atp-tca法检测乳腺癌细胞对化疗药物敏感性的研究(1)

ATP-TCAATP-TCA 法检测乳腺癌细胞对化疗药物法检测乳腺癌细胞对化疗药物 敏感性的研究敏感性的研究(1)(1) 作者;唐永梅，苏承武，蔡捷，唐东，李佳荃，李梅， 田海梅，张伟 摘要目的探讨体外 ATP 法化疗药物敏感试验在乳 腺癌细胞中的可行性。方法以 ATP-TCA 法，检测 37 例乳腺 癌患者的癌细胞对 6 种常用化疗药物的敏感性。结果 ATP- TCA 法的可评估率为%；6 种试验用化疗药物的敏感率分别 为：足叶乙甙%，紫杉醇%，丝裂霉素%，5-氟尿嘧啶%，草 酸铂%，表阿霉素%。结论 ATP-TCA 肿瘤细胞化疗药敏试验 可作为乳腺癌患者个体化疗中化疗药物敏感性的预测。 关键词ATP-TCA 法；乳腺癌；化疗药物 ApplicationofATPbioluminescenceassayforscreeningc hemotherapeuticagentsofbreasttumor Abstract ObjectiveTostudytheapplicationoftheexvivoATPbiolu minescenceassayinthechemotherapyofbreasttumor.Metho dsThesurgicalspecimensof37patientsweretestedbytheAT P- TCA.ResultsEvaluabletestresultswereachievedin34of37 patients，theevaluabilityratewas%.Thesensitiverates ofetoposid，paclitaxel，mitomycin，5- fluoruracil，oxaliplati，epirubicinwas%，%，%，%，% ，%，respectively.ConclusionATPbioluminescenceass ayisagoodoptioninthechemotherapeuticagentsscreening ofbreasttumors. Keywords ATPbioluminescence；breasttumor；chemotherapydrug 选择针对个体有效的药物进行化疗是治疗乳腺癌的重要手 段之一。由于同一化疗方案对不同个体的类同肿瘤的疗效 存在差异，化疗前对药物进行体外敏感试验，预测出有效 的单药或有效（或敏感）联合药物组成的化疗方案，是提 高化疗药物疗效的潜在方法之一。ATP-TCA 法（三磷酸腺苷 -肿瘤细胞药敏试验）是近年发展起来的敏感而稳定的药敏 检测方法1 。本文应用 ATP-TCA 法对 37 例乳腺癌患者的 乳腺癌细胞进行 6 种化疗药物的药敏试验，以探讨 ATP-TCA 法用于乳腺癌患者体外化疗药物检测在方法学方面的可靠 性。 1 材料与方法 一般资料收集 XX 年 3 月XX 年 5 月在本院手术治疗的乳腺 癌（经病理确诊）患者 37 例标 本。37 例患者最小年龄 25 岁，最大年龄 65 岁。 材料 ATP-TCA 试剂盒（包括改良 PRMI-1640 培养基）由北 京金紫晶生物技术有限公司提供。MPL-1 型自发光分析仪为 德国 Berthold 公司产品。化疗药物：5-氟尿嘧啶（5-FU， 南通制药总厂） ，表阿霉素（EPI，浙江海政制药） ，足叶乙 甙（VP-16，江苏恒瑞） ，紫杉醇（TXL，澳大利亚 FH 科贸 有限公司） ，丝裂霉素（MMC，日本明治药厂） ，草酸铂 （OXA，法国 SanofiWinthrop 公司） 。 方法 ATP-TCA 操作步骤（按试剂盒使用说明操作）：取肿 瘤组织标本，在无菌条件下，剥离肿瘤组织的纤维、脂肪 及结缔组织，然后用剪刀将肿瘤组织尽可能剪成小碎块， 过 200 目钢网后放入肿瘤组织解离酶液中，置 37、 5%CO2、95%湿度下孵育3h。