第4章 细菌药敏试验及其耐药表型检测 ppt课件

第4章 细菌药物敏感 试验及其耐药表型检测 王辉 北京大学医学部 抗菌药物敏感试验 测定抗菌药物在体外对病原微生物有无 抑菌或杀菌作用的方法称为抗菌药物敏 感性试验（Antimicrobial Susceptibility Test），简称药敏试验（AST）。 药敏试验的意义 预测抗菌治疗的效果； 指导抗菌药物的临床应用； 发现或提示细菌耐药机制的存在，能帮助临 床医生选择合适的药物，避免产生或加重细 菌的耐药； 监测细菌耐药性，分析耐药菌的变迁，掌握 耐药菌感染的流行病学，以控制和预防耐药 菌感染的发生和流行。 药敏试验 MIC：在与微生物生长速率有关的特定 时间间隔内，通常是1824小时，能够 抑制被测菌生长的最低药物浓度。 对倍稀释的优点： 操作容易 敏感株的MIC呈正态分布 区分异常(R)与敏感(S)的菌群 药敏试验折点的建立 1. MIC的分布 2. 药代动力学和药效学 定 MIC的折点 3. 临床疗效和细菌清除率 4. 抑菌圈直径的分布 定抑菌圈折点 统计学的线性回归 计算错误率：尽可能减少极重要误差 (假敏感率) MIC的分布 药代动力学和药效学 药代动力学：药物吸收，分布，代谢，排泄 药效学：药物对机体的作用 时间依赖型（TMIC：-内酰胺类，大环内酯类 浓度依赖型（AUC/MIC比率：AGS, FQ 这些参数可用于计算具有最佳药效的给药方案 MIC与抑菌圈直径的线性关系 耐药 中介 敏感 R I S Log2. MIC D 1 d2 抑菌圈直径（mm) v 抑菌圈直径与MIC的关系 不同国家的判定折点 可能不同 原因： 用药剂量不同，服药的间隔不同 评价敏感时较保守 更强调检测出耐药株（即特定的耐药群） 技术因素：接种、培养基 在我国主要遵循临床实验室标准化委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）制定的抗菌药 物选择原则。 敏感性分类(CLSI的定义) 敏感（Susceptible） 用常规用量治疗有效 常规用药时达到的平均血药浓度超过细菌的 MIC 5倍以上。 耐药（Resistance） 用常规用量治疗不能抑制细菌的生长 MIC高于药物在血、体液中可能达到的浓度 敏感性分类（2） 中介 (Intermediate) MIC接近血、体液中药物的浓度，治疗 反应率低于敏感株 药物生理浓集部位有效 (尿-FQ) 加大用药剂量可能有效 缓冲区：防止操作的系统误差造成重 大结果的判定错误 药敏试验的方法学 半定量纸片扩散法 (抑菌圈直径) MIC法： 稀释法(肉汤、琼脂) 自动化仪法 抗生素连续梯度法 (Etest ) 流式细胞仪 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼 脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后 不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周 围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无 菌生长的透明圈即为抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度， 并与该药对测试菌的MIC呈负相关关系。 纸片扩散法（Kirby-Bauer法） 纸片扩散法 1.水解酪蛋白（MH）培养基，pH7.27.4，做成琼脂厚度 4mm，直径90mm的平板； 2.挑取孵育16 24小时已分纯菌落，置于生理盐水管中， 振荡混匀后校正浓度至0.5麦氏标准。 纸片扩散法 3.