5个现代月季品种愈伤组织再生体系的建立与体细胞培养的研究硕士学位论文.pdf

d i s s e r t a t i o nf o rm a s t e rd e g r e ei na g r i c u l t u r e st u d yo nc a l l u sr e g e n e r a t i o n a n dc e l lsc u l t u r eo f5m o d e r n c a n d i d a t e ： r o s e sc u l t i v - a r s p a n b i n g b i n g s u p e r v i s o r ：p r o f c h e d a i d i a c a d e m i cd e g r e ea p p l i e df o r ：m a s t e ro f a g r i c u l t u r e s p e c i a l i t y ： o r n a m e n t a lh o r t i c u l t u r ea n dl a n d s c 印e a r c h i t e c t u r e d a t eo f0 r a le x a m i n a t i o n ：j u n e 2 01l u n i v e r s i t y ： n o r t h e a s t a g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t y 一 目录 中文摘要i 英文摘要i i i l 弓i 言1 1 1 研究的目的与意义1 1 2 研究进展2 1 2 1 植物组织培养技术概述2 1 2 2 月季组织培养研究进展。2 1 2 3 植物体细胞培养研究进展工6 1 2 4 存在的问题1 1 1 3 研究内容与技术路线12 2 材料与方法1 4 2 1 材料1 4 2 1 1 植物材料。1 4 2 1 2 主要试验仪器1 4 2 1 3 培养基和培养条件1 4 2 2 方法1 5 2 2 1 现代月季快速繁殖体系的建立1 5 2 2 2 愈伤组织的诱导1 6 2 2 3 愈伤组织分化培养17 2 2 4 细胞悬浮系的建立1 7 2 2 5 细胞悬浮系的再生18 3 结果与分析2 0 3 1 月季快速繁殖体系的建立2 0 3 1 1 丛生芽诱导结果2 0 3 1 2 组培苗生根诱导与移栽2 1 3 2 现代月季愈伤组织的诱导2 2 3 2 1 叶片愈伤组织的诱导2 2 3 2 2 幼茎愈伤组织的诱导：2 6 3 2 3 愈伤组织的显微观察2 9 3 3 现代月季愈伤组织的分化3 0 3 3 1 胚性愈伤组织的形成过程3 3 3 3 2 基因型和外植体对愈伤组织分化的影响3 4 3 3 3 培养基及激素对愈伤组织分化的影响3 4 3 3 4 光照条件对愈伤组织分化的影响3 5 3 3 5 愈伤组织状态对愈伤组织分化的影响j 3 6 东北农业大学农学硕七学位论文 3 3 6 继代次数对愈伤组织分化的影响3 7 3 4 细胞悬浮系的建立3 8 3 4 1 细胞悬浮系的启动3 8 3 4 2 细胞悬浮培养过程中p h 值的变化规律3 9 3 4 3 细胞悬浮系的生长特性3 9 3 5 细胞悬浮系的再生培养4 1 3 5 1 悬浮细胞愈伤组织的诱导4 l 3 5 2 悬浮细胞愈伤组织的分化培养4 3 z l 讨论4 7 4 1 影响月季愈伤组织诱导和分化的因素4 7 4 1 1 外植体与基因型4 7 4 1 2 培养基和培养条件4 8 4 2 愈伤组织的分化途径4 8 4 2 1 器官发生途径4 8 4 2 2 体细胞胚胎发生途径4 9 4 2 3 类原球茎发生途径4 9 4 3 现代月季体细胞培养的影响因素4 9 4 3 1 悬浮培养起始物的选择4 9 4 3 2 细胞培养与p h 的关系5 0 4 3 3 振荡培养转速的影响5 0 4 4 褐化现象的控制5 0 5 结论5 2 致谢5 4 参考文献5 5 附录6 1 攻读学位期间发表的学术论文6 3 c o n t e n t s 曼曼曼曼鼍鼍i _ , i 曼罡! 曼! 曼曼皇曼曼蔓 c o n t e n t s c h i n e s ea b s t r a c t i e n g l i s ha b s t r a c t i i i 1i n t r o d u c t i o n 1 1 1p u r p o s ea n ds i g n i f i c a n c eo f t h er e s e a r c h j 一1 1 2p r o g r e s so fr e s e a r c h 2 1 2 1p r o g r e s so f t i s s u ec u l t u r eo f p l a n t s 2 1 2 2p r o g r e s so f t i s s u ec u l t u r eo f r o s e 2 1 2 3p r o g r e s so fs o m a t i ce e l sc u l t u r eo fp l a n t s 6 1 2 4p r o b l e m s 11 1 3t h et e c h n i q u er o u t ea n dr e s e a r c hc o n t e n t s 1 2 2m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 14 2 1m a t e r i a l s 14 2 1 1p l a n t sm a t e r i a l s 1 4 2 1 2p l a n t sm a t e r i a l s 1 4 2 1 3m e d i u ma n dc u l t u r ec o n d i t i o n 1 4 2 2m e t h o d s 1 5 2 2 1e s t a b l i s h m e n to f m i c r o p r o p a g a t i o no f m o d e mr o s e s 1 5 2 2 2c a l l u si n d u c e m e n t 1 6 2 2 3t h ec u l t u r eo fc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o n 1 7 2 2 4e s t a b l i s h m e n to f c e l ls u s p e n s i o n 1 7 2 2 5c e l ls u s p e n s i o nr e g e n e r a t i o n 18 3r e s u l t sa n da n a l y s i s 。