hla基因分型方法研究进展(1)

HLAHLA 基因分型方法研究进展基因分型方法研究进展(1)(1) 【关键词】分型 人类白细胞抗原（liumanLeukocyteAntigen，HLA）是 位于人类第 6 号染色体短臂上一组紧密连锁的基因群，是 目前人体中最具有多态性的遗传系统，由三类基因组成， 即类基因、类基因和类基因，可以作为一个遗传单 位或单倍型（haplotype）而遗传给下一代，属共显性等位 基因1 。人类白细胞抗原（HLA）系统是机体免疫系统的 重要组成部分，在机体的抗原呈递和免疫应答中发挥重要 作用。HLA 基因与人类多种疾病的发生、发展和预后密切相 关。 人类的 I 类基因位点命名为 HLAA、HLAB、HLA-C， 分布于所有的组织细胞上，为细胞膜上的移植抗原，是引 起移植后排斥反应发生的主要抗原。类基因则命名为 HLAD，HLAD 又分为 HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP 等亚区， 主要分布于免疫细胞上，它们可以作为免疫细胞间识别标 记而诱发免疫应答和调节免疫细胞间的相互作用，在免疫 应答反应中发挥重要作用。类基因区位于 HLA-I、类基 因区之间，由一些与补体和某些炎症因子编码相关的基因 组成。这些基因在机体的免疫及机体对外界环境的适应性 方面均有重要作用。准确的 HLA 抗原分型技术无疑在基础 研究和临床应用上都有很重要的意义,本文就近年来 HLA 基 因分型研究进展加以综述。 Terasaki 等（1964 年）最早创造了简便易行、敏感可 靠、重复性好的微量淋巴细胞毒试验，为 HLA 的血清学研 究开启了大门。随后随着分子生物学技术的不断发展，HLA 分型方法分别经历血清学分型、细胞学分型和 DNA 分型三 个阶段。 1 血清学分型法 经典的 HLA 血清学分型方法是使用微量淋巴细胞毒试 验。但由于 HLA 等位基因序列的高度同源性，使血清学出 现较多较强的交叉反应，获得特异性高的抗体受到限制， 影响了分型结果的正确性。Mytilineos 等2用 DNA- RFLP 和血清学方法对 HLADR 分型进行比较，结果表明血 清学方法 HLA-DR 分型错误率竟在 25%以上，相比而言，对 于 HLA-I 类抗原，血清学分型结果可信度更大。但与 DNA 分型相比，即使用于 HLA-I 类抗原，血清学分型仍然会出 现错判或漏检，这是因为缺乏对抗原反应的特异性抗血清 或目的抗原被同一交叉反应组内另一抗原掩盖，尤其是用 于 B 位点的检测。1991 年，第 11 届国际组织相容性专题研 讨会对 HLA 血清学研究进行了总结，HLA 血清学研究大体告 一段落。 2 细胞学分型法 可用于测定 HLA-Dw 和 HLA-DPw 抗原的特异性。由于分 型所需的细胞来源困难及细胞表面抗原的复杂性，且方法 繁琐，因此细胞学方法不再作为常规分型，已逐渐被淘汰。 此外，用细胞学方法所检出的特异性均加上“w” ，以此与 补体成分相区别。 3 分子生物学分型法 80 年代后期，随着 PCR 技术的不断进步，分子生物学 分型方法被人们应用于 HLA 研究领域，最常见的方法有： SSP,SS0,SBT 等。 多聚酶链反应-限制性片段长度多态性 （polymerasechainreaction- restrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP） 3RFLP 分析是最早建立的研究 HLA 多态性的 DNA 分型技 术。不同等位基因由于其核苷酸序列不同，所以就有不同 的酶切位点和数目。酶切后产生不同长度、不同数目的 DNA 片段，经电泳、染色、紫外照射成像后即可确定 HLA 基因 型别。若 DNA 片段先扩增，再酶切即为结合 PCR 技术的 PCR-RFLP，提高了敏感度与准确性。Maeda 等4最早应 用以 PCR 为基础的 PCR-RFLP 技术对 HLA-类和类分子进 行了成功检测。但该类方法大多存在着操作复杂、容易产 生差错等弊病。 多聚酶链反应-序列特异性引物 （polymerasechainreaction- sequencespecificprimer，PCR-SSP） 5根据 HLA 核苷酸 碱基序列的多态性和已知的 DNA 序列，设计一系列等位基 因型别特异性序列引物，通过特定的 PCR 反应体系扩增各 等位基因的型别特异性 DNA 片段，产生相对应的特异性扩 增产物条带，然后通过凝胶电泳检测 PCR 产物。根据是否 得到 PCR 产物以及产物的片段大小来分型。其特点是操作 简单，对实验设备要求不高，扩增后处理过程十分简单。 但是 PCR-SSP 技术也存在着不足，该方法需要设计大量的 引物，对引物的设计和 PCR 条件要求很严，且容易造成污 染，产生假阳性，而且对样本 DNA 的用量也较大，给临床 应用带来了不便。 多聚酶链反应-序列特异性寡核苷酸反应 （polymerasechainreac-tion- sequencespecificoligonucleotideprobingPCRSSO 或 PCR- SSOP）对 HLA 的多态区域进行扩增，在扩增过程中对 PCR 产物进行同位素或非同位素标记，然后针对 PCR 扩增产物 根据碱基配对原则设计系列寡核苷酸探针固定在膜上，最 后将 PCR 产物与膜上的探针杂交、放射自显影，根据信号 判断结果为 PCR-SSOP 技术的基础。PCR-SSOP 技术用于 HLA 分型主要包括正相 SSOP 方法和反相 SSOP 方法两种,前者是 将 PCR 产物固定在膜上，用标记的探针与之进行杂交，后 者是将特异性探针固定在膜上。用标记的 PCR 产物与之杂 交。目前广泛采用的是反相 SSOP 方法。Yasunaga 等6 和 Dyer 等7对成功应用 PCR-SSOP 技术对 HLA 进行分型,并 且广泛应用。PCR-SSOP 技术具有灵敏度高、特异性强、需 样本量少的特点。但是由于所用的载体大多为膜或微滴定 板，对于复杂而众多的 HLA 等位基因来说，它不具有集成 化的优点，而且洗脱条件比较繁琐，难以标准化和自动化。 XX 年美国 ONELAMBDA 公司8和 LIFECODES 公司开发 出的 HLA 基因分型技术9 ，也称为序列微珠综合分析实 验系统，它利用传统 PCR-SSOP 的原理，样品首先进行非特 异性扩增。扩增产物经解链后与包被了特异性 HLADNA 探针 的微珠结合，在一种专用流氏细胞仪中检测，这种流氏细 胞仪可以分析在微珠表面的 SSO 探针与 DNA 样品之间的反 应情况。获得 HLA 分型结果。该系统具有较为明显的优势， HLA-A、B、DR 分型实验可以在一个单独的管内完成，数据 采集时间迅速，大约 15s1min。省时省力，比较适用于骨 髓库和脐血库的 HLA 配型。这是基于荧光流式细胞仪和免 疫标记技术相结合的一项新免疫学技术。它有机地整合了 有色微球、激光技术、应用流体学、最新的高速数字信号 处理器和计算机运算法则。微球的颜色是通过两种荧光染 料染色得到的，调节两种荧光染料的比例可以获得 100 种 不同颜色的微球，每种颜色的微球可以携带一种生物探针， 探针通过羧基结合到微球表面，因此 1 个反应孔内可以完 成 100 种不同的生物学反应。通过鉴定微球的颜色来确定 反应类型，而对反应的定量分析是通过靶物质上的