体内药物分析方法的建立与验证ppt课件

第四章第四章 体内药物分析体内药物分析 方法的建立与验证方法的建立与验证 *1体内药物分析 F分析方法的设计依据 F分析方法建立的一般步骤 F分析方法验证的内容与要求 F体内药物分析应用示例 本章内容提要 第四章 分析方法的建立与验证 Date2体内药物分析 第一节 分析方法的设计依据 建立分析检测方法的主要依据 待测药物的理化性质及在生物体内的存在状况 分析测定的目的与要求 生物样品的类型与预处理方法 实验室条件 第四章 分析方法的建立与验证 Date3体内药物分析 一、待测药物的理化性质及体内存在状况 准确测定生物样品中的药物或其特定代谢物 预处理待测物从结合物或缀合物中释放 选择样品预处理方法首先应考虑 待测药物的理化性质 药物在生物体内的存在状况 药物在生物体内的生物转化(代谢)途径 第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据 Date4体内药物分析 (一)待测药物的理化性质 药物的pKa值、亲脂性、溶解度、分配系数等预处理及检测方法 具有亲脂性在适当的pH值下用溶剂萃取 具有强极性或亲水性沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或衍 生化后萃取等 具有挥发性GC测定法 具有光谱或电化学特性分析检测方法 药物的稳定性萃取浓缩技术 对酸碱不稳定避免使用强酸或强碱性溶剂 对热不稳定避免高温蒸发溶剂 第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据 Date5体内药物分析 (二)待测药物的体内存在状态 与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低 分离萃取方法 蛋白结合较强不宜直接采用溶剂萃取 体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物 分析检测技术 浓度较低（尤其有代谢产物共存） 代谢产物的干扰与特定代谢产物的同时测定 采用LC-MS、EIA等分析检测技术 第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据 Date6体内药物分析 二、分析测定的目的与要求 体内药物分析的目的影响分析方法的应用 药代动力学研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程 血浆浓度随时间的变化过程；代谢途径及代谢产物 要求 同时测定原形药物和代谢产物 检测 宽线性范围(CmaxCmax的1/20)、高灵敏度(10-9g/ml)和高专属 性(分离能力)(原形药物及其代谢产物的分离) 方法 不必强调方法的简便、快速； 大多采用色谱及其脱线或在线联用技术，如HPLC、LC-MS 第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据 Date7体内药物分析 二、分析测定的目的与要求 临床治疗药物监测 有效治疗浓度范围内药物浓度 方法尽量简便、易行；适用于长期、批量样品的测定 大多采用UV、RIA或EIA等 中毒患者的临床抢救 药物浓度极高 方法不必强调方法的灵敏度，强调方法的特异性和分析速度 大多采用色谱及其联用技术GC、GC-MS、RIA或EIA 第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据 Date8体内药物分析 三、生物样品的类型与预处理方法 生物样品的类型与预处理方法决定分析方法的应用 以血浆或血清为分析样品 采用蛋白沉淀-溶剂萃取预处理技术 分析样品较为“干净”，可用HPLC检测 用RIA分析 样品的预处理方法可较为粗放 经过简单的蛋白沉淀或不经任何预处理直接测定 第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据 Date9体内药物分析 四、实验室条件 在设计体内药物分析方法时，还应充分考虑 到实验室现有的或有可能在其它实验室使用的仪 器装备，合理选择可行的分析方法。 第四章 分析方法的建立与验证 第一节 分析方法的设计依据 Date10体内药物分析 第二节 分析方法 建立的一般步骤 一、分析方法的选择一、分析方法的选择 二、分析方法的建立二、分析方法的建立 ( (一一) ) 检测条件的筛选检测条件的筛选 ( (二二) ) 分离条件的筛选分离条件的筛选 第四章 分析方法的建立与验证 Date11体内药物分析 一、分析方法的选择 体内药物分析方法的设计 生物样品中的药物浓度决定分析方法的首要因素 生物样品中药物或其特定代谢产物的浓度低、样品量少 难以通过增加取样量提高方法灵敏度 通过选择适当的分析方法适应样品分析需求 体内药物分析中常用分析方法特点见表4-1 第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤 Date12体内药物分析 二、分析方法的建立 分析方法建立之前 