用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液； 4.然后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度； 5.最后沿平板内缘涂抹1周； 6.平板在室温下干燥35min，用无菌镊子或商品化的纸片分配 器将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心距离应大于24mm ，纸片距平板内缘大于15mm。 纸片扩散法 7.35孵育1624小时量取 抑菌圈直径； 8.根据抑菌环的直径，按照 CLSI标准判读，报告敏感 、中介、耐药。 *18 纸片扩散法影响因素 MIC 接种菌量 细菌生长率 抗生素含量、扩散性 平皿厚度 温度，预孵育时间 *19 纸片扩散法标准化 CLSI：美国实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute) 每年修订更改 包括质控 新药的判定标准 特殊耐药性的检测 *20 CLSI的法规 规定纸片含量、接种浓度、培养基、平 皿厚度、判定标准、质控； 规定常规测试报告的抗生素； 不同的药判定标准不同； 不同的菌判定标准也不同。 *21 常规测试并报告的药物分组(1) 肠杆菌科 绿脓和非肠杆菌科 一 级 氨苄西林 头孢他啶，庆大霉素 头孢唑林，庆大霉素替卡西林，哌拉西林 二级 阿米卡星 阿米卡星 氨苄西林/舒巴坦 头孢吡肟，头孢哌酮 阿莫西林/克拉维酸氨曲南 头孢呋肟，头霉素环丙沙星，亚胺培南 头孢噻肟，头孢曲松 替卡西林/克拉维酸 环丙沙星，亚胺培南 妥布霉素，复方磺胺 替卡西林，哌拉西林 三级 氨曲南，头孢他啶头孢曲松 卡那霉素，奈替米星 氯霉素，奈替米星 妥布霉素 四环素，氯霉素 *22 常规测试并报告的药物分组(2) 葡萄球菌肠球菌 一级 苯唑西林，青霉素 青霉素，氨苄西林 二级 红霉素类万古霉素 克林霉素，万古霉素 三级 氯霉素庆大霉素 *23 常规测试并报告的药物分组(3) 流感嗜血杆菌肺炎链球菌 一级 氨苄西林，青霉素青霉素，红霉素 复方磺胺 复方磺胺 二级 头孢呋肟，头孢噻肟氧氟沙星，四环素 头孢他啶，氯霉素 万古霉素 三级 阿奇霉素，头孢克罗氯霉素，利福平 环丙沙星，亚胺培南利福平，四环素 *24 预报用药(一) 测试药菌名推测其他药物的敏感性 苯唑西林 葡萄球菌所有-内酰胺类 四环素所有（除葡多西环素，米诺环素 萄球菌和不 动杆菌 红霉素G球菌罗红霉素，克拉霉素， 阿奇霉素 克林霉素所有林可霉素 *25 预报用药(二) 测试药菌名推测其他药物的敏感性 氨苄西林肠球菌青霉素 青霉素G葡萄球菌氨苄西林，美洛西林 替卡西林 头孢噻吩肠杆菌科头孢拉定，头孢氨苄 头孢克罗 奈啶酸肠杆菌科所有氟喹诺酮类 万古霉素所有替考拉宁 以一定浓度的抗菌药物与含有被试菌株的培养基进 行一系列不同倍数稀释（通常为双倍稀释），经培 养后观察其最低抑菌浓度。 稀释法中用琼脂培养基者为琼脂稀释法，用肉汤培 养基者为肉汤稀释法。 药敏试验-稀释法 常用抗菌药物容积稀释法 步骤浓度 （g/mL） 来源 体积 (mL) CAMHB (mL) 最终浓度 （g/mL） 15120储存液19512 2512步骤111256 3512步骤113128 4512步骤11764 564步骤41132 664步骤41316 764步骤4178 88步骤7114 98步骤7132 108步骤7171 111步骤10110.5 121步骤10130.25 131步骤10170.125 抗菌药物的稀释和融解 *29 肉汤稀释法 4 8 16 32 64 128 256 ug/ml 混 混 清 抗生素倍比稀释，种菌105CFU/ml ， 孵育35， 1620h，判读。 *30 肉汤稀释法 调节离子浓度的MH肉汤 宏量肉汤法（2ml, 13x100mm ） 微量肉汤法 （ 0.1ml, 微量板） 自动化仪 优点：准确，可靠，可用于研究。 缺点： 劳动强度大 细菌生长情况不可查 *31 琼脂稀释法 浓度 16 32 64 128 256 ug/ml 制备含对倍抗生素浓度梯度的平板，制备菌悬液， 点种菌，104/每个点，孵育，判读结果 *32 琼脂稀释法 优点：金标准 精确可靠 可同时测定多株菌（40株） 细菌生长情况可查 缺点： 测多个药时劳动强度大 制备平皿费时费力 E test 法 nE试条是一条5mm50mm的无孔试剂载体，一面固 定有一系列预先制备的，浓度呈连续指数增长稀释抗 菌药物，另一面有读数和判别的刻度； n抗菌药物的梯度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度的 宽度范围； n将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜 ，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条 交点的刻度浓度即为抗菌药物抑制细菌的最小抑菌浓 度。 *wanghui-ART34 E test 法 细菌生长 区 E test 塑料 条 椭圆形 细菌生长 抑制区 256 128 8 016 判读抑菌浓度 （MIC ug/ml) E test 法 菌液制备及接种均同纸 片扩散法。 90mm平板上可放E试验 试条1 2条，140mm 平板最多可放6条。 孵育温度及时间同纸片 扩散法。 *36 E test 法 优点 连续浓度梯度，与琼脂稀释法相关性好 影响因素少，稳定性高 操作简单，省时 缺点：昂贵 用途：快生长菌，苛养菌，厌氧菌，酵母菌， 分枝杆菌 *37 评价药物体外抗菌活性的指标 MIC50, MIC90, MIC 均值， MIC 范围，R，I，S MIC50/ MIC90：MIC从小到大排列，位于第50 / 90 百分位菌株的MIC值 单纯比较MIC50，MIC90是片面的，还要同时看平均 MIC及MIC范围 同时结合R，I，S，(不同药物血浓度不同，安全范 围不同) 细菌耐药机制 细菌耐药机制主要有四种： 产生一种或多种水解酶、钝化酶和 修饰酶； 抗生素作用的靶位改变，包括青霉 素结合蛋白位点、DNA解旋酶、 DNA拓扑异构酶的改变等； 细菌膜的通透性下降，包括细菌生 物被膜的形成和通道蛋白丢失； 细菌主动外排系统的过度表达。 在上述耐药机制中，第一、二种耐药 机制具有专一性，第三、四种耐药机 制不具有专一性。 -内酰胺酶 内酰胺酶是一类水解青霉素、头孢菌素类抗 生素的灭活酶；该酶位于革兰阳性球菌菌体外 ，革兰阴性杆菌间质中； 检测方法有微生物培养法、碘淀粉法、头 孢硝噻吩纸片法。其中头孢硝噻吩纸片法因为 简单、方便、快速，应用于临床检测。 葡萄球菌属 青霉素 方法敏感中介耐药 MIC0.12 g/ml-0.25 g/ml 纸片扩散法29 mm-28 mm CLSI M100-S20. Table 2C.CLSI M100-S20. Table 2C. 诱导-内酰胺酶的检测 如果青霉素的药敏结果出现以下情况，需 要做诱导-内酰胺酶的检测 ： MIC 0.12 g/ml Zone diameter 29 mm 诱导-内酰胺酶试验 苯唑西林苯唑西林 ( (诱导剂诱导剂) ) - -接种纯菌落于琼脂上接种纯菌落于琼脂上 ( (例如，例如，BAP, BAP, MHA) MHA) ； - -贴贴-内酰胺类纸片内酰胺类纸片 ( (例如例如, ,苯唑西林苯唑西林, , 头孢西丁头孢西丁) )； - -孵育过夜；孵育过夜； - -测试抑菌圈周围的细菌；测试抑菌圈周围的细菌； - -如果如果 - -内酰胺酶阳性内酰胺酶阳性, ,报告青霉素报告青霉素R R。 