seldi技术分析体外培养不同肝细胞株差异蛋白的表达(1)

SELDISELDI 技术分析体外培养不同肝细胞株技术分析体外培养不同肝细胞株 差异蛋白的表达差异蛋白的表达(1)(1) 作者：丁守怡，钱冬萌，牟文凤，闫志勇，宋旭霞， 王斌 【关键词】表面增强激光解吸/离子化/飞行时间质谱； 蛋白质陈列分析；肝肿瘤；肿瘤细胞,培养的；差异蛋白 Analysisofdifferentproteinexpressionsindifferentliv ercellstrainsinvitrousingSELDI 【Abstract】AIM:Toexaminethedifferentialexpressions ofproteinsinhepatomacellline,hepatomacelllinetransf ectedbyHBV（） comparedwithnormallivercelllinebyusingsurfaceenhanc edlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectro metry,soastoestablishafoundationforfurtherstudyingo nthemechanismofhepatomaattheproteinlevel.METHODS:Th e3typesofcellsabovementionedwereculturedasgeneralan dcollectedwhentheywereingoodconditions.Aftercelldis ruption,SELDITOFMSwasemployedtodetectthedifferentia lexpressionsofproteomesofHepG2,HepGandLO2.RESULTS:N inetyoneproteinswerecapturedbyWCX2array.Comparedwit hnormallivercelllines,inthesegmentsfromMr5000to1500 0,proteinsintheHepG2andshowedapparentchanges,inwhic h2proteinsexpressionswereincreasedincarcinomacells, theother5decreased.NineproteinsinHepG2wereincreased and10proteinsinHepGwereincreased.CONCLUSION:TheSELD IProteinChiptechnologycanbeadesiredmethodindetectin gthebiologicalmarkersintheearlierperiodofhepatoma.T hismethodisofconvenience,highsensitivity,andgoodrep roducibility.Thebiologicaltagsoftissuespecificprote inswefoundhaveapotentialapplyingvalueintheearlydiag nosisofhepatoma.Thesetagsarealsomeaningfulinscreeni ngandidentifyingsignalproteinsfromserumandtissuespe cimenindifferenttypesofhepatoma.Certainfoundationha sbeenestablishedinstudyingtheetiopathogenesisofhepa tomaatthelevelofproteins,aswellasthesearchingofnewt herapeutictargetsites. 【Keywords】SELDITOFMS;proteinarrayanalysis;liverne oplasms;tumorcells,cultured;distinctprotein 【摘要】目的：运用表面增强激光解吸/离子化/飞行 时间质谱技术,检测体外培养的肝癌细胞株（HepG2）,转染 乙肝病毒的肝癌细胞株（）与正常肝细胞株（LO2）蛋白质 的差异表达，筛选肝细胞癌的标志蛋白，为进一步研究肝 癌发病的蛋白质组学机制奠定基础.方法：常规培养上述 3 种细胞，细胞状态良好时收集细胞，裂解细胞后采用 SELDITOFMS 技术用 WCX2 芯片检测 HepG2,LO2 细胞内蛋白 质组学的差异表达.结果：WCX2 芯片共捕获 91 个蛋白，在 Mr500015000 区段，与正常肝细胞株比较，有 7 个蛋白质 在两种肝癌细胞中出现明显变化，其中 2 个蛋白在肝癌细 胞中表达量增高，5 个蛋白在肝癌细胞中表达量降低；另外 两种肝癌细胞株也有其各自的标志蛋白，9 个蛋白分子在 HepG2 表达量增高，10 个蛋白分子在表达量增高.结论： SELDI 蛋白芯片技术检测可作为检测肝癌早期生物标记的方 法，它简便，敏感性高，重复性好，本文发现的这些组织 特异性蛋白生物标记对肝癌的早期诊断有潜在的应用价值， 对我们从血清或组织标本中筛选和鉴定不同型别肝癌细胞 之间的标志蛋白有重要意义，从而为从蛋白质水平研究肝 癌的发病机制及新的治疗靶位的寻找奠定了一定的基础. 【关键词】表面增强激光解吸/离子化/飞行时间质谱； 蛋白质陈列分析；肝肿瘤；肿瘤细胞，培养的；差异蛋白 0 引言 原发性肝癌在我国是常见的恶性肿瘤之一，其死亡率 在部分城市中占恶性肿瘤死因的第二位.每年有 11 万人死 于肝癌，占全世界肝癌死亡人数的 45%.肝癌早期没有明显 体征，多数病人确诊时已属晚期，难以治愈，死亡率很高. 所以，对于肝癌的早期诊断，在无症状的人群中发现早期 病例，对控制肝癌的病死率有现实的意义.因此，研究并寻 找有价值的预警肝癌的标志物，成为进一步提高肝癌临床 治疗水平的关键.任何疾病在出现病理变化之前，细胞内的 蛋白质在成分和数量上都会有相应的改变，癌症的发生是 一个多基因多阶段多因子的动力学过程，HCC 也不例外，目 前对肝癌发生机制的研究大都是在基因水平，但是 mRNA 的 水平并不能真正代表所表达的蛋白质水平，因此，要求对 生物功能的执行者蛋白质进行研究. 蛋白质组是指一个基因组、一个细胞或组织或一种生 物体所表达的全部蛋白质1.蛋白质组学 （Proteomics）是蛋白质组概念的延伸，是在整体水平上 研究细胞内蛋白质组成及其活动规律的学科.蛋白质组学技 术为研究肿瘤标志物与肿瘤进展转移研究提供良好的技术 平台,为研究开辟了新的手段和视角.SELDI 蛋白质芯片技术 是近年来新兴的一种蛋白质组学技术，它具有简单、快捷、 灵敏等特点，可以检测分子量在 Mr500500000 之间的蛋白 或多肽，而且所需样本体积小（400L） 2-3.我们应 用细胞裂解液裂解体外培养的 3 种细胞（LO2,HepG2,） ，进 行了表面增强激光解吸/离子化/飞行时间质谱技术 （SELDITOFMS）分析，初步建立了正常肝细胞、肝癌细胞 与转染乙肝病毒的肝癌细胞的蛋白表达图谱4 ，发现了 一系列（信噪比）差异表达的蛋白，为今后从血清或肝癌 组织中筛选标志蛋白提供科学依据. 1 材料与方法 材料正常肝细胞株（LO2）购自中科院上海细胞库；肝 癌细胞株（HepG2）及携带乙肝病毒的肝癌细胞株（）由第 四军医大学吴力克主任医师赠送.HPLC 水，乙晴，三氟乙酸， 白芥子酸（SPA）,TritonX100，尿素，4 羟乙基哌嗪乙磺酸 （HEPES） ，表面活性剂（CHAPS）均购自美国 Sigma 公司， 蛋白质芯片时间质谱分析仪（PBSC）及 WCX2（弱阳离子 交换芯片）购自美国 CiphergenBiosystems 公司. 方法 细胞总蛋白质的提取 LO2,HepG2 细胞采用含 100mL/L 胎牛血清的 1640 培养基培养，细胞另外加入终浓度 200g/L 的 G418,细胞长成单层后，用无菌细胞刮刀刮取细胞，PBS 洗 3 次，加入裂解液 （8mol/Lurea,40g/LCHAPS,40mmol/LTrisHCl，pH） 200L,4剧烈震荡 30min,20817