查阅文献资料充分了解药物在体内的动力学过程，使所 拟定的分析方法 避免受到代谢产物的干扰适用于实际生物样品测定 第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤 Date13体内药物分析 二、分析方法的建立 初步拟定分析方法后 进行一系列试验工作选择最佳分析条件 同时验证分析方法的可行性确认是否适用于实际生物样品 F 分析方法的建立和验证过程是不可截然划分的 为便于讨论而分别叙述 F 分析方法的建立步骤 第一步：检测条件的筛选第一步：检测条件的筛选 第二步：分离条件的筛选第二步：分离条件的筛选 第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤 Date14体内药物分析 (一)检测条件的筛选 标准物质 照拟定的分析方法(不包括生物基质的预处理)测定 确定最佳分析检测条件(如色谱条件)和检测灵敏度 HPLC 调整检测器(类型、条件) 色谱柱(型号、牌号、填料性状与粒经、柱长度) 流动相(组分及其配比)及其流速 柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量等 使各物质具有足够的方法灵敏度(LOQ) 良好的色谱参数(n、R、T) 适当的保留时间(tR) 第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤 Date15体内药物分析 (二)分离条件的筛选 在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性物质及代谢 产物对分离与检测的干扰，步骤如下： 1空白溶剂试验 溶剂(方法特异性) 2空白生物基质试验 endogenous compounds(方法特异性) 3模拟生物样品试验 方法效能指标 4实际生物样品测试 代谢产物(方法特异性) 第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤 Date16体内药物分析 1空白溶剂试验 待测药物的非生物基质溶液（通常为水溶液） 采用拟定的分析方法进行衍生化反应、萃取分离等 样品预处理（反应试剂、衍生化试剂、萃取溶剂等） 测定响应信号（如HPLC峰面积或峰高） 考察目标 方法的特异性 空白值应尽可能小，并能有效校正 第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤 Date17体内药物分析 色谱分析法 可通过改变反应条件、萃取方法或萃取条件（萃取溶剂的 极性、混合溶剂的配比，固相萃取填料性质、冲洗剂与洗脱剂及其用 量等），甚至检测器类型 空白试剂信号应不干扰药物的测定（如R1.5） 本步骤主要考察 需经化学反应的预处理过程，若预处理过程仅为生物样品 的提取分离，则可不进行该步骤，直接进行空白生物基质试验 第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤 Date18体内药物分析 2. 空白生物基质试验 空白生物基质 (blank biological matrix) 如空白血浆 照 “1. 空白溶剂试验” 项下方法操作 考察目标 生物基质中内源性物质对测定的干扰（方法特异性） 在待测药物(或特定的活性代谢物、内标物质等)的“信号窗 ”（信号附近的有限范围）内不应出现内源性物质信号 第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤 Date19体内药物分析 3. 模拟生物样品试验 模拟生物样品(质量控制,QC样品)空白生物基质中加入待测药物 照 “1. 空白溶剂试验” 项下方法操作 考察目标 方法的线性范围、精密度与准确度、灵敏度 药物的萃取回收率等各项技术指标 同时进一步检验生物基质中内源性物质以及可能共同使用的 其他药物对测定的干扰程度，即方法特异性 第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤 Date20体内药物分析 色谱分析法 进一步考察待测药物(或内标物)与内源性物质(或其它药物)的 分离情况 色谱峰的 tR、n 和 T 是否与水溶液的一致 色谱峰是否为单一成分 标准曲线的截距是否显著偏离零点等 内源性物质是否对待测药物或内标物质构成干扰 第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤 Date21体内药物分析 4. 