PosPosNegNeg 超广谱-内酰胺酶（ESBLs） ESBLs是指由质粒介导的能水解青霉素类、头孢菌 素类和单环内酰胺类氨曲南的一类酶； ESBLs不能水解头霉素类和碳青霉烯类药物，能被 克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦等内酰胺酶抑制剂 所抑制； ESBLs主要见于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，此外 也见于肠杆菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、沙 雷菌属等其他肠杆菌科细菌、不动杆菌、铜绿假单 胞菌。 超广谱-内酰胺酶（ESBLs） 纸片法，出现以下一种情况即可怀 疑该菌株产生ESBL （筛选阳性）： 头孢泊肟17mm 头孢他啶22mm 头孢噻肟27mm 头孢曲松25mm 氨曲南 27mm 超广谱-内酰胺酶（ESBLs） 纸片法（表型确认试验） 头孢他啶和头孢他啶/克 拉维酸、头孢噻肟和头孢 噻肟/克拉维酸。 任一复方制剂的抑菌圈直 径与相应单药抑菌圈直径 相差5mm时，即可判断 该菌产ESBL。 超广谱-内酰胺酶（ESBLs） 稀释法，出现以下一种情况即可怀疑该菌 株产生ESBL： 头孢他啶或头孢噻肟或头孢曲松或氨曲 南MIC2g /mL 或头孢泊肟MIC8g /mL 超广谱-内酰胺酶（ESBLs） 稀释法（表型确认试验） 头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟 和头孢噻肟/克拉维酸。 任何一组酶抑制剂复方制剂的MIC值比相 应单药的MIC降低3个稀释度者即可判定该 菌为产ESBL菌株。 AmpC酶的特征 AmpC酶是在革兰阴性菌中发现的由染色体 或质粒介导的水解头孢菌素的型内酰胺酶 ，可分为诱导酶和非诱导酶。 与ESBLs不同的是，AmpC酶对三代头孢菌 素耐药但对四代头孢菌素敏感且不被酶抑制 剂克拉维酸所抑制，但其酶活性可被氯唑西 林和硼酸抑制。 AmpC酶的检测方法 头孢西丁三维试验是检测AmpC酶的经典方法 ； 除此之外，还有以硼酸化合物为抑制剂检测肺 炎克雷伯菌和大肠埃希菌的AmpC酶、AmpC Disk、头孢西丁琼脂基础法等。 碳青霉烯酶 碳青霉烯酶可以定义为具有水解碳青霉烯类抗生素 活性的-内酰胺酶，主要分布于-内酰胺酶A、B、 D类中。 根据水解机制中作用位点的不同可以将碳青霉烯酶 分为两大类： 一类称为金属碳青霉烯酶，这类酶以金属锌离子为活性 作用位点，可以被EDTA抑制，属于B类-内酰胺酶； 另一类以丝氨酸（Ser）为酶的活性作用位点，可以被酶 抑制剂克拉维酸和他唑巴坦所抑制，属于A、D类-内酰 胺酶。 碳青霉烯酶 A类酶B类酶D类酶 染色体编 码：SME NMC IMI 质粒编码 ：KPC GES 质粒编码 OXA-23 OXA-24 OXA-51 OXA-58 OXA-55 OXA-48 OXA-50 OXA-60 OXA-62 金属酶，位于 GMEs上，包括 VIM，IMP， GIM，SPM， SIM等 可以被酶抑制剂抑制 可以被EDTA抑制 碳青霉烯酶表型检测方法-改良hodge试验 ATCC25922，0.5麦氏，1:10稀释涂MH平板 平皿中心贴10g 厄他培南或亚胺培南纸片 10l环挑取3 5个菌落从平板中心纸片边缘向平板边缘划线 被测菌株与大肠埃希菌ATCC25922 抑菌环交汇处大肠埃希菌生 长增强，即产碳青霉烯酶。 改良hodge试验的结果判读 金属酶表型检测方法：EDTA协同试验 用0.5麦氏单位的待测菌悬液涂布M H 平板。 