vegf及cd147在单核细胞来源的泡沫细胞中表达动力学的研究(1)

VEGFVEGF 及及 CD147CD147 在单核细胞来源的泡沫细在单核细胞来源的泡沫细 胞中表达动力学的研究胞中表达动力学的研究(1)(1) 这篇VEGF 及 CD147 在单核细胞来源的泡沫细胞中表达动 力学的研究论文是程序自动抓取于互联网上，查看更多 请点击：论文频道：lwxz/ 作者：岳红红 朱平吴振彪樊春梅赵清波鲍炜 【摘要】 目的：研究 CD147,VEGF 在单核细胞来源的 泡沫细胞中的表达动力学的,探讨 CD147，VEGF 与动脉粥样 硬化的关系.方法:以氧化型低密度脂蛋白诱导，建立人单 核细胞系（U937 细胞）分化的泡沫细胞模型,通过油红 O 特 殊染色的形态学鉴定.将 U937 细胞在不同浓度氧化型低密 度脂蛋白（oxLDL,0，25，50，100，200mg/L）条件下培 养 48h；在 100mg/LoxLDL 条件下，在培养的不同时间点 （0，6，12，24，48h）分别收集泡沫细胞和培养上清，采 用流式细胞术检测细胞膜表面 CD147，ELISA 检测培养上清 中 VEGF 的表达和 RTPCR 检测 mRNA 表达水平.结果:CD147 及 VEGF 表达出现最高峰时的 oxLDL 浓度分别为 25mg/L 和 50mg/L；与 100mg/L 的氧化型低密度脂蛋白作用 6,48h 后，CD147，VEGF 表达分别出现最高峰；VEGFmRNA 水平出 现最高峰时，oxLDL 作用浓度及时间分别为 200mg/L，48h.CD147mRNA 水平出现最高峰时 oxLDL 作用 浓度及时间分别为 25mg/L，6h，此后，mRNA 水平不变.结 论:VEGF 及 CD147 在单核细胞来源的泡沫细胞表达均升高; CD147 表达上调早于 VEGF，低浓度 oxLDL 促进 CD147 表 达，高浓度促进 VEGF 的表达;U937 泡沫细胞中 VEGF 的 mRNA 水平与 oxLDL 的作用浓度及时间成正相关，泡沫细 胞中 CD147 的 mRNA 与 oxLDL 的作用浓度及时间无关. 【关键词】 CD147；血管内皮生长因子类；泡沫细胞；动 脉硬化 0 引言 泡沫细胞（foamcells）是动脉粥样硬化斑块内出现的特 征性病理细胞，其主要来源有两个，一是血液单核细胞， 二是血管中膜平滑肌细胞.一般认为在动脉粥样硬化形成的 早期，血液中单核细胞进入内皮下间隙，在内膜下被氧化 型低密度脂蛋白、炎性介质等激活后分化为巨噬细胞，后 者通过其表面的清道夫受体吞噬 oxLDL 形成泡沫细胞， 并逐渐演变成脂纹及粥样斑块1.动脉粥样硬化不仅是 脂代谢紊乱的过程，也是炎症反应的过程.因此，泡沫细胞 是粥样斑块中重要的炎症细胞2.长期的慢性炎症性疾 病可导致机体内免疫分子、炎症因子等炎性介质水平明显 升高3.不但可调节机体免疫反应，而且能够作用于外 周组织导致一系列致动脉粥样硬化代谢功能改变4.研 究表明,在泡沫细胞形成过程中 CD147 分子及 VEGF 的表达 上调.此外，新近在动脉粥样硬化斑块中也检测到 CD147 分 子及血管内皮生长因子（VEGF）等炎症介质,提示其可能参 与了动脉粥样硬化的发生5-6.鉴于 CD147 分子及 VEGF 在炎性斑块中的作用，且目前鲜有对其在泡沫细胞形成过 程中表达变化的研究，我们建立人类单核细胞（U937）源 性泡沫细胞模型7 ，进一步探讨 CD147，VEGF 等炎性介 质在动脉粥样硬化发生中的作用. 1 材料和方法 材料低密度脂蛋白（LDL）及 VEGF 的 ELISA 检测试剂盒 （CHENICON，US） ；硫代巴比妥酸（TBA） （南京建成生物工 程研究所） ；FITC 标记小鼠抗人 CD147（RD，US）. FACSCalibur 流式细胞仪. 方法 LDL 的制备将 LDL 置于含 10mol/LCuSO4 的磷酸缓冲 液（PBS）中,37透析 12h 后,在 1g/LEDTA 的 PBS 中透析 24h,m 微孔滤膜过滤除菌备用.用硫代巴比妥酸物质的含 量鉴定 oxLDL,氧化后每毫克胆固醇中丙二醛含量为 mol/g. 细胞株及泡沫细胞模型的建立 U937 细胞株系人类单核细 胞系,由中国科学院上海细胞生物研究所提供，在含 100ml/L 胎牛血清的 RPMI1640 培养基中悬浮生长,置于 50mL/LCO2 培养箱中培养.将细胞稀释至 51012/L，种于 24 孔板中每孔 1mL，分别与不同浓度 oxLDL（0,25,50,100,200mg/L）共孵育 24h.