实际生物样品的测试 空白生物基质和模拟生物样品试验确定的分析方法及其条件 不能完全确认是否适合于实际生物样品的测定 药物在体内可能与内源性物质结合(如血浆蛋白结合物) 或代谢生成数个代谢产物及其进一步的结合物(或缀合物) 实际生物样品确立分析方法后，尚需进行实际生物样品的测试 考察目标代谢产物对药物、内标物质的干扰情况 进一步验证方法的可行性 第四章 分析方法的建立与验证 第二节 分析方法的建立步骤 Date22体内药物分析 第三节 分析方法 验证的内容与要求 用于实际生物样品分析之前 验证 (validation) 分析方法的可行性与可靠性 方法验证时应考虑影响分析方法 所有可变因素(采样,样品制备,色谱分离,检测与数据评价等) 使用的技术指标 效能指标 使用的样品 通常采用模拟生物样品和用药后的实际生物样品 第四章 分析方法的建立与验证 Date23体内药物分析 验证步骤 首先为分析方法的验证 特异性、精密度与准确度、回收率 定量限与检测限、溶液稳定性 其次为生物基质中待测药物稳定性的验证 室温放置、冷冻（或冷藏）、冻-融循环 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date24体内药物分析 验证的效能指标与基本要求 1特异性避免干扰 2标准曲线与线性范围覆盖所有浓度范围 3准确度与实际状况相符 4精密度结果可重现 5定量限达到峰浓度的1/101/20 6稳定性确保所有样品准确测定 7提取回收率确保准确度 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date25体内药物分析 一、方法特异性(专属性或选择性) 方法的特异性(specificity) 又称专属性或专一性，通常与选择性(selectivity)互用 系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力 专属性表示所检测的信号(响应)系属于待测药物所特有的 选择性系指将待测物质与其代谢物及同服的其它药物加以区 分(分离)的能力 特异性函盖二者，以验证所测定的物质与待测药物的同一性 考察一个分析方法是否具有特异性，应着重考虑以下几点： 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date26体内药物分析 1. 内源性物质的干扰 比较待测药物或其活性代谢产物检测信号 对照品（或标准品） 空白生物基质 模拟生物样品（空白生物基质中添加对照品） 如HPLC色谱峰的 tR、n 和 T 是否一致 及与内源性物质色谱峰的 R 确证内源性物质对分析方法有无干扰 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date27体内药物分析 2. 代谢产物的干扰 比较模拟生物样品和用药后的实际生物样品的检测信号 与代谢产物(在实际样品中 tR 随时间延长而增加)的 R 如HPLC色谱峰的 tR、n 和 T 或改变色谱条件(色谱柱)再比较 确证其它代谢产物对分析方法有无干扰 结构已知的特定活性代谢物的测定 必要时通过HPLC-DAD和LC-MS确证色谱峰的单纯性和同一性 对于结构未知的代谢产物的测定 可采用LC-LC-NMR进行结构的初步推测后，考察其干扰情况 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date28体内药物分析 3. 伍用药物的干扰 TDM 时 还要考虑患者可能同时服用药物(通常为数有限)的干扰 比较待测药物及可能同时服用药物的模拟生物样品的检测信号 如HPLC色谱峰的 tR、n 和 T 是否一致 确证同时服用药物对分析方法的干扰情况 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date29体内药物分析 4. 与参比方法的相关性 除上述方法外，有时还可使用参比方法对照 参比方法一般选用特异性强、准确度高、线性关系良好的色谱法 如在TDM中使用UV(或RIA)时, 可以HPLC(或GC)为参比 参比方法测定结果为横坐标(X); 拟定方法结果为纵坐标(Y) 用最小二乘法计算回归方程 YabX (坐标标度相等) 相关系数(r)表示两种方法测得结果的一致性 若 r 1，表示拟定方法为非线性，如 RIA 中抗血清滴度选择 不当 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date30体内药物分析 4. 与参比方法的相关性 YabX 截距(a) 表示拟定方法受到恒定干扰的程度内源性物质(UV) 斜率(b) 表示拟定方法受到比例干扰的程度标记抗原不纯(RIA) 与参比方法的相关性比较除显示分析方法的特异性外 斜率b表示两种方法测得结果的一致性 若参比方法准确度良好 若截距a0, 则拟定方法的准确度(回收率)为100b(%) 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date31体内药物分析 二、标准曲线与线性范围 标准曲线（standard curve） calibration curve or working curve 生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性（比例的程度） 通常用回归分析方法所得的回归方程来评价 除少数方法（免疫分析法）外，标准曲线通常为线性模式 回归分析法为最小二乘法（least squares） 或加权最小二乘法（weighted least squares） 线性范围（linear rang）标准曲线的最高与最低浓度的区间 模拟生物样品的测定结果应达到试验要求的精密度和准确度 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date32体内药物分析 二、标准曲线与线性范围(续) 标准曲线用模拟生物样品建立 线性范围(不包括零点)应能覆盖全部生物样品中的药物浓度 不能使用外推的方法求算未知生物样品中的药物浓度 建立标准曲线所使用的模拟生物样品 应使用与待测的含药生物样品相同的生物基质制备 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date33体内药物分析 标准曲线的一般建立方法 1. 