dxs6804基因座等位基因分型标准物的克隆制备及其群体遗传学研究(1)

DXS6804DXS6804 基因座等位基因分型标准物的基因座等位基因分型标准物的 克隆制备及其群体遗传学研究克隆制备及其群体遗传学研究(1)(1) 【摘要】 目的用分子克隆技术制备 DXS6804 基因 座等位基因分型标准物，并用于中国云南普米族人群的群 体遗传学研究，解决长期困扰短串联重复序列分型上存在 的准确性和标准化问题。方法用 PCR 扩增出 DXS6804 基因 座的各等位基因片段，PCR 产物克隆后，DNA 测序证实插入 片段的大小和结构，按国际标准进行命名后，经扩大培养、 扩增及再鉴定后，制备出该基因座的等位基因分型标准物， 进行群体研究。结果调查了中国云南地区普米族人群基因 座的基因型分布频率，发现 DXS6804 基因座两个分型标准 物外等位基因。结论分子克隆技术是制备等位基因分型标 准物的可靠方法，DXS6804 基因座是一个适合我国法医学和 群体遗传学分析的遗传标记。 【关键词】等位基因分型标准物；短串联重复序列； 遗传多态性 StudyontheconstructionofstandardDXS6804allelicladde rviamolecularcloninganditsgeneticpolymorphism inChineseyunnanpumipopulations ABSTRACT:ObjectiveToresolvetheproblemoftheaccuracya ndstandardizationofSTRPCRtypinginforensicpractice,c onstructDXS6804allelicladderbymolecularclonninganda pplytheminapopulationstudyonthePumipopulationinYunn an,China.MethodsPCRwasusedtoproduceseveraldifferent allelicfragmentsofthelocus.AftercloningthePCRproduc ts,therecombinantplasmidsweresequenced.Thenwedenomi natedthemandusedthemastemplateforreamplificationt ogeneratethelocusstandardladder.ResultsThesequencin gresultsconfirmedthatthesizeandtheconstructionofthe insertswerecorrect.Thegeneticpolymorphismsofthisloc usinYunnanPumipopulationofChinawerestudied.Twooff ladderallelesofDXS6804locuswerefound.ConclusionThis methodisofhighvalueforforensicDNAtypingtoconstructs tandardladders.DXS6804isrobustforgeneticresearchand forensicapplication. KEYWORDS:allelicladder;shorttandemrepeats;geneticpo lymorphism 短串联重复序列是一类在人类基因组中分布广泛并且 具有高度多态性的遗传标记。具有分型检测所需检材量少、 尤其适合降解 DNA 的扩增等优点，被广泛应用于法医学个 体识别和同一认定以及民事案件中的亲权鉴定12。特 别是 X 染色体 STR 基因座，具有扩增片段短、等位基因多、 分型方法简单、多态信息含量高的优点，更受到格外关注。 而且它特别适用于法医学实践中在母方缺如情况下兄弟姐 妹的亲权鉴定，另外，也可以作为性别的辅助鉴定，为法 医学研究提供了一种新的工具。但是，由于目前已知的 X 染色体多态性遗传标记的数量较少，适用于法医学的更少， 而且其研究方法还处于摸索阶段3。 等位基因分型标准物是人群中常见的等位基因混合物， 用来与未知样品比对确定基因型。只有具备了一套精确的、 国际标准化命名的标准参照物，才有可能对 STR 分型结果 作出正确的判型和命名,STR 数据才能在各实验室之间进行 交流和合作4。为此，我们应用分子克隆技术，在国内外 首先制备出 DXS6804 基因座的等位基因分型标准物。应用 自制的等位基因分型标准物，首次调查了中国云南地区普 米族人群基因型分布频率，评价该基因座在法医学和群体 遗传学中的应用价值。 1 对象与方法 对象 样本遵循知情同意原则，随机抽取中国云南地区 100 名普米族群体中无亲缘关系个体的静脉血，EDTA 抗凝，- 70保存。 引物引物序列查自 GenBank，由奥科公司合成。 试剂 2XTaqpolymerasemix 和 DH5 感受态细胞；质粒 纯化试剂盒；pGEMTEasyVectorSystem；聚丙烯酰胺 凝胶 DNA 回收试剂盒；EDTA 等其余试剂均为国产分析纯。 仪器台式高速离心机；微量可调加样器；三相恒压电 泳仪；干热器；旋涡混匀器；超净工作台；低温冰箱； ABI3730 自动测序仪。 方法 制备标准分型物模板 DNA 通过 Chelex100 法5提取 云南普米族群体样本 DNA，PCR 扩增。反应体系：总体积 13L，2Taqpolymerasemix6L，引物 1L，DNA2L，H2O2L。反应条件见表 1。 用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 PCR 扩增产物，银染 显色67。从群体样本的扩增产物中，选出了 9 个不同 大小片段长度的等位基因，用聚丙烯酰胺凝胶 DNA 回收试 剂盒纯化各个片断，制备成 PCR 再扩增的模板。 PCR 再扩增、产物鉴定及纯化将制备好的 9 份 DNA 进行 扩增，反应体系及条件如前。扩增产物进行电泳、银染后 再确定其片段大小，并进行纯化。 PCR 产物的克隆采用 pGEMTEasyVectorSystem克 隆试剂盒，将纯化后的 PCR 片段直接插入质粒的多克隆位 点。重组后的质粒转化 DH5 感受态细胞，选择培养，再 用以上的扩增方法筛选出含有正确插入片段的克隆。 重组质粒的 DNA 测序采用 ABI3730 全自动遗传分析仪， 以质粒公用的 M13 正向引物对重组质粒的插入片段进行测 序，确定插入片段的大小及组成，以国际法庭血液遗传学 学会推荐的命名原则进行各等位基因命名89。 重组质粒的扩大培养及保存对经测序证实的含有正确 等位基因插入片段的质粒扩大培养。提取质粒后,得到该基 因座的等位基因分型标准参照物的重组质粒。菌液加甘油 后，-70保存。 等位基因分型标准物的制备和再鉴定以含该基因座等 位基因插入片段的重组质