体外分析ppt课件

体外放射分析法体外放射分析法 类型类型 一、竞争性分析：一、竞争性分析： 放射免疫分析法（放射免疫分析法（RIARIA），标记抗原），标记抗原 二、非竞争性分析：二、非竞争性分析： 免疫放射分析法（免疫放射分析法（IRMAIRMA），标记抗体），标记抗体 放射免疫分析放射免疫分析 一、基本原理：一、基本原理： 限量标记抗原（限量标记抗原（* *AgAg）和可变量的待测）和可变量的待测 的非标记抗原（的非标记抗原（AgAg）与定量的特异性抗体（）与定量的特异性抗体（ AbAb）发生竞争结合反应，通过测定复合物的）发生竞争结合反应，通过测定复合物的 放射性来计算出待测非标记抗原的含量。放射性来计算出待测非标记抗原的含量。 * *AgAg AgAg AbAb* *Ag-Ag-AbAbAg-Ag-AbAb* *AgAg 放射免疫分析标准曲线常用的三种作图法放射免疫分析标准曲线常用的三种作图法 二、二、RIARIA 试剂盒的必备条件：试剂盒的必备条件： 1 1、抗体：、抗体： 多克隆抗体与单克隆抗体多克隆抗体与单克隆抗体 理想的抗体：理想的抗体：高亲和力、高特异性、高滴度高亲和力、高特异性、高滴度 放射免疫分析技术所用抗体质量的三种主要指标放射免疫分析技术所用抗体质量的三种主要指标 亲和力测定亲和力测定交叉反应测定交叉反应测定 滴度的检测滴度的检测 （1 1）亲和力）亲和力 （2 2）交叉反应）交叉反应 （3 3）滴度检测：）滴度检测： 大分子抗原大分子抗原125 125I I 小分子小分子 3 3 HH 或接一个大分子蛋白质，常用牛血清白蛋白，再或接一个大分子蛋白质，常用牛血清白蛋白，再125I125I标记标记 125125I I标记：每个蛋白分子小于 标记：每个蛋白分子小于1 1个个125 125I I原子 原子 3 3 HH标记：标记： 每个蛋白分子可每个蛋白分子可1414个个 3 3 HH原子原子 2 2、标记抗原：、标记抗原： 标记率、比活度标记率、比活度 放化纯放化纯 T1/2T1/2不能太短：不能太短：125 125I 59.7 I 59.7天天 3 3 HH 不改变原有抗原特性（特异性、亲和力、免疫活性等）不改变原有抗原特性（特异性、亲和力、免疫活性等） 3 3、标准品或校准试剂：、标准品或校准试剂： 4 4、质控样品：、质控样品： 标准品是定量的依据，要求纯度尽量高，标准品是定量的依据，要求纯度尽量高， 配制时浓度要准确。配制时浓度要准确。 免疫活性与待测抗原相一致（平行试验）免疫活性与待测抗原相一致（平行试验） 高、中、低三种；高、中、低三种； 质控标本为血清，用质控标本为血清，用PBSPBS稀释，是提纯抗原；稀释，是提纯抗原； 用用“ “0”0”血清稀释，血清稀释，“ “0”0”血清可用混合血清；血清可用混合血清； 用活性炭等处理；用活性炭等处理； （1 1）液相分离剂：）液相分离剂： a a、双抗体沉淀法；、双抗体沉淀法； b b、PEGPEG沉淀法；沉淀法； c c、葡萄球菌、葡萄球菌A A蛋白（蛋白（SPASPA）沉淀法；）沉淀法； d d、活性炭吸附法：测上清液、活性炭吸附法：测上清液 e e、微孔滤膜过滤法、微孔滤膜过滤法 f f、其它：如盐析法、层析法、电泳法等、其它：如盐析法、层析法、电泳法等 5 5、分离试剂和材料：、分离试剂和材料： （2 2）固相分离剂：）固相分离剂： 材材 料料：如塑料、纤维等，凝胶颗粒等：如塑料、纤维等，凝胶颗粒等 具备条件具备条件： a a、吸附牢固；、吸附牢固； b b、不影响抗体免疫活性；、不影响抗体免疫活性； c