2 0 3 1e s t a b l i s h m e n to f m i c r o p r o p a g a t i o no f m o d e mr o s e s 2 0 3 1 1t h er e s u l t so fm u l t i p l es h o o ti n d u c t i o n 2 0 3 1 2r o o t i n gi n d u c t i o na n dt r a n s p l a n t i n go f a s e p t i cs e e d l i n g 2 1 3 2c a l l u si n d u c e m e n to fm o d e mr o s e s 2 2 3 2 1c a l l u si n d u c e m e n to fl e a v e s 2 2 3 2 2c a l l u si n d u c e m e n to f y o u n gs t e m s 2 6 3 2 3t h em i c r o s c o p i co b s e r v a t i o no f c a l l u s 。2 9 3 3c a l l u sd i f f e r e n t i a t i o no fm o d e mr o s e s 3 0 3 3 1t h ef o r m a t i o np r o c e s so f e m b r y o g e n i cc a l l u s ”3 3 3 3 2t h ee f f e c to f g e n o t y p ea n de x p l a n t so nc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o n 一3 4 3 3 3t h ee f f e c to fh o r m o n ea n dm e d i u mo nc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o n 。3 4 3 3 4t h ee f f e c to fl i g h tc o n d i t i o n so nc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o n 3 5 3 3 5t h ee f f e c to f c a l l u sc h a r a c t e r i s t i c so nc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o n 一3 6 1 1 1 3 3 6t h ee f f e c to f s u b c u l t u r et i m e so nc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o n 3 7 3 4e s t a b l i s h m e n to f c e l ls u s p e n s i o n 一3 8 3 4 1t h ei n i t i a lc u l t u r eo f c e l ls u s p e n s i o n 3 8 3 4 2t h ev a r i a t i o no f p hv a l u e si nt h ep r o c e s so f c e l ls u s p e n s i o nc u l t u r e 3 9 3 4 3t h eg r o w t hc h a r a c t e r i s t i c so fc e l ls u s p e n s i o nc u l t u r e 3 9 3 5c e l ls u s p e n s i o nr e g e n e r a t i o n 4 1 3 5 1t h ec a l l u si n d u c t i o no f s u s p e n s i o nc e l l s 4 1 3 5 2t h ec a l l u sd i f f e r e n t i a t i o no f s u s p e n s i o nc e l l s 4 3 4d i s c u s s i o n 4 7 4 1f a c t o r si nc a l l u si n d u c t i o na n d d i f f e r e n t i a t i o no i l m o d e mr o s e s 4 7 4 1 ig e n o t y p ea n de x p l a n t s 4 7 4 1 2m e d i u ma n dc u l t u r ec o n d i t i o n 4 8 4 2t h ew a y so fc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o n 4 8 4 2 1o r g a n o g e n e s i sw a y s ”4 8 4 2 2s o m a t i ce m b r y o g e n e s i sw a y s 4 9 4 2 3p r o t o c o r mw a y s 4 9 4 3f a c t o r si ns o m a t i cc e l lc u l t u r eo i lm o d e mr o s e s 4 9 4 3 1t h ei n i t i a t o rs e l e c t i o no f c e l ls u s p e n s i o n j 4 9 4 3 2t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nc e l lc u l t u r ea n dp h 。