3 基因表达检测_ppt课件

第三部分：基因表达检测 基因表达检测的应用范畴 检测检测 自然变变异等位基因的表达差异； 检测检测 突变变体基因功能的丧丧失或获获得； 检测转检测转 基因的表达：OX 用这种方法得到的总RNA中蛋白质和DNA污染很少，可 以用来做Northern，RT-PCR，分离mRNA，体外翻译和分子 克隆等。 1. 75乙醇（in DEPC-treated water) 2. 氯仿、异丙醇（RNA专用） 3. RNase-free water：Draw water to RNase-free glass bottles. Add diethylpyrocarbonate （DEPC）to 0.1% . Let stand overnight and autoclave. 4. 防止外源RNase的污染： 应戴口罩和手套，环境洁净； 玻璃器皿180C烘烤3 hrs以上； 一次性用品如tube、 tip、塑料制品等使用DEPC蛋 白质变性剂处理，或者用新的、无RNA酶的产品； 电泳槽相关的用0.4M 的NaOH处理，再用DEPC水 洗3遍。 RNA抽提前应准备的其它试剂及物品 操作步骤 液氮取样，液氮磨样，每管分装0.1克样品； 每管加1ml Trizol 试剂（样品体积不超过Trizol 试剂体积的10）， 迅速混匀（若样品较多可先将混好的样品置于冰上）；室温下净置5 10分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离； 1.加200 l的氯仿，用手剧烈摇荡15秒，室温下静置5分钟左右； 2.2-8 ，12000g 离心10-15分钟； 3.将水相（上清）转入一新离心管，加0.5ml 异丙醇室温下沉淀10分钟 （或加入2倍体积无水乙醇-20 放置2h以上 ）； 3. 2-8 ，12000g 离心15分钟，弃上清，加1ml 75乙醇清洗RNA，振 荡片刻后（务必使沉淀悬浮起来，以确保洗涤干净），7500g 离心5 ，小心弃上清； 5.室温静置15分钟，使RNA沉淀恰好干燥，加入20 l DEPC水于65 水浴溶解10分钟，保存于-70 ； 6.取2 l 琼脂糖电泳检测RNA质量。 RNA的琼脂糖凝胶电泳进行质量检测 1. 用乙二醛/甲酰胺对RNA进行预变性，然后进 行琼脂糖凝胶电泳 2. 用甲醛和二甲基亚砜对RNA进行预处理，在 含6或2.2mol/L甲醛的凝胶中电泳 3. 检测 0.5TBE 4. 电泳：1 MOPS（3-(N-吗啉基）丙磺酸 ） 80 150V 40 min 1h 有溴化乙锭存在时，电泳后28S rRNA和18S rRNA 在紫外灯下应当很清楚的看得到，还应当有一条由tRNA ，5.8S rRNA和5S rRNA组成的较模糊的迁移较快的带 。如果RNA没有降解， 28S rRNA的亮度应当是18S rRNA的2倍，且这两条带都没有弥散现象。 What does good or bad total RNA look like when separated in gel? Degradation Contaminant Good ？ CallusLeaf RNA降解的主要原因 1. 取样后没有立即抽提RNA； 2. 抽提过程中超作不当，样品量超过了许可的范围； 3. 样品运输、保藏不当，或RNA保藏不当，应放入- 70 ，而不是-20 ）； 4. 使用的溶液或器皿有RNase污染； 5. 琼脂糖变性胶（甲醛）电泳时pH值低于3.5。 RNA产量低的原因 1. 样品研磨不彻底，没有混匀，裂解不彻底 2. RNA没有完全溶解 DNA污染的原因 样品太多，所加试剂相对太少 用来分离RNA的样品中含有机溶剂（乙 醇，DMSO等），或碱溶液等 RT-PCR (Reverse transcription PCR) 实验目的：学习RT-PCR的原理及其操作过程 实验材料：水稻幼嫩叶片RNA 目前PCR技术只能扩增DNA模板，对RNA模板不 能直接扩增。mRNA反转录生成的cDNA可作为PCR的 模板进行扩增，这种在mRNA反转录后进行的PCR扩 增称为RT-PCR。 RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量 要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时 空表达的常用方法。 实验原理 DNase I: 是将单链或双链DNA同等程度的随机分解，生 成具有5P末端寡核苷酸的脱氧核糖核酸内切酶。体外 转录后除去模板DNA。 反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶。如常见的鼠白 血病毒反转录酶 M-MLV RT的两种关键酶 本实验以水稻叶片RNA为材料，检测水稻种子大 小基因GS5突变体(或内源任意基因)的基因表达； 实验中设置一个内参基因作为阳性对照，判断 RNA的定量及反转录、PCR等过程是否有问题； 设置一个不加模板RNA的阴性对照，主要是消除 DNA及PCR试剂方面引起的假阳性； 同时设置一个以叶片DNA为阳性对照，检验扩增 带型是否来源于反转录的cDNA。 