贴IMP (10g)纸片距其1cm 处贴EDTA纸片（0.5mol/L 4l） 。 35 过夜培养。 亚胺培南抑菌圈在靠近加EDTA纸片侧明显扩大者为产金属酶菌 株。 亚胺培南 EDTA 10mm 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）携带SCCmec基因盒 。SCCmec基因盒中的MecA基因编码修饰的青霉素结合蛋白 PBP2a，这种蛋白对甲氧西林和其他的-内酰胺类抗生素亲和 力下降，从而导致对这些抗生素的耐药。 SCCmec主要由mec复合物和ccr复合物两部分组成。根据不 同mec复合物和ccr复合物的组合，可以将SCCmec分成不同的 型别，目前已发现8种SCCmec型。 耐甲氧西林葡萄球菌 SCCmec基因盒 耐甲氧西林葡萄球菌的检测 MRSA的检测方法有头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林 琼脂稀释法、乳胶凝胶试验检测PBP2a、mecA基因 测定及MRSA显色培养基。 头孢西丁纸片法、苯唑西林琼脂稀释法是目前检测耐 甲氧西林葡萄球菌最常用筛选方法。 对于金黄色葡萄球菌，MRSA的检测可以使用苯唑西 林纸片，但对于凝固酶阴性葡萄球菌则不能使用苯唑 西林纸片。 甲氧西林耐药的葡萄球菌（MRS） MRS检测药物纸片法稀释法 金黄色葡萄球菌1g 苯唑西林 路邓葡萄球菌1g 苯唑西林 金黄色葡萄球菌和路 邓葡萄球菌 30g 头孢西丁 除路邓以外的凝固酶 阴性葡萄球菌 1g 苯唑西林 30g 头孢西丁 凝固酶阴性葡萄球菌中苯唑西林MIC结果的报告策略* 苯唑西林苯唑西林 MIC (MIC ( g/ml)g/ml) 进行进行 mecmecA A 或或 PBP2a PBP2a 或或 头孢西丁纸片扩散头孢西丁纸片扩散 0.250.25 4.04.00.5-2.00.5-2.0 报告苯唑西林敏感报告苯唑西林敏感报告苯唑西林耐药报告苯唑西林耐药 阴性阴性阳性阳性 报告苯唑西林敏感报告苯唑西林敏感报告苯唑西林耐药报告苯唑西林耐药 * *检测无菌部位感染的检测无菌部位感染的 非表皮葡萄球菌菌株非表皮葡萄球菌菌株 克林霉素诱导耐药试验 克林霉素诱导耐药葡萄球菌 红霉素*耐药的金葡菌或凝固酶阴性葡萄 球菌可对克林霉素结构性或诱导性耐药或 仅对红霉素耐药。 *或其他大环内酯类 机制机制耐药基因耐药基因红霉素红霉素克林霉素克林霉素 核糖体修饰核糖体修饰- -药物不能结药物不能结 合于靶位合于靶位 ermerm R R S*S* R R R R 结构性结构性 泵泵- -药物被泵出药物被泵出msrmsrA A R R S S ermerm= erythromycin ribosome methylase= erythromycin ribosome methylase msrAmsrA= macrolide streptogramin resistance= macrolide streptogramin resistance * *需要诱导来显示耐药性需要诱导来显示耐药性 红霉素/克林霉素耐药葡萄球菌耐药机制 诱导性克林霉素耐药（erm介导） 葡萄球菌-“D试验” 患者不会对克林霉素有反应-报 告克林霉素耐药 无克林霉素诱导（msrA介导） 真的克林霉素敏感-报告克林霉素敏感 “D” 阳性阳性 阴性阴性 15 15 26 mm 26 mm 葡萄球菌诱导性克林霉素耐药的MIC检测方法 4.04.0 g/ml g/ml 红霉素红霉素 0.50.5 g/ml g/ml 克林霉素克林霉素 No growthNo growth = = 无诱导性克林霉素无诱导性克林霉素 耐药耐药 生长生长= =诱导性克林霉素耐药诱导性克林霉素耐药 对于红霉素耐药，克林霉素敏感的葡萄球菌， 需检测诱导性克林霉素耐药 注意 试验适用于金葡菌和凝固酶阴性葡萄球菌(苯唑西林敏感和 耐药株)； 对于CoNS，该试验不必常规开展因为克林霉素很少用于 治疗凝固酶阴性葡萄球菌； 大多数医院相关MRSA是克林霉素耐药的； 大多数社区相关MRSA是克林霉素敏感的(msrA 基因型)； 克林霉素可以口服给药。 