5 0 4 3 3t h ee f f e c to fo s c i l l a t i n gs p e e d s 5 0 4 4t h ec o n t r o lo fb r o w n i n gp h e n o m e n o n “5 0 5c o n c l u s i o n s 5 2 a c k n o w l e d g e m e n t s 5 4 r e f e r e n c e s 。：5 5 a p p e n d i x ”o l a r t i c l e sp u b l i s h e dd u r i n gs p e c i a l i z i n gt h ed e g r e eo fm a s t e r 6 3 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：海参善 日期：如j1 年多月争日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名：谘岳葛日期：驯年6 月尸日 导师签名： 日期：洲彤月户 摘要 摘要 现代月季是世界上最重要的观赏植物之一，其四季常开、香味浓郁、花色丰富，一直 为众人所青睐，具有广泛的应用价值，是现代城市绿化中不可替代的材料。我国北方由于 气候原冈，缺乏可以广泛栽培并能露地越冬的现代月季品种。 当前在月季育种中存在的突出问题是现代月季遗传背景狭窄，传统育种方法周期过长， 而且染色体数目及倍性差异造成远缘杂交不亲和与杂种的高度不育。生物工程则为生物品 种的改造开辟了新途径。愈伤组织和体细胞是无性系变异和遗传转化的良好的受体材料， 通过愈伤组织再生和体细胞培养可以获得无性系变异植株，而且体细胞融合为解决远缘杂 交不育提供了一个很有潜力的新途径。但是现代月季再生途径的建立还存在很大的困难， 而且体细胞培养难度很大，体细胞培养获得再生植株的报道还很有限，因此本研究对促进 月季的抗寒育种及其他性状的改良都具有重要的意义。 本研究通过探究影响现代月季快速繁殖和愈伤组织诱导再生的因素，并利用获得的愈 伤组织建立细胞悬浮系，探讨了影响现代月季体细胞培养的各种因子，旨在建立起现代月 季高效的快速繁殖体系、愈伤组织再生和体细胞培养技术体系，为以后导入抗寒等目的基 因、体细胞无性系变异的筛选及原生质体培养和融合等遗传操作打下良好的基础。本研究 的主要结果如下： 1 建立了5 个现代月季品种快速繁殖体系：l 号月季品种不定芽萌发和增殖的最佳培 养基为：m s + 6 b a 2 5 m g l + n a a 0 0 5 m g l ，增殖率能达到4 2 ；2 号、6 号和8 号月季品 种最佳培养基为：m s + 6 b a 2 0 m g l 一+ n a a 0 0 5 m g l 一，增殖率分别能达到3 6 8 、4 0 7 和 4 2 ；9 号月季品种最佳培养基为：m s + 6 b a 2 0 m g l 一+ n a a 0 1 m g l - 1 ，增殖率可达到3 9 9 ； 5 个月季品种无菌苗的最适生根培养基为：i 2 m s + n a a 0 0 5m g l q 和1 2 m s + n a a 0 1 m g l ，生根率都可达8 0 以上：各品种无菌苗通过驯化炼苗，露地栽植成活率都可达 8 8 以上。 2 筛选出5 个现代月季品种愈伤组织诱导最佳培养基。l 号、8 号月季品种叶片诱导 愈伤组织的最佳培养基为m s + 2 ，4 d 3 0m g l 。诱导率均可达到1 0 0 o o ；2 号、6 号、9 号月季品种叶片诱导愈伤组织的最佳培养基为m s + 2 ，4 d 2 0m g l - i + 6 b a 0 5m g l ，诱导 率分别可达到9 7 6 7 、9 8 6 7 、1 0 0 0 0 。l 号、6 号月季品种幼茎诱导愈伤组织的最佳培 养基为m s + 2 ，4 d 3 0m g l 1 ，诱导率分别可达到7 8 6 7 ，8 4 3 3 ；2 号月季品种幼茎诱导 愈伤组织的最佳培养基为m s + 2 ，4 d 2 0m g l 1 ，诱导率可达到7 3 6 7 ：8 号、9 号月季品种 幼茎诱导愈伤组织的最佳培养基为m s + 2 ，4 d 2 0 m g l d + 6 b a 0 5 m g l ，诱导率分别为 8 2 3 3 、8 0 3 3 。 3 筛选出4 个现代月季品种愈伤组织分化最佳培养基。1 号品种叶片愈伤组织分化的 最佳培养基为m s + 2 ，4 d o 2m g l + t d z 9 0m g l 一+ g a 3 0 1m g l i ，分化途径为不定芽发生 途径，分化率可达1 8 0 0 ；6 号品种叶片愈伤组织分化的培养基为m s + 6 b a 0 1m g l 吐 + 2 ，4 d 1 0m g l 一+ t d z 8 0m g l 一+ g a 3 0 1m g l ，分化途径为不定芽发生途径，分化率可达 2 2 0 0 ；适合8 号品种叶片愈伤组织分化的培养基为1 2 m s + 6 b a 0 5m g l i + t d z l 0 0 东北农业火学农学硕l = 学位论文 m g l + g a 3 0 1m g l 一、m s + 2 ，4 d o 2m g l 1 + t d z 9 0m g l 一+ g a 3 0 1m g l - i ，前者愈伤组织 分化途径为胚状体途径，胚状体通过继代培养可形成再生植株，后者分化途径为不定芽途 径，分化率分别为1 8 6 7 、2 1 3 3 ，幼茎愈伤组织分化的最佳培养基为m s + t d z 8 0m g l 一， 分化途径为不定芽发生途径，分化率可达4 6 6 7 ：9 号品种叶片愈伤组织分化的最佳培养 基为m s + 6 b a 0 1m g l 一+ t d z 9 0m g l + g a 3 0 5m g l 一，分化途径为不定芽途径，分化率 达到1 6 6 7 ，幼茎愈伤组织分化的培养基为m s + 2 ，4 d o 2m g - l + t d z 9 0m g l 一+ g a 3 0 1 m g l 一，分化途径为胚状体途径，分化率可达3 5 3 3 。 