c、NSBNSB低；低； d d、吸附材料的理化性质稳定；、吸附材料的理化性质稳定； e e、吸附材料价廉易得；、吸附材料价廉易得； 三、测定方法三、测定方法 1 1、加样：、加样： （1 1）经典加样法；）经典加样法； （2 2）顺序加样法：）顺序加样法： AbAb+ +待测待测Ag *AgAg *Ag 测小分子抗原可提高灵敏度，但稳测小分子抗原可提高灵敏度，但稳 定性、重复性较差定性、重复性较差 2 2、孵育：、孵育： 3 3、分离结合与游离部分：、分离结合与游离部分： 4 4、测放射性：、测放射性： 5 5、数据处理：、数据处理： 四、评估四、评估RIARIA试剂盒的试剂盒的 主要技术指标主要技术指标 1 1、灵敏度：、灵敏度： 该试剂盒的最低检测值该试剂盒的最低检测值 RIARIA：0 0管的结合率管的结合率-2SD-2SD IRMA IRMA： 0 0管的结合率管的结合率+2SD+2SD 2 2、准确度：、准确度： 指样品测定值偏离真值的程度指样品测定值偏离真值的程度 回收试验：回收试验：95105%95105% 3 3、精密度：、精密度： 同一样品重复测定的实测剂量的离散程度同一样品重复测定的实测剂量的离散程度 CV=SD/CV=SD/均数均数100%100% 批内批内10%10%； 批间批间15%15% ABCVABCV： 一批试验的一批试验的 平均平均CVCV（为各样品（为各样品CVCV的平均值的平均值 如两批样品的含量一高一低，如两批样品的含量一高一低，ABCVABCV就缺乏可就缺乏可 比性，就必须作比性，就必须作精密度图精密度图： 4 4、特异性：、特异性： 主要指抗体的特异性主要指抗体的特异性 5 5、非特异结合率：、非特异结合率： PEGPEG10%10% 双抗或固相双抗或固相5%5% 6 6、剂量、剂量- -反应曲线和工作范围：反应曲线和工作范围： 改变抗体滴度对标准曲线不同区段斜率（改变抗体滴度对标准曲线不同区段斜率（A A）及精密度图（）及精密度图（B B）的影响）的影响 五、五、RIARIA的质控的质控 1 1、目的：、目的： 质控是对分析工作的误差进行经常质控是对分析工作的误差进行经常 性检查，遇到有质量异常则及时采取对性检查，遇到有质量异常则及时采取对 策，以保证分析误差控制在可接受的范策，以保证分析误差控制在可接受的范 围内（围内（QCQC）。）。 2 2、内容：、内容： 试验误差试验误差：随机误差和系统误差：随机误差和系统误差 （1 1）标准曲线质量；）标准曲线质量； （2 2）精密度检验；）精密度检验； （3 3）整批试验的偏差；）整批试验的偏差； （4 4）漂移；）漂移； （5 5）批间质控；）批间质控； 精密度、偏差和准确度三者关系示意图精密度、偏差和准确度三者关系示意图 SchewartSchewart图图 CusumCusum图图 其他放射免疫分析其他放射免疫分析 放射受体分析法；放射受体分析法； 放射竞争蛋白结合分析法；放射竞争蛋白结合分析法； 放射酶分析法；放射酶分析法； 免疫放射分析免疫放射分析 一、基本原理：一、基本原理： 免疫放射分析法（免疫放射分析法（IRMAIRMA）是用过）是用过 量的放射性核素标记的抗体（量的放射性核素标记的抗体（* *AbAb）和）和 限量的抗原或半抗原（限量的抗原或半抗原（AgAg）结合，形成）结合，形成 Ag*Ag*AbAb、其放射性和所加、其放射性和所加AgAg的量呈正相的量呈正相 关。关。 