万古霉素中介耐药的金黄色葡萄球菌（VISA） 耐药是由于：耐药是由于：增厚的细胞壁增厚的细胞壁 检测检测困难；表型不稳定困难；表型不稳定 菌落形态菌落形态不典型金葡菌不典型金葡菌 万古霉素敏感万古霉素敏感万古霉素中介万古霉素中介 细胞壁细胞壁 MRSA (not VISA)MRSA (not VISA) VISAVISA 血琼脂上48小时生长 当有以下一个或多个情况时菌株可疑为VISA -內酰胺类药物的MIC降低 达托霉素MIC升高 菌落形态不典型（一些为微小菌落） 肉汤中生长迟缓（如血培养） 凝固酶反应微弱/延迟 经过几次次代培养后： 菌落回复为典型形态 万古霉素MIC降低并且菌株变为万古霉素敏感 万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌（VRSA） 耐药是由于耐药是由于 从万古霉素耐药肠球菌（从万古霉素耐药肠球菌（VREVRE）中获得）中获得vanAvanA 基因基因 美国报道例数美国报道例数 9 9个患者个患者 检测检测 大多数标准方法均可检测大多数标准方法均可检测 菌落形态菌落形态 典型金葡菌典型金葡菌 vanA从VRE转至金葡菌 vanvanA A 纸片扩散法折点 葡萄球菌-万古霉素 CLSI CLSI 文件文件SusceptibleSusceptible 敏感敏感 IntermediateIntermediate 中介中介 ResistantResistant 耐药耐药 M100-S18 2008M100-S18 2008 1515 - - - - New!New!新新 M100-S19 M100-S19 2009*2009* - - - - - - CLSI M100-S19. Table 2C. CLSI M100-S19. Table 2C. 对于金黄色葡萄球菌对于金黄色葡萄球菌 * *假如抑菌圈假如抑菌圈7 mm7 mm，用用MICMIC法检测万古霉素法检测万古霉素（若有需要）（若有需要） 万古霉素纸片扩散法仅在检测携带万古霉素纸片扩散法仅在检测携带van-Avan-A金葡菌（金葡菌（VRSAVRSA）时可信；需确证）时可信；需确证 没有抑菌圈没有抑菌圈 (6 mm)(6 mm) 纸片扩散法不能鉴别纸片扩散法不能鉴别VSSAVSSA和和VISAVISA 纸片扩散法不能检测凝固酶阴性葡萄球菌纸片扩散法不能检测凝固酶阴性葡萄球菌 肠球菌高水平氨基糖苷类耐药筛查 纸片扩散法 120 g 庆大霉素; 300 g 链霉素 10 mm = 无高水平氨基糖苷类耐药 MIC筛查 庆大霉素: 500 g/ml 链霉素: 1000 g/ml (肉汤) 2000 g/ml (琼脂) 肠球菌氨基糖苷类修饰酶 链霉素 庆大霉素 妥布霉素 阿米卡星/丁胺卡那 6-AAD + - - - 3APH - - - + 2”APH/6AAC - + + + 6AAC* - - + + * 在所有屎肠球菌中均发现 + = + = 酶可以修饰药物；药物无协同性酶可以修饰药物；药物无协同性 - = - = 酶不能修饰药物；药物有协同性酶不能修饰药物；药物有协同性 万古霉素耐药肠球菌（VRE）表型 VRE屎肠球菌中居多 vanA - 高水平耐药(MIC 256 g/ml) vanB - 中等水平耐药 (MIC 16 - 256 g/ml) 低水平万古霉素耐药 vanC - (MIC 2 - 16 g/ml) vanC天然存在于鹑鸡