4 以5 个月季品种的愈伤组织诱导培养基成分相同的液体培养基可建立起稳定的悬 浮细胞系，悬浮系最佳的继代时间间隔为8 1 0 d ，悬浮系培养后4 8 天内的细胞生长旺盛， 活性强，适宜用来进行细胞系的再生培养；不同基因型间月季悬浮系生长特性差异不显著。 5 以l 号、8 号和9 号三个品种的悬浮细胞可诱导出愈伤组织。l 号品种悬浮细胞在 固体培养基m s + 6 b a 0 1m g l 1 + 2 ，4 d i 0m g l + k t 0 1m g l - l ，愈伤组织诱导率为2 2 0 0 ； 8 号品种悬浮细胞在同体培养基m s + 2 。4 d 1 0m g l 以+ n a a l 0m g l + k t 0 5m g l 。1 愈伤组 织诱导率为2 7 3 3 ；9 号品种悬浮细胞在固体培养基m s + 2 ，4 d 1 0m g l + n a a l 0m g l 1 + k t 0 5m g l _ 愈伤组织诱导率为2 6 6 7 ，悬浮细胞在液体培养基m s + 6 b a 0 5m g l _ + 2 ，4 - d 1 0m g l 一+ n a a 0 2m g l 。愈伤组织诱导率仅为2 6 7 。 6 1 号品种悬浮细胞愈伤组织在培养基m s + 2 ，4 d o 2m g l 一+ t d z 9 0m g l 一+ g a 3 0 1 m g l q 上可直接分化出不定芽，分化率可达3 2 3 3 ；8 号晶种悬浮细胞愈伤组织在培养基 m s + 2 ，4 d o 2m g l + t d z 9 0m g l 一+ g a 3 0 1m g l i 上可分化出胚状体，分化率可达 2 6 6 7 ；9 号品种悬浮细胞愈伤组织在培养基m s + 6 - b a 0 1m g l - i + t d z9 0 m g l 1 + g a 3 o 5 m g l i 上可分化出胚状体，分化率为3 8 6 7 。 关键词月季；愈伤组织；体细胞培养：再生 i i m o d e r nr o s e sc u l t i v a r s a b s t r a c t m o d e mr o s e ( r o s ah y b r i d al ) i so n ek i n do ft h em o s ti m p o r t a n to r n a m e n t a lp l a n t s ，w h i c hi s p o p u l a rb e c a u s eo ft h ec o l o r f u l ，f r a g r a n t , c o n c u r r e n tf l o w e r sw i t haw i d er a n g eo fa p p l i c a t i o n t h e ya r ei r r e p l a c e a b l em a t e r i a l sf o rl a n d s c a p i n gi nm o d e mc i t i e s d u et oc l i m a t er e a s o n si nt h e n o r t ho f c h i n a , t h e r ea l ef e wc u l t i v a r so f r o s e sc a r ll i v et h r o u g ht h ew i n t e r m o d e mr o s e sh a v ean a r r o wg e n e t i cb a s e ，a n dt r a d i t i o n a lb r e e d i n gm e t h o d sn e e dt ot a k ea l o n gt e r m ，w h i c hd e l a y st h ed e v e l o p m e n to fr o s eb r e e d i n ga tp r e s e n t b i o e n g i n e e r i n go f f e r sa n e w a p p r o a c hf o rb r e e d i n gw o r k c a l l u sa n ds o m a t i cc e l la r eg o o dr e c e p t o rm a t e r i a l sf o rc l o n ev a r i a t i o n a n dg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n ，t h r o u g ht h ec a l l u st i s s u er e g e n e r a t i o na n ds o m a t i ct r a i n i n gc a no b t a i n v a r i a b l ep l a n t s ，a n ds o m a t i cf u s i o np r o v i d e sap o t e n t i a ln e ww a y st os o l v ed i s t a n th y b r i d i z a t i o n i n f e r t i l i t y b u tt h ee s t a b l i s h m e n to fm o d e mr o s ec a l l u sr e g e n e r a t i v ea n ds o m a t i cc e l l sc u l t u r es t i l l e x i s t sg r e a