Ag+ *Ag+ *AbAb Ag * Ag *AbAb 二、二、IRMAIRMA的特点：的特点： 1 1、属于非竞争性抗原抗体结合反应；、属于非竞争性抗原抗体结合反应； 2 2、抗原抗体复合物的量与所加非标记抗原量呈正相关；、抗原抗体复合物的量与所加非标记抗原量呈正相关； 3 3、在低剂量区不会有不确定因素，灵敏度较高；、在低剂量区不会有不确定因素，灵敏度较高； 4 4、IRMAIRMA的的NSBNSB对低剂量区影响大；对低剂量区影响大； 5 5、RIARIA低剂量区的放射性高，低剂量区的放射性高，NSBNSB主要影响高剂量区，主要影响高剂量区， IRMAIRMA相反，影响低剂量区；相反，影响低剂量区； 三、三、IRMAIRMA的试剂：的试剂： 1 1、标记抗体；、标记抗体；通常是单克隆抗体。通常是单克隆抗体。 2 2、标准品；、标准品； 3 3、分离试剂：、分离试剂：固相抗体固相抗体 4 4、质控；、质控； 四、四、IRMAIRMA的基本方法：的基本方法： 1 1、双抗体夹心法：、双抗体夹心法： Ab1Ag*Ab2Ab1Ag*Ab2 2 2、标记第三抗体法：、标记第三抗体法： Ab1AgAb2*Ab1AgAb2*抗抗Ab2Ab2 3 3、生物素标记抗体：、生物素标记抗体： Ab1AgAb1Ag生物素标记生物素标记Ab2Ab2125 125I I标记亲和素 标记亲和素 特点特点：每一抗体分子可以连接几十个分子生物素，：每一抗体分子可以连接几十个分子生物素， 提高灵敏度。提高灵敏度。 五、五、IRMAIRMA的实际应用中的特点：的实际应用中的特点： 1 1、标记物的稳定性：、标记物的稳定性：标记抗体标记抗体 2 2、反应动力学：、反应动力学： 标记抗体过量，反应容易达到平衡标记抗体过量，反应容易达到平衡 3 3、分析灵敏度：、分析灵敏度：高高 4 4、可测量的剂量范围宽；、可测量的剂量范围宽； IRMAIRMA和和RIARIA精密度图的比较精密度图的比较 5 5、特异性高；、特异性高；两个抗体两个抗体 6 6、加样误差小；、加样误差小；关键是关键是AgAg 五、五、IRMAIRMA的不足之处：的不足之处： 两株抗体，针对不同抗原决定簇，要求两株抗体，针对不同抗原决定簇，要求 被测抗原至少有被测抗原至少有12161216个氨基酸组成有特征个氨基酸组成有特征 性的序列（性的序列（6868个氨基酸个氨基酸 决定一个抗原决定决定一个抗原决定 簇）。簇）。 主要测定肽类和蛋白质，半抗原不能应主要测定肽类和蛋白质，半抗原不能应 用。用。 非放射性标记免疫分析非放射性标记免疫分析 优点：优点： 1 1、有些技术能提高灵敏度和稳定性；、有些技术能提高灵敏度和稳定性； 2 2、反应迅速，缩短测定时间，提高工作效率；、反应迅速，缩短测定时间，提高工作效率； 3 3、能执行全自动化；、能执行全自动化； 4 4、减少误差，提高质控水平；、减少误差，提高质控水平； 5 5、有效半衰期较长；、有效半衰期较长； 6 6、从免疫分析的角度说，非放射性与放射性分析、从免疫分析的角度说，非放射性与放射性分析 技术的原理是相同的，只是以酶、荧光、发光等代替技术的原理是相同的，只是以酶、荧光、发光等代替 125125I I，最后信号不是放射线而是其他物理形式。 ，最后信号不是放射线而是其他物理形式。 一、酶标记免疫分析法：一、酶标记免疫分析法： 固相固相Ab1AgAb1Ag酶标记酶标记AbAb 作用于酶底物，作用于酶底物， 产生光吸收物质产生光吸收物质 、荧光物质或化、荧光物质或化 学发光。学发光。 1 1、酶联免疫吸附分析法（、酶联免疫吸附分析法（ELISAELISA） 原理：原理： 在抗体分子上连接酶分子，代替放射在抗体分子上连接酶分子，代替放射 性标记的抗体，进行与性标记的抗体，进行与IRMAIRMA相似的夹心免相似的夹心免 疫反应。