标准系列溶液(非生物基质溶液)的制备 溶剂水或甲醇（或其他适当溶剂） 浓度标准模拟生物样品中药物浓度的 50倍以上 加入量为生物样品总体积的 2%以下 避免标准模拟生物样品与实际样品存在较大差异 浓度较低应除去溶剂后再加入生物基质 否则,在实际样品测定时应加入等体积的溶剂并涡旋混匀 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date34体内药物分析 2. 标准系列溶液的浓度范围 至少含58个浓度点(不包括零点,即空白) 可覆盖全部待测生物样品中的药物浓度 如：1、2、5、10、20、50、100(等比梯度模式比例常数约为 2) 若体内平均达峰浓度为50，其1/20为2.5 设定最高浓度为100，最低浓度为1 (个体差异) 实际制备时：500、250、100、50、20、10 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date35体内药物分析 3. 标准系列模拟生物样品的制备 空白生物基质(如血浆)加入标准系列溶液适量，涡旋混匀 为防止在标准溶液加入及涡旋混合时造成的损失 先加入标准溶液 再加入空白生物基质 涡旋混匀 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date36体内药物分析 4. 标准曲线的绘制 以待测药物的检测响应(如色谱峰面积或峰高) 或与内标物质的检 测响应的比值(内标法)(因变量, y )对模拟血药浓度 (自变量,x) 求得回归方程( yabx )及其相关系数( ) 在一组由至少7个浓度(不包括零点)构成的标准曲线中，至多可 有2个浓度点数据，可予剔除。但应有确切原因，如： 样品处理有损失、色谱图有问题，或 显著偏离标准曲线该数据参与标准曲线回归后，计算QC 样品或返算该点浓度时显著偏离其标称浓度(配制浓度) 其余应有至少5个浓度点在标准曲线上 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date37体内药物分析 5. 加权最小二乘法 最小二乘法每个浓度点绝对误差(yiyi)赋予同等的重要性 标准曲线上的高低浓度相差悬殊(范围达102) 低浓度区的计算值相对误差过大，难以满足规定要求 加权最小二乘法回归计算时增加一个权重因子(w) 各浓度的响应值与回归值的相对离差平方和达到最小 式中，wi为标准曲线上第i个浓度点的权重因子 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date38体内药物分析 1）回归方程(y = a + b x)参数的计算 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date39体内药物分析 2）权重因子的选择 加权赋予低浓度点以更大的权重 在实际工作中的一般方法 当wi=1/(yi)2时，则 而yi与xi成正比 所以，令wi=1/(bxi)2=k/xi2 (通常取wi=1/C2) 当高浓度点测量值的准确度下降过大 低浓度点权重过大，降低低浓度点的权重，wi=k/xi 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date40体内药物分析 标准曲线的限度要求 药代动力学或生物利用度研究 标准曲线至少包括5个浓度(通常为58个浓度,不包括零点) 最高浓度应高于达峰浓度(Cmax)；最低浓度应低于Cmax的 10%5%，并应为方法的LOQ(非LOD) 回归方程的截距应接近于零 相关系数要求 0.99(色谱法)或0.98(生物学方法) 若非线性，可分为高低两个浓度区间(每个区间不少于5个浓 度)，分别加权回归如1、2、5、10、20和10、20、50、100、200 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date41体内药物分析 三、准确度 方法准确度(accuracy) 系指用该方法测得的生物样品中待测药物的浓度与其真实浓 度的接近程度 应使用实际生物样品测定，但实际生物样品的浓度是未知的 所以，通常使用模拟生物样品测定 一般用相对回收率(relative recovery，RR) 或 相对误差 (relative error，RE)表示 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date42体内药物分析 1. 