实验设计 操作步骤（一）RNA Preparation 1. Prepare the plant total RNA by TRIzol Reagent； 2. Test the RNA concentration by Nano2000； 3. Combine the following in a 0.5 ml sterile eppendorf tube: Total RNA x l (5g) RNase-free DNase l (u / l) 10 DNase buffer 1 l add DEPC-treated ddH2O to 10l 4. Incubate at 37 or room-temperature for 15 min, then adding 50mM EDTA 1l and, incubated at 70 for 10 min to inactive DNase I； 操作步骤（二）Reverse Transcriptase Reaction 5.500 g / ml oligo (dT) 15 1 l 5 first strand buffer 4 l 10 mM dNTP 1 l M-MLV (200 U / l) 1 l RNase Inhibitor 1 l DEPC H2O 1 l 20 l 6. incubate at 37 for 1 h. (The total volume should now be 20 l) ； 7. Inactive the reaction by heating at 70 for 10 min, then the first strand of cDNA can be used as a template for amplification in PCR；add 20-60ul ddH2O; -20-70 ; 8. To remove the RNA complementary to the cDNA, add 1 l (2 units) of RNase H and incubate at 37 for 20 min. 1. 在冰上配制下列反应体系 : First strand cDNA 2l Taq (5 u / 1 l) 0.3 l 10 Ex Taq buffer2 l dNTP mixture (2 mM)2 l Primer F (10 mM) 0.25 l Primer R (10 mM) 0.25 l ddH2O 13.2 l 操作步骤（三）: PCR 2. PCR反应循环条件设置： 根据引物及基因的表达水平设 置循环参数：如扩增片段的长度及mRNA 的丰度等； 3. 检测：加2 l溴酚蓝，混匀，取15 l反应产物电泳； 4. 在1%的琼脂糖凝胶上点样电泳；EB染色，紫外观察。 1.Taq酶过多； 2.Mg2+浓度不合适：Optimize Mg2+ in a ladder of 0.5 mM; 3.引物不特异、浓度过高、Tm值过高、引物形成二聚体; 4.复性温度过低：三度幅度梯度提高; 5.循环次数过多； 6.模板量过多。 PCR产物的电泳检测时出现拖带或 非特异性扩增带的可能原因 1.点样或染胶问题; 2.反应体系中忘记加入某种成分(无扩增产物）或分装mixture时 出了问题； 3.目的片段太大，使用的DNA Polymerase无法扩增出目的片段 ； 4.DNA溶液中或反应体系中含有Taq酶抑制剂； 5.退火温度太高； 6.Taq 酶活力不够或其他试剂有问题； 7.引物设计不合理，与模板不配对等。 导致PCR产物很少或无扩增产物的原因 （李一博等，2011） RT-PCR与Northern杂交分析结果示意图（GS5） Li et al. Nat Genet (2011) Real-time PCR=Quantitative RT-PCR (qRT-PCR) 1. 至少三个生物学重复; 2. 提取高质量的、完整的RNA(A260/A2801.8且A260/A2302.0) ； 3. 去除基因组DNA; 4. 所有的测验汇总使用相同的引物策略与反应条件; 5. 利用内参基因来检测cDNA的质量与产量; 6. 设计基因特异的PCR引物; 7. 通过最小化和规范化实验步骤来减少技术误差; 8. 至少用4个文献中已报道的内参基因; 9. 对每一个样品的测试基因与内参基因进行平行的测试; 10. 确定哪一个内参基因对所有样品均是最优的内参; 11. 综合考虑内参与测试基因的PCR效率和Ct 值来计算表达水平。 Eleven Golden Rules of Quantitative RT-PCR Udvardi MK et al. Plant Cell 20:1736-1737 (2008) 重点 1. RNA的抽提：降解的原因、质量的好坏； 2. RT-PCR、qRT-PCR的原理及注意事项。 总成绩： 平时实验占50%+实验报告占50% 写三个综合性实验的实验报告，实验报告要求： 1摘要：一两句话交待实验目的、材料和方法、主要的实验结果； 2前言：简单说明实验的背景、目的、意义 3材