2型糖尿病中医湿热困脾证的基因表达研究(1)

2 2 型糖尿病中医湿热困脾证的基因表达型糖尿病中医湿热困脾证的基因表达 研究研究(1)(1) 作者：柴可夫黄晓玲钱俊文马纲 【摘要】 目的从分子水平探讨 2 型糖尿病湿热困脾 证的中医证候实质。 方法抽取 2 型糖尿病气阴两虚证患 者静脉血，检测血糖，血脂及电解质，分离血液中的白细 胞，提取总 RNA，化学发光方法检测基因芯片，用 ScanAlyze 软件采集图像，GEArrayAnalyzer 软件分析数据。 对部分差异表达基因进行 RTPCR 和 Westernblotting 方法验证。 结果2 型糖尿病湿热困脾证患者血糖，血脂， 电解质与健康人有显著差异，基因芯片检测发现和健康人 差异表达基因共 38 条，其中上调的基因有 24 条，下调的 基因有 14 条。并发现湿热困脾证的特异性基因。通过 RTPCR 和 Westernblotting 方法反向验证 IRS2 和 FOXC2 基因，证实 2 型糖尿病湿热困脾证患者和健康人白细 胞中存在 IRS2 和 FOXC2 存在差异表达。 结论应用基 因芯片筛选 2 型糖尿病湿热困脾证的差异表达基因，为 2 型糖尿病辨证论治提供新思路。 【关键词】 2 型糖尿病;基因芯片;辨证分型 糖尿病是一组由遗传和环境因素相互作用而引起的慢 性疾病。因胰岛素分泌绝对或相对不足以及靶组织细胞对 胰岛素敏感性降低，引起糖、蛋白质、脂肪、水和电解质 等一系列代谢紊乱为主要共同标志。本研究观察糖尿病湿 热困脾证的基因表达差异，探讨 2 型糖尿病湿热困脾证的 证候实质。1 临床资料 研究对象 对浙江中医药大学 附属第二医院糖尿病防治中心 400 例糖尿病患者进行中医 辨证分型，随机选取 6 例湿热困脾证患者，其中男性 3 例， 女性 3 例，年龄 30 岁至 65 岁之间，年龄（）岁。另选 取年龄与性别相匹配的健康人 6 例作对照，平均为（） 岁。健康对照组皆通过血糖检查排除糖尿病，通过病史调 查和体检、血象、肝肾功能、胸透、心电图等检查，排除 其它内分泌疾病和各系统器质性疾病。 现代医学诊断标准 根据 1999 年 WHO 专家咨询报告诊 断标准，空腹血糖（FPG）/L；或糖耐量试验（OGTT）中 服糖后 2 小时血糖（2HPG）/L；或随机血糖/L。 中医辨证标准 参照 XX 年版中药新药临床研究指导 原则（试行） 中“中药新药治疗糖尿病的临床研究指导原 则” ，湿热困脾证,主症：胸脘腹胀，或食后饱满，头身困 重。次症：体形肥胖，心胸烦躁，四肢倦怠，小便黄赤， 大便不爽。舌脉：舌红苔黄腻，脉滑而数。 病例纳入和排除原则 凡符合现代医学诊断标准和中 医辨证标准，可纳入试验病例。排除有糖尿病急性并发 症；经确诊为 1 型糖尿病，其它类型糖尿病及妊娠糖尿 病者；年龄在 40 岁以下或 70 岁以上，妊娠或哺乳期妇 女；有严重心、肝、肾等并发症，或合并有其它严重原 发性疾病，精神病患者。中医辨证症状不典型，或者两 型三型并见证型复杂者。 2 实验方法 一般情况 测量身高，体重。计算体重指数（BMI): BMI=体重（kg）/身高（m2） 。 生化检测 所有受试对象均于上午 8 时前空腹抽取肘 静脉血 10ml，用于测空腹血糖、血脂、糖化血红蛋白 （HbAlc） 、胰岛素抵抗指数（ISI=ln1/ ） 、血钙、血钾 等生化检测。 基因芯片检测 白细胞的提取与 RNA 的纯化 随机选取其中 3 名湿热 困脾证糖尿病患者和 3 名健康人抽取静脉血 5ml，用红细胞 裂解液分离白细胞，采用 Trizol 一步法抽提总 RNA，用分 光光度计在 260nm 和 280nm 分别测定吸光度，A260/A280 比 值在为较纯的 RNA，可用于芯片检测。 芯片杂交 经检测合格后的总 RNA 可用于合成双链 DNA 进行纯化。然后进行化学发光检测的 AmpoLabelingLPR 标记，变性的 cDNA 探针全部加入预热的 GEAprehyb 中，混 匀，放在 60C 待用。弃去杂交管中的 GEAprehyb 溶液， 加入含探针的 GEAhyb 混合液至杂交管中，60C 下 6rpm 杂 交。 化学发光检测 洗膜后加入链亲和素偶联的碱性磷酸 酶（AP） ，再洗膜 4 次，加入 CDPStar 化学发光底物至杂 交管中，室温孵育 2min。用滤纸去除多余的 CDPStar 溶 液，用 X 射线胶片曝光。 图像采集和数据分析 运行 ScanAlyze 软件，将灰度 TIFF 格式图片的点阵转化为数字型数据，使用芯片配套软 件 GEArrayAnalyzer 对原始数据进行去背景计算以及比较 运算。 逆转录聚合酶链反应（RTPCR）方法验证部分差 异表达基因。 引物设计 将 RNA 反转录合成 CDNA，用 Primer5 软件 设计，由上海生物工程技术有限公司合成。 扩增引物 PrimerbpIRS2FOXC2actin 上游 5TTGAGGCGGCTAAGTCT3下游 5TCCCAGgATgCTgTTgC3上游 5CCTTCTACCgCGAGAACAAG3下游 5CCGgGTCGAgCGTCCAGTAG3上游 5ATGCCATCCTGCgTCTG3下游 5ACTCCTgCTTGCTGATCC3393520566 扩增反应条件： FOXC2 945min；9430s；50s；721min； 72 5min；共 30 个循环 IRS2 945min；9430s； 50s；72 1min； 725min；共 30 个循环 actin 945min；9430s； 50s；72 1min； 725min；共 30 个循环 扩增产物取 10l 的 actin 和 10l 目的基因在% 琼脂糖上电泳，紫外灯下观察结果并照相，吸光度扫描仪 扫描后 PCR 条带用软件进行定量分析，结果为基因表达量 对 actin 内参的比值，以上结果重复 3 次，取平均值。 Westernblotting 检测 IRS2 蛋白的表达 抽提蛋 白、制备 PAGE 胶、膜在 5%BSA 溶液中室温孵育 1 小时以封 闭膜上的非特异结合。加入 HRP 标记的二级抗体以结合一 级抗体及 HRP 标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室 温孵育膜 1 小时。KCTM 化学发光试剂盒中两种试剂等比例 混合为反应液，将膜置于反应液中室温孵育 5min。去除过 量的溶液，将膜夹在两塑料薄膜之间，以 X 光胶片曝光。 图片扫描保存为电脑文件，