测定法 取空白生物基质（如血浆）数份，照标准曲线项下方法操作，用 标准曲线计算 在标准曲线范围内制备质控(quality control，QC)样品 高(接近上限)、中、低(接近LOQ) 3个浓度 每一浓度至少5个样本 与随行的标准曲线同法测定、计算，每个样品分析测定1次 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date43体内药物分析 2. 结果计算与限度要求 计算 测定值M (measured)平均值与理论浓度(加入值)A(added)比值 相对回收率 相对误差 限度要求 相对回收率应在85%115% (LOQ附近80%120%) RE在15% (LOQ附近为20%) 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date44体内药物分析 四、精密度 方法精密度(precision ) 系指每次测定结果与多次测定的平均值的偏离程度 表示该分析方法的可重复性(reproducibility) 反映分析方法的可操作性，是方法验证的基本要点之一 实际生物样品的量有限(如血浆，一般为0.52ml) 使用模拟生物样品测定 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date45体内药物分析 1. 表示方法 方法精密度一般用标准偏差(standard deviation，SD)或相对标准 偏差(relative standard deviation，RSD)表示 SD= RSD= = 包括批内(within-run或intra-assay)RSD日内(within-day) 和批间(between-run或inter-assay)RSD日间(between- day，day-to-day) 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date46体内药物分析 2. 测定法分别测定法() 照准确度项下方法，取空白生物基质(如血浆)数份，分别在同一 批内和不同批间制备高、中、低 3个浓度的QC样品，并分析测定 批内RSD 每一浓度56个样品，每个样品测定1次，用随行标准曲线 分别计算3个浓度及每1浓度的RSD 批间RSD 每1分析批内每一浓度制备1个样品，每个样品测定1次；用 随行标准曲线计算3个浓度(每一浓度56个分析批数据)的RSD 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date47体内药物分析 2. 测定法连续测定法() 若实际样品测定所用的分析批次少于5批，也可进行3个批次的连 续分析(每1浓度的每1批次为56个样本)方差分析法 批间RSD = 批内RSD = = 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date48体内药物分析 3. 限度要求 在药代动力学和生物利用度研究中 对g/ml级水平的RSD一般应10% ng/ml级水平的RSD一般应15% 在LOQ附近RSD应20%。 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date49体内药物分析 五、定量限 方法定量限(limit of quantitation，LOQ) 系指在保证具有一定可靠性(准确度与精密度符合要求)的前 提下，能测定出生物样品中药物的最低浓度 又称为方法灵敏度(sensitivity) 标准曲线上的最低浓度点(最低浓度点LOQ) 要求 应能满足测定35个消除半衰期后生物样品中的药物浓度 准确度在80%120%(或RE在20%的范围内) RSD20% 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date50体内药物分析 六、稳定性与质量控制 稳定性包括方法稳定性和样品稳定性 方法稳定性方法的耐用性 样品稳定性生物样品的存放条件和时间、冻-融循环 测定法QC样品穿插于实际样品测定全过程 模拟(或实际)生物样品及其预处理后的待测溶液进行考察 要求 准确度85%115%(RE在15%范围内)，RSD15% 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date51体内药物分析 七、萃取回收率 生物样品的预处理方法 重点考虑方法准确度(或相对回收率)，操作简便、快速 萃取回收率(绝对回收率，absolute recovery)，70% 萃取回收率与相对回收率的意义不同 萃取回收率考察生物样品预处理过程造成的药物的程度损失 相对回收率采用标准曲线可准确计算生物样品中药物浓度 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date52体内药物分析 1. 