在室温下，以 1500r/mim 条 件下离心 20min，弃上清液，用 Hanks 洗 2 次，以 PRMI- 1640 制成癌细胞悬液，取 35l 用台盼蓝染色，显微镜下 计数，并观察细胞活性。调整细胞浓度至 2040 万/ml， 以每孔接种至 96 孔培养板内。按 400%、200%、100%、50%、25%和%的血浆峰值浓度，将药物 加入培养孔每孔，每个浓度 3 个平行孔，并设最大抑制 （MI）和无药物（MO）对照孔，于 5%CO2、37、95%湿度 下孵育 67 天。加入肿瘤细胞 ATP 提取液，混匀后室温下 15min，取混合液置微板荧光分析仪检测。 ATP-TCA 结果评估 应用 ATP-TCA 的条件检测的标本必须经细胞学和病理学证 实为恶性肿瘤，且混悬液中肿瘤细胞数20%。培养板 MO 对 照行必须可观察。药物活性的剂量反应曲线须可观察。平 行孔间 CV 值 ATP-TCA 药物敏感和耐药的解读药物敏感定义： 高 AUC（抑制曲线下面积）值，低 IC90（抑制 90%癌细胞生 长时的药物浓度） 、IC50（抑制半数癌细胞生长时的药物浓 度）和 SI（敏感指数）值，和高 TGI（癌细胞生长抑制） 值（表示癌细胞生存 100%抑制） 。药物耐受定义：低 AUC 值， 高 IC90、IC50 和 SI 值和低 TGI 值（特别是在高测试浓度 和弱剂量反应时） 。敏感度分级，定义为：强敏感： IC90100%TDC（测试肿瘤药物浓度）和 IC5025%TDC。部 分敏感：IC90100%TDC 和 IC5025%TDC。弱敏感： IC90100%TDC 和 IC5025%TDC。耐药：IC90100%TDC 和 IC5025%TDC。 2 结果 在收集的 37 例患者中，34 例具有评估性，总可评估率为% ，乳腺癌 ATP-TCA 试验药物剂量效应曲线图（见图 1） 。 图 1 乳腺癌 ATP-TCA 剂量效应曲线图 ATP-TCA 试验结果显示不同个体的乳腺癌细胞对 6 种化 疗药物具有不同的敏感性。在所测试的化疗药物中，它们 的敏感率排序如下：表阿霉素（EPI）%，草酸铂（OXA）% ，5-氟尿嘧啶（5-FU）%，丝裂霉素（MMC）%，紫杉醇 （TXL）%，足叶乙甙（VP-16）%。其中表阿霉素的敏感率 最高，足叶乙甙的敏感率最低（见表 1） 。 表 16 种化疗药物敏感试验结果 注：四格表确切概率法，EPI、OXA 高于 VP-16（PP 3 讨论 在本研究中，应用对乳腺癌有较高评估率的 ATP-TCA 法 2 ，对 37 例乳腺癌患者的癌细胞进行体外化疗药物敏感 性检测方法学的再研究。ATP 是活细胞的基本能量单位，当 细胞的代谢受损时，ATP 合成水平下降，其与活细胞数量呈 正相关，故通过测定 ATP 水平可反映生物体的增殖活性。 ATP 体外药敏试验的原理是细胞内 ATP 与荧光素-荧光素酶 复合物作用产生可测定荧光（波长 562nm） ，检测荧光值计 算出 ATP 量可反映活细胞数。Sevin 等研究认为乳腺癌手术 后组织的可评估率为 97%，敏感性为 90%，特异性为 86%， 其临床符合率为 70%80%2 。本组实验结果较之为低， 这可能与我们的操作不够熟练、培养过程真菌污染及试验 用药有关。乳腺癌被认为是一种全身性疾病，对化疗中度 敏感，Rein 等3用 ATP-TCA 法测试晚期乳腺癌体外对蒽 环类抗生素、肽素类和铂类的敏感性，同时用免疫组化法 检测 P53、bcl-2 的表达，发现体外反应率最高为%，提示 化疗反应和凋亡无关及 P53、bcl-2 的表达与体外药敏结果 无关。我们应用北京金紫晶生物技术有限公司提供的 ATP- TCA 试剂盒，体会到 ATP-TCA 法有如下优点：（1）成功率 及重复性高，达 97%；（2）细胞用量少（） 1011/L；（3）采用荧光检测范围较大，且可定量； （4）药物浓度呈线性范围，有 6 个细胞级数，判断趋势明 显；（5）干扰因素少；（6）改良的 RMPI-164