膜泡中货物的选择（COP被蛋白质介导运输的蛋白质从 ER 中输出，COP I 被 蛋白质介导高尔基器和 ER 之间以及不同的高尔基潴泡之间的反向运输。此外，COP被也 参与穿过高尔基器的前向运输以及内吞膜泡的运输） ；第二步是膜泡运输到相关的受体腔膜 上并被束缚，Rab GTP 酶家族的成员、相关的效应蛋白质和细胞骨架蛋白质在此步中起重要 的作用；最后，膜泡锚定到受体腔膜上并与之融合，这一步至少部分的是通过 v/t-SNARE 蛋 白质介导的 论述：论述： 1.说出说出 5 种蛋白质翻译后修饰方法，并说出其特征及信号转导中的作用。种蛋白质翻译后修饰方法，并说出其特征及信号转导中的作用。 前提蛋白翻译后的加工主要包括：N-端 fMet 或 Met 的切除、二硫键的形成、化学修饰和剪切。 蛋白质翻译后修饰, 是指在 mRNA 被翻译成蛋白质后, 对蛋白质上个别氨基酸残基进行共价 修饰的过程. 蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的作用. 常见的有泛素化、磷酸化、糖基化、脂基化、甲基化和乙酰化等. 泛素由 76 个氨基酸组成，高度保守, 普遍存在于真核细胞内,故名泛素. 共价结合泛素的蛋 白质能被蛋白酶识别并降解, 这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径. 与消 化道内进行的蛋白质水解不同,从泛素与蛋白的结合到将蛋白水解成小的肽段, 整个水解过 程需要能量参与。 人们开始意识到泛素-蛋白酶系统是一个对于真核细胞非常重要的调节系 统。 磷酸化是通过蛋白质磷酸化激酶将 ATP 的磷酸基转移到蛋白的特定位点上的过程. 大部分 细胞过程实际上是被可逆的蛋白磷酸化所调控的, 可逆的磷酸化过程几乎涉及所有的生理 及病理过程, 如细胞信号转导、 肿瘤发生、 新陈代谢、 神经活动、 肌肉收缩以及细胞的增殖、 发育和分化等. 磷酸化的作用位点为蛋白上的 Ser, Thr, Tyr 残基. 蛋白质的糖基化是低聚糖以糖苷的形式与蛋白上特定的氨基酸残基共价结合的过程. 在许 多生物过程中起着重要的作用, 如免疫保护、病毒的复制、细胞生长、细胞与细胞之间的黏 附、炎症的产生等. 蛋