反应结束后，分离结合、游离部疫反应。反应结束后，分离结合、游离部 分，取结合部分，利用酶的催化活性，由分，取结合部分，利用酶的催化活性，由 结合部分上的酶将特定的底物转化为特定结合部分上的酶将特定的底物转化为特定 的颜色，颜色的深浅与酶的量呈正比。的颜色，颜色的深浅与酶的量呈正比。 2 2、酶免疫荧光分析法、酶免疫荧光分析法 将酶反应的底物改为荧光物质将酶反应的底物改为荧光物质光子激发光子激发荧光荧光 二、发光免疫分析法：二、发光免疫分析法： 采用化学发光物质作为标记物采用化学发光物质作为标记物 化学发光免疫分析（化学发光免疫分析（ CLIACLIA） 酶增强发光免疫分析（酶增强发光免疫分析（ ECLEAECLEA） 电化学发光免疫分析（电化学发光免疫分析（ECLIAECLIA ） 1 1、化学发光免疫分析法（、化学发光免疫分析法（CLIACLIA） 原理：原理： 发光物质标记抗原或抗体，标记的发发光物质标记抗原或抗体，标记的发 光物质通过氢化反应获得能量，处于激发光物质通过氢化反应获得能量，处于激发 态，当其返回基态时以光子形式释放能量态，当其返回基态时以光子形式释放能量 ，其发光强度与被测物质浓度相关。，其发光强度与被测物质浓度相关。 固相固相Ab1Ab1待测待测AgAg化学发光物质标记化学发光物质标记AbAb 氧化等反应氧化等反应发生发生 化学反应化学反应光子。光子。 发光物质：发光物质： 1 1、异鲁米诺；、异鲁米诺；2 2、丫啶酯类；、丫啶酯类；3 3、苯酚类；、苯酚类； 4 4、咪唑类；、咪唑类；5 5、苯基草酸酯类、苯基草酸酯类 2 2、酶增强发光免疫分析法（、酶增强发光免疫分析法（ECLEAECLEA） 原理：原理： 将化学发光物质作为酶的发光底物，将化学发光物质作为酶的发光底物， 由酶触发化学发光物质激发过程，产生光由酶触发化学发光物质激发过程，产生光 子。子。 酶：酶： 1 1、辣根过氧化酶系统；、辣根过氧化酶系统； 2 2、碱性磷酸酶系统；、碱性磷酸酶系统； 以以DPCDPC公司为例：公司为例： AMPPDAMPPD中间体中间体 减去一个磷酸基减去一个磷酸基 裂解裂解 金刚烷酮金刚烷酮间氧苯酯阴离子（激发态）间氧苯酯阴离子（激发态） 基态基态 光子光子 3 3、电化学发光免疫分析法（、电化学发光免疫分析法（ECLIAECLIA） 原理：原理： 是一种在电极表面由电化学引起的发光反应。是一种在电极表面由电化学引起的发光反应。 三联吡啶钌三联吡啶钌+ + 三丙胺（三丙胺（TPATPA） 电场阳极面电场阳极面 氧化反应（失去一个电子）氧化反应（失去一个电子） TPATPA氧化成阳离子自由氧化成阳离子自由 基，失去一个质子，形基，失去一个质子，形 成一种强还原剂成一种强还原剂 三价三联吡啶钌三价三联吡啶钌 二价（强氧化剂）二价（强氧化剂） 激发态激发态光子光子 * * 三联吡啶钌无消耗，仅消耗三联吡啶钌无消耗，仅消耗TPATPA 三、荧光免疫分析法：三、荧光免疫分析法： 该反应系统不使用酶，而用荧光物质标记该反应系统不使用酶，而用荧光物质标记 抗原或抗体进行分析。抗原或抗体进行分析。 