测定法 取空白生物基质(如血浆)，照准确度项下方法，制备高、中、低 3个浓度的QC样品(每一浓度至少5个样品)，每个样品分析测定1次 另取等量的相同3个浓度的标准溶液，用溶解模拟生物样品经提 取处理后的残渣的溶剂稀释至同体积，同法测定 AT经萃取后的QC样品的检测信号或比值(内标法) AS未经萃取的标准溶液的检测信号或比值(内标法) 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date53体内药物分析 2. 限度要求 萃取回收率一般应50% 高、中浓度的RSD应15% 低浓度的RSD应20%。 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date54体内药物分析 第四节 体内药物分析方法 应用示例 第三代喹诺酮类广谱抗菌药盐酸环丙沙星片人体生物等效性研究 一、文献调研 性质在水中溶解，在甲醇中微溶，在乙醇中极微溶解，在氯 仿中几乎不溶，在氢氧化钠试液中易溶；环丙沙星游离体在水中不溶 ，在乙醇、二氯甲烷中极微溶解，在稀醋酸中溶解。 第四章 分析方法的建立与验证 Date55体内药物分析 药动学参数 吸收过程空腹口服后吸收迅速、人体生物利用度约为49%70% Cmax 口服500mg后平均Cmax为2.42.6mg/L Tmax 12h T1/2 血中T1/2约为4h，肾功能减退时稍有延长至6h 蛋白结合率20%40% 代谢 口服给药24h内，40%50%原形、15%代谢物经肾排出 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date56体内药物分析 体内分析方法 RP-HPLC 色谱柱ODS色谱柱 流动相甲醇(乙腈)-磷酸(枸橼酸)缓冲液(三乙胺调节pH2.3 3.5)，或离子对色谱: 溴化十六烷基三甲基铵(氢氧化四丁基铵) 检测紫外或荧光检测 生物样品预处理 蛋白沉淀法甲醇、乙腈或高氯酸沉淀蛋白后直接进样 溶剂萃取法二氯甲烷-异丙醇、氯仿-异丙醇混合溶剂 蛋白沉淀-溶剂萃取乙腈沉淀蛋白后二氯甲烷-异丙醇提取 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date57体内药物分析 二、分析方法设计 1分析方法 血浆蛋白结合率低(20%40%)、以原形从肾排泄 生物等效性研究测定血浆中环丙沙星原形药物的浓度-时间曲 线。初步拟定：采用RP-HPLC法 2检测方法 紫外灵敏度1ng，若取血浆0.5ml，采用3倍量乙腈沉淀蛋 白，取上清液100l进样，则要求血浆中环丙沙星浓度在50ng/ml以上 ，当Cmax在2g/ml以上(口服500mg)时基本可满足生物等效性研究要求 荧光灵敏度0.1ng，能满足本试验要求 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date58体内药物分析 二、分析方法设计（续） 3样品制备方法 初步拟定采用简便、快速的乙腈沉淀蛋白后取上清液直接进 样分析 预试含75%乙腈的提取液100l进样后，色谱峰理论板数、对 称性下降(前沿峰)，进而导致检测灵敏度降低(峰高降低) 经进一步试验，确定为： 血浆0.5ml乙腈1ml沉淀蛋白二氯甲烷-异丙醇(95:5)5ml萃取 60氮气流吹干流动相200l溶解20l进样 灵敏度可达2ng/ml(血浆浓度)，符合要求(Cmax2g/ml) 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date59体内药物分析 三、实验方案 1给药方案 20名受试者随机分为两组，每组10人 第1次试验第一组口服受试制剂(相当于环丙沙星 500mg)，第二组口服相同剂量的参比制剂 第2次试验第1次服药后第7天开始，两组交换给药 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date60体内药物分析 三、实验方案（续） 2血样的采集与处理 分别口服给药前和给药后0.25、0.5、1.0、1.5(tmax)、2.0、3.0、 4.0、6.0、8.0、12.0和24.0(57个t1/2)小时 由肘正中静脉取血 4 ml 立即移入经肝素处理的离心试管中，静置5分钟后，离心15分钟 (3000rpm)，分离血浆 -20冰箱中保存待测 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date61体内药物分析 三、实验方案（续） 3血样分析法 色谱条件 高效液相色谱仪(包括LC-10ATvp泵，RF-530荧光检测器)； 色谱柱为Kromasil ODS-AP(200mm4.6 mm，5m) 流动相为乙腈-0.025mol/L磷酸溶液(86:14)，流速1.0ml/min 检测波长为ex=277nm，em=445nm 柱温为40。 