hla新等位基因a-3018的序列分析和确认(1)

HLAHLA 新等位基因新等位基因 A*3018A*3018 的序列分析和确的序列分析和确 认认(1)(1) 作者：李桢，邹红岩，邵超鹏，孙革，金士正，程良 红 【摘要】为了识别和确认中国汉族人群中的 HLA 新等 位基因，使用 PCRSSP、FLOWSSO 以及 PCRSBT 等 HLA 分型技术，发现样本 A 位点的杂合结果 A*240201，300101 在外显子 2 有 3 个位置与数据库不相符。用组特异性引物 分别扩增 A*24 及 A*30 基因，对外显子 2、3、4 进行双向 测序，发现 1 个与 A*300101 序列相近的新等位基因。分析 该等位基因与 A*300101 序列的差异。用 EB 病毒感染外周 血 B 淋巴细胞，建立该等位基因的无限增殖化 B 淋巴细胞 系。结果表明：该基因与 A*300101 相比在外显子 2 有 3 个 碱基的改变，碱基 121AC、123TC 导致密码子 17AGTCGC,17S（丝氨酸）R（精氨酸） ；碱基 126AG 导致密码子 18GGAGGG，18G（甘氨酸）G（甘氨酸） ，该 氨基酸是同义突变。成功建立了该等位基因的无限增殖化 B 淋巴细胞系，该基因序列已提交 GenBank，编号为 DQ872509。结论：该等位基因为新的 HLAA 等位基因，已 于 XX 年 8 月被世界卫生组织 HLA 因子命名委员会正式命名 为 HLAA*3018（上报编号 HWS10004039） 。 【关键词】人类白细胞抗原 IdentificationandSequenceAnalysisofANovelHLAA*301 8Allele AbstractToidentifyHLAnovelalleleinChineseHanindivid uals,anunknownHLAAallelewasdetectedbyPCRSSPandF LOWSSOinChineseHanindividuals.Heterozygoussequenc ebasedtypingshowedthattherewere3differencescompar edwithdatabaseinexon2.Itsanomalouspatternssuggested thepossiblepresenceofeitheranovelA*30 or anovelA*24.T oseparatethetwoallelesandtodeterminewhethertheallel eisnovel,theHLAA*30andHLAA*24alleleswereamplifi edseparatelybyusingacommercialkitforthesingleallele specificsequencingstrategy,andbothallelesforexons 24weresequencedaccordingtothemanufacturerprotoco l.ToprepareBlymphoblastoidcelllineofthenovelHLAal lelebyusingEpsteinBarrvirusinfectedBlymphobla stoidcellsintheperipheralblood.Theresultsindicatedt hatthesequencingresultsshowedHLAAallelesofthesamp letobeHLAA*240201andanewA*30allele.Thesequencesof thenewA*30wereidenticaltothoseofHLAA*300101except forthreenucleotidechangesinexon2:atnt121,nt123andnt 126,resultinginanaminoacidresiduesubstitutionfromSt oRatcodon17andasynonymoussubstitutionfromGtoGatcodo n18.ImmortalizedBlymphoblastoidcelllineofthenovel HLAA*3018allelewasachieved,thesequenceofHLAA*30 18allelewassubmittedtoGenBankanditsaccessionnumberw asDQ872509.Inconclosion,theHLAA*3018isanovelHLA AalleleandhasbeenofficiallynamedHLAA*3018bytheWHO NomenclaturecommitteeinAugustXX（HWS10004039）. KeywordsHLA;HLAAallele;HLAA*3018;sequenceanalys is 人类白细胞抗原（HLA）系统在遗传学、法医学和移植 免疫中起着非常重要的作用。近几年来，随着分子生物学 的发展及测序技术的推广，HLA 新等位基因不断被发现。截 止目前，人类白细胞抗原的 A 位点已有 450 个基因，A*30 组已发现 20 个等位基因1 。我们在常规工作中发现一份 标本，PCRSSP 分型结果 A 位点为 A*24，FLOWSSO 分型结果为 A*24，30，即两种试剂出现了不同的分型结果。 杂合测序显示 HLAA*240201，300101 的杂合结果在外显 子 2 有 3 个碱基与数据库（IMGT/HLArelease,AprilXX）不 相符。我们用组特异性引物分别扩增了 A*24 及 A*30 基因， 对其分别进行外显子 2、3、4 的双向测序，发现一个与 A*300101 序列相近的新等位基因，其血清学特异性有待进 一步确认。该基因被世界卫生组织 HLA 命名委员会正式命 名为 HLAA*3018。此样本的 HLA 分型结果为 A*3018/A*240201,B*1301/B* 材料和方法 样本来源 中华造血干细胞捐献者资料库志愿捐献者，男性，汉 族，籍贯河南。家系调查采集先证者父母的血样。随机抽 选本中心 500 名造血干细胞捐献者进行基因频率调查。 DNA 快速提取试剂盒由美国 Gentra 公司提供。HLA 低 分辨率基因分型试剂由美国 G&T 公司（试剂批号 LotRF08） 以及美国 OneLambda 公司（试剂批号 HLAALot007）提 供。高分辨率基因分型试剂中杂合测序试剂盒使用 AtriaGeneticsAlleleSEQRHLABSBTPack（AtriaGenetics,S outhSanFrancisco,CA） ；单基因扩增测序使用 ProtransS4HLAAsingleallelespecificsequencingset （ProtransGmbH,Ketsch,Germany） 。淋巴细胞分离液由上 海恒信试剂厂提供。RPMI1640 培养液为 Sigma 公司产品。 A*3018 序列特异性引物合成及 PCR 所需试剂由大连宝生物 公司提供。 主要仪器 9700PCR 扩增仪（PE 公司产品） ，电泳仪（美国 Embi 公司产品） ，流式磁珠分析仪（Luminex100 液相分析平台） ， 3100 测序仪（AppliedBiosystems 公司产品） ，CO2 培养箱 （德国 HeraeusBBD6220 型） 。 HLA 分型及序列分析 使用 5%EDTA 抗凝外周全血，取 300l 用 DNA 快速提 取试剂盒提取 DNA。HLA 低分辨率分型采用了 PCRSSP 以 及 FLOWSSO 两种方法。高分辨率分型先使用了 AtriaGeneticsAlleleSEQRHLABSBTPack 进行杂合测序， 分析软件使用 AssignversionXX0714 版本，最后使用 ProtransS4HLAAsingleallelespecificsequencingset 分别扩增 A*24 及 A*30 基因，并对外显子 2、3、4 进行双 向测序，从而确认突变基因。分析软件使用 Sequencepilot 版本。 HLAA*3018 等位基因的 PCRSSP 鉴定 设计序列特异性引物见表 1。采用双管 PCR 特异性扩增 A*3018 等位基因。该两对引物扩增结果均阳性即为 A*3018 等位基因。PCR 扩增反应体系为 25l，其中 10PCR 缓冲 液 l，MgCl2 终浓度 mmol/L，dNTP 终浓度 mmol/L，引物 终浓度