1 1、荧光偏振分析技术（、荧光偏振分析技术（FPIAFPIA）；）； 2 2、时间分辨荧光免疫分析技术（、时间分辨荧光免疫分析技术（TrFIATrFIA）；）； 铕（铕（EuEu）标记抗体）标记抗体+ +待测待测AgAg形成复合物形成复合物 酸性条件下酸性条件下 EuEu 荧光弱信号荧光弱信号 增强液增强液-二酮体二酮体 新的螯合物新的螯合物 持续且强的荧光信号持续且强的荧光信号 在此反应中，自然本底荧在此反应中，自然本底荧 光衰变光衰变410ns410ns，而，而EuEu3+ 3+的 的 荧光衰变为荧光衰变为4.3104.310 5 5 nsns RIARIA与化学发光的比较与化学发光的比较 RIARIA存在以下不足：存在以下不足： 1 1、标记物的稳定性；、标记物的稳定性； 2 2、反应时间过长；、反应时间过长； 3 3、放射性计数有自身涨落；、放射性计数有自身涨落； 4 4、人工操作存在误差；、人工操作存在误差； 5 5、不能进行全自动化操作；、不能进行全自动化操作； 6 6、药盒有效期短；、药盒有效期短； 化学发光的优点：化学发光的优点： 1 1、非放射性分析；、非放射性分析； 2 2、灵敏度高；、灵敏度高； 3 3、稳定性好；、稳定性好； 4 4、检测速度快；、检测速度快； 5 5、全自动化；、全自动化； 6 6、半衰期长；、半衰期长； 受体放射配基结合分析受体放射配基结合分析 一、基本原理：一、基本原理： 用放射性核素标记配基与相应的受体进行用放射性核素标记配基与相应的受体进行 特异性结合，测定复合物的放射性活度，从而特异性结合，测定复合物的放射性活度，从而 对受体进行定性和定量。对受体进行定性和定量。 R+LR+LRLRL K1,v1K1,v1 K2,v2K2,v2 R R为游离受体；为游离受体；L L为游离配基的浓度为游离配基的浓度 RLRL为复合物浓度为复合物浓度 K1K1为结合速率常数，为结合速率常数，k2k2为解离速率常数为解离速率常数 1 1、饱和曲线：、饱和曲线： 2 2、竞争抑制曲线：、竞争抑制曲线： 若受体和放射性配基的结合反应系统若受体和放射性配基的结合反应系统 中另加入该受体的非标记配基，则后者会中另加入该受体的非标记配基，则后者会 与放射性配基竞争受体与放射性配基竞争受体 一、基本条件：一、基本条件： 1 1、受体标本、受体标本： （1 1）分离亚细胞组分；）分离亚细胞组分； （2 2）完整的活细胞；）完整的活细胞； （3 3）组织切片；）组织切片； 2 2、标记配基：、标记配基： （1 1）高比活度；）高比活度； （2 2）高亲和力；）高亲和力； （3 3）高特异性；）高特异性； （4 4）高放化纯度；）高放化纯度； 3 3、非标记配基、非标记配基： （1 1）测）测NSBNSB； （2 2）竞争结合反应中作为竞争剂；）竞争结合反应中作为竞争剂； 4 4、结合反应类型：、结合反应类型： （1 1）多点饱和曲线；）多点饱和曲线； （2 2）单点法；）单点法； 5 5、反应的环境条件：、反应的环境条件： （1 1）PHPH、BufferBuffer； （2 2）温育温度和时间；）温育温度和时间； （3 3）反应体积；）反应体积； 6 6、分离结合和游离部分：、分离结合和游离部分： 临床意义：临床意义： 1 1、内分泌系统、内分泌系统： （1 1）甲状腺激素：）甲状腺激素：T3T3、T4T4、FT3FT3、FT4FT4、TSHTSH、 TGAbTGAb、TMAbTMAb、TPOAbTPOAb、TgTg、TRAbTRAb； （2 2）糖尿病：胰高糖素、胰岛素、）糖尿病：胰高糖素、胰岛素、C C肽、生长抑素、肽、生长抑素、 IAbIAb、IcAbIcAb、GADGAD； （3 3）肾上腺：皮质醇、）肾上腺：皮质醇、ACTHACTH； （4 4）生殖系统：）生殖系统：FSHFSH、LHLH、T T、P P、E2E2、PRLPRL、 HCGHCG、-HCG-HCG； 2 2、垂体系统