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date62体内药物分析 三、实验方案（续） 3血样分析法 血浆样品的预处理 取血浆0.5ml，加内标溶液(10g/ml诺氟沙星甲醇溶液）50 l、乙 腈1.0ml，涡旋混合30s，离心5min，取上清液1ml，加二氯甲烷-异丙 醇(95:5)混合溶剂5ml，涡旋振荡1min，离心5min，弃去上层水相，吸 取下层有机相，60下氮气流吹干，残渣加流动相200l，涡旋溶解 30s，离心5min，取上清液20l进样 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date63体内药物分析 四、分析方法验证 1方法特异性 环丙沙星峰tR=12.4min，诺氟沙星(内标物质)tR=10.9min，各峰均 获得完全分离，内源性物质峰(与空白血浆样品一致)tR=8.6min对测定 无干扰 志愿者用药后的血浆样品色谱图中环丙沙星与内标物质峰与模拟 血浆样品中环丙沙星与内标物质峰的tR、T、n和R均一致，峰形相同。 故不认为代谢物有干扰 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date64体内药物分析 四、分析方法验证(续) 2标准曲线 标准系列溶液取盐酸环丙沙星，加水制成1、2、5、10、20 和50g/ml的标准系列溶液，冰箱保存 标准系列模拟血浆样品取空白血浆0.5ml，加环丙沙星标准系 列溶液各50l，配制成相当于浓度为0.1，0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 g/ml的QC样品，冰冻(-20) 测定法取QC样品，照“血浆样品的预处理”项下方法操作， 以环丙沙星浓度C为横坐标，环丙沙星与内标物质的峰面积比值Y为纵 坐标，用加权最小二乘法经Excel运算，求得的直线回归方程为： Y=1.33C-0.02583，R2=0.9951(C=0.15.0 g/ml) 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 Date65体内药物分析 四、分析方法验证(续) 3方法精密度与准确度 QC样品 浓度为 0.1、0.5 和 2.0 g/ml 分析批次3批，每批 5 样品 测得浓度0.0988、0.4537 和 2.128 g/ml 准确度 RE(%) -1.2%、-9.3% 和 6.4% 精密度 批内(%) 6.7%、4.6% 和 3.9% 批间(%) 8.9%、9.6% 和 12.3% 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 表4-2 血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果 分析批次 加入量（ng/ml） 100.0500.02000 1 100.8457.12179.6 95.7451.02212.1 105.4438.02084.9 105.1447.12129.3 104.3449.02190.1 106.4469.42135.2 2 96.9465.72168.1 98.5497.92192.6 95.7468.12207.1 105.9487.82251.3 95.8456.82252.2 86.3456.82240.9 3 97.6450.71911.6 103.8446.91993.0 99.5436.62115.7 105.3427.51990.5 82.4416.21847.1 93.7443.72203.6 N181818 （ng/ml）98.8453.72128.0 SD 6.8 19.7 118.7 RE（%）-1.2 -9.3 6.4 批内RSD（%） 6.7 4.6 3.9 批间RSD（%） 8.9 9.6 12.3 表4-2 血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果 分析批次 加入量（ng/ml） 100.0500.02000 1 100.8457.12179.6 95.7451.02212.1 105.4438.02084.9 105.1447.12129.3 104.3449.02190.1 106.4469.42135.2 2 96.9465.72168.1 98.5497.92192.6 95.7468.12207.1 105.9487.82251.3 95.8456.82252.2 86.3456.82240.9 3 97.6450.71911.6 103.8446.91993.0 99.5436.62115.7 105.3427.51990.5 82.4416.21847.1 93.7443.72203.6 N181818 （ng/ml）98.8453.72128.0 SD 6.8 19.7 118.7 RE（%）-1.2 -9.3 6.4 批内RSD（%） 6.7 4.6 3.9 批间RSD（%） 8.9 9.6 12.3 Date66体内药物分析 四、分析方法验证(续) 4方法定量限 受试制剂和参比制剂的Cmax分别为 3.2020.496和3.3000.730 g/ml 方法的LOQ为0.1 g/ml 0.16 g/ml (Cmax的1/20) 