td i f f i c u l t y ，t h er e l e v a n tr e p o r t sa r es t i l lf e w t h e r e f o r e ，t h i ss t u d yh a sv i t a ls i g n i f i c a n c e t op r o m o t et h ec o l d t o l e r a n c ea n do t h e rt r a i t sb r e e d i n g t h i ss t u d yd i s c u s s e dt h ef a c t o r st h a ta f f e c t e dc a l l u si n d u c e m e n ta n dr e g e n e r a t i o no fm o d e r n r o s e ，a n da c q u i r e de m b r y o g e n i cc a l l u s ，a n de s t a b l i s h e dc e l ls u s p e n s i o nb a s e do nt h ea c q u i r e dc a l l u s ， t h ef a t o r st h a ta f f e c t e ds o m a t i cc e l l sc u l t u r ea l s ow e r ed i s c u s s e d t h es t u d yi sa i m e dt oa c q u i r e r e g e n e r a t e dp l a n t sf r o mc a l l u sa n ds o m a t i cc e ll s ，a n dp r o v i d eb a s ef o rg e n e t i cm a n i p u l a t i o ns u c ha s c o l d - r e s i s t a n ts p e c i e si m p r o v e m e n t ，s o m a t i cc e l lc l o n e sv a r i a b l es e l e c t i o na n dp r o t o p l a s tc u l t i v a t i o n a n df u s i o n t h em a i nr e s u l t so f t h i ss t u d ya r ea sf o l l o w s ： 1 e s t a b l i s h m e n to fm i c r o p r o p a g a t i o no ff i v em o d e mr o s e s ：t h eb e s tm e d i u mf o rt h e g e r m i n a t i o no fc u l t i v a r1a x i l l a r yb u da n ds h o o tm u l t i p l i c a t i o nw a s ：m s + 6 - b a 2 5 m g l 1 + n a a 0 0 5 m g l ”，t h er a t eo fp r o l i f e r a t i o nc a nr e a c h4 2 ；t h eb e s tm e d i u mf o rt h eg e r m i n a t i o no fc u l t i v a r s 2 ，6a n d8a x i l l a r yb u da n ds h o o tm u l t i p l i c a t i o nw a s ：m s + 6 - b a2 0 r a g l q + n a a0 0 5 m g l - 1 ，t h e r a t eo fp r o l i f e r a t i o nc a nr e s p e c t i v e l yr e a c h3 6 8 ，4 0 7 ，4 2 ；t h eb e s tm e d i u mf o rt h eg e r m i n a t i o no f c u l t i v a r9a x i l l a r yb u da n ds h o o tm u l t i p l i c a t i o nw a s ：m s + 6 b a 2 0 r a g l _ + n a a 0 1m g l 一，t h er a t e o fp r o l i f e r a t i o nc a nr e a c h3 9 9 ；t h eb e s tr o o t i n gm e d i u m sf o rf i v e c u l t i v a r sw e r e1 2 m s + n a a 0 0 5 m g l a n d1 2 m s + n a a 0 1m g l 1 ，r o o t i n gr a t ec a nb eu pt o8 0 ；t h es u r v i v a lr a t eo fs t e r i l e s e e d l i n g sc u l t i v a t e di nt h eo p e nc a nb eu pt o8 8 b yd o m e s t i c a t i o na n dt r a n s p l a n t i n g 2 t h el e a v e sa n dy o u n gs t e m so ff i v ec u l t i v a r s s t e r i l es e e d l i n g sh a v eag o o dc a l l u si n d u c t i o n a b i l i t y t h eb e s tm e d i u mf o rl e a v e sc a l l u si n d u c t i o no fc u l t 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