准确度和精密度均符合要求：RE为-1.2% 日内RSD为 6.7% 日间RSD为 8.9% 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 表4-2 血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果 分析批次 加入量（ng/ml） 100.0500.02000 1 100.8457.12179.6 95.7451.02212.1 105.4438.02084.9 105.1447.12129.3 104.3449.02190.1 106.4469.42135.2 2 96.9465.72168.1 98.5497.92192.6 95.7468.12207.1 105.9487.82251.3 95.8456.82252.2 86.3456.82240.9 3 97.6450.71911.6 103.8446.91993.0 99.5436.62115.7 105.3427.51990.5 82.4416.21847.1 93.7443.72203.6 N181818 （ng/ml）98.8453.72128.0 SD 6.8 19.7 118.7 RE（%）-1.2 -9.3 6.4 批内RSD（%） 6.7 4.6 3.9 批间RSD（%） 8.9 9.6 12.3 表4-2 血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果 分析批次 加入量（ng/ml） 100.0500.02000 1 100.8457.12179.6 95.7451.02212.1 105.4438.02084.9 105.1447.12129.3 104.3449.02190.1 106.4469.42135.2 2 96.9465.72168.1 98.5497.92192.6 95.7468.12207.1 105.9487.82251.3 95.8456.82252.2 86.3456.82240.9 3 97.6450.71911.6 103.8446.91993.0 99.5436.62115.7 105.3427.51990.5 82.4416.21847.1 93.7443.72203.6 N181818 （ng/ml）98.8453.72128.0 SD 6.8 19.7 118.7 RE（%）-1.2 -9.3 6.4 批内RSD（%） 6.7 4.6 3.9 批间RSD（%） 8.9 9.6 12.3 Date67体内药物分析 四、分析方法验证(续) 第四章 分析方法的建立与验证 第三节 分析方法的验证与要求 表4-2 血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果 分析批次 加入量（ng/ml） 100.0500.02000 1 100.8457.12179.6 95.7451.02212.1 105.4438.02084.9 105.1447.12129.3 104.3449.02190.1 106.4469.42135.2 2 96.9465.72168.1 98.5497.92192.6 95.7468.12207.1 105.9487.82251.3 95.8456.82252.2 86.3456.82240.9 3 97.6450.71911.6 103.8446.91993.0 99.5436.62115.7 105.3427.51990.5 82.4416.21847.1 93.7443.72203.6 N181818 （ng/ml）98.8453.72128.0 SD 6.8 19.7 118.7 RE（%）-1.2 -9.3 6.4 批内RSD（%） 6.7 4.6 3.9 批间RSD（%） 8.9 9.6 12.3 表4-2 血浆中环丙沙星HPLC测定法的准确度与精密度考察结果 分析批次 加入量（ng/ml） 100.0500.02000 1 100.8457.12179.6 95.7451.02212.1 105.4438.02084.9 105.1447.12129.3 104.3449.02190.1 106.4469.42135.2 2 96.9465.72168.1 98.5497.92192.6 95.7468.12207.1 105.9487.82251.3 95.8456.82252.2 86.3456.82240.9 3 97.6450.71911.6 103.8446.91993.0 99.5436.62115.7 105.3427.51990.5 82.4416.21847.1 93.7443.72203.6 N181818 （ng/ml）98.8453.72128.0 SD 6.8 19.7 118.7 RE（%）-1.2 -9.3 6.4 批内RSD（%） 6.7 4.6 3.9 批间RSD（%） 8.9 9.6 12.3 血浆冰冻血浆冻融残渣冷藏室温放置 时间 （d） As/Ai 循环 （次 ） A