将相同密度 的 U937 细胞与 oxLDL 共孵育不同时间 （0,3,6,12,24,48h）.U937 泡沫细胞形态通过新配制的 3ml/L 油红 O 染色鉴定，胞质内出现红染颗粒的为脂质染色 阳性. 细胞膜表面 CD147 流式检测将孵育后细胞悬液，经 PBS 洗涤 2 次后调整细胞密度为 1109/L.取 100L 细胞悬液 加 FITC 标记的小鼠抗人 CD147mAbL，充分震荡混匀后室 温避光静置 20min.经 PBS 洗涤后,再加入 300L 的 PBS.通 过 FACSCalibur 流式细胞仪检测，使用 CellQuest（BectonDickinson）软件分析. 检测 VEGF 分泌含量按照试剂盒操作步骤,以 RPMI1640 培 养基作为空白,将不同浓度的 VEGF 标准品在酶标仪（美国 BIOIAD 公司出品）中检测并绘制 VEGF 标准曲线.将各组细 胞离心，上清进行 ELISA 检测,通过标准曲线查得相应 VEGF 含量. 及 VEGFmRNA 水平检测 Trizol 提取总 RNA，以 2LRNA 作 为模板进行逆转录，PCR 扩增，以 GAPDH 作为内参照.VEGF 引物序列：上游 5CTGCTGTCTTGGGTGCATTG3，下游 5GGCCTTGGTGAGGTTTGATCCG3，扩增产物为 334bp;GAPDH 引物序列上游 5TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3，下游 5AGATCCACAACGGATACTT3，扩增产物为 360bP.PCR 反应条件：94变性 30s，55退火 30s，72延伸 30s， 持续 25 个循环.CD147 引物序列:上游 5ACATCAACGAGGGGGAGACG3,下游 5GGCTTCAGACAGGCAGGACA3，扩增产物为 480bp.PCR 反应条件：94变性 30s，57退火 30s，72延伸 90s， 持续 25 个循环. 统计学处理：采用统计软件包进行数据分析，计量数据 用 xs 表示.组间均属比较用方差分析及 Dunnettt 两两 比较检验，P有统计学意义. 2 结果 泡沫细胞的鉴定光镜下对照组细胞（U937）内无红染颗 粒，而处理组细胞体积增大，细胞质内可见较多的红染颗 粒，提示细胞内脂质成分增加. 分子在 U937 泡沫细胞膜表面表达的变化流式细胞术显示,与 对照组（U937 细胞）相比，U937 泡沫细胞膜表面 CD147 表 达的平均荧光强度升高.浓度作用曲线显示，当 oxLDL 作 用浓度为 25mg/L 时，U937 泡沫细胞膜表面 CD147 表达强度 出现最高峰,较对照组升高约倍（P，n=3）,之后其表达强 度逐渐下降（图 2）.时间曲线表明 U937 细胞与 oxLDL80mg/L 作用 6h 后膜表面 CD147 表达强度出现最高 峰，较对照组升高约倍（P,n=3） ，之后其表达强度逐渐下 降. 泡沫细胞中 VEGF 的表达 ELISA 检测显示，细胞培养上清 中 VEGF 的蛋白分泌含量与 oxLDL 作用浓度成正比.浓度 曲线表明 U937 细胞在与 200mg/LoxLDL 作用后，VEGF 分 泌水平达峰顶，较对照组升高约倍（aP，bP,n=3，图 4）.时 间曲线显示，U937 细胞与 oxLDL100mg/L 作用 48h 后 VEGF 分泌水平达峰顶，较对照组升高约倍 （aP，bP,n=3，图 5）. 及 VEGFmRNA 的表达水平 RTPCR 结果显示，当 U937 细 胞与 25mg/LoxLDL 的作用后 CD147mRNA 表达水平最高， 之后其水平保持不变.当 oxLDL 的作用浓度为 200mg/L 时 VEGFmRNA 表达水平最高（图 6）.U937 细胞与 oxLDL100mg/L 作用 6h 后 CD147mRNA 表达最高，之后其水 平保持不变.作用 48h 后 VEGFmRNA 表达最高（图 7）. 3 讨论 动脉粥样硬化是一个以修饰的脂质、单核细胞及富含胆 固醇酯的泡沫细胞聚集为特征的复杂的病理过程，目前认 为动脉粥样硬化也是一个慢性炎症反应过程8.在粥样 斑块中，泡沫细胞不仅是一种清道夫细胞，也是一种炎症 调节细胞.CD147 及 VEGF 蛋白及 mRNA 水平在泡沫细胞中的 上调,提示在在粥样斑块中，CD147 及 VEGF 可能参与了泡沫 细胞形成的炎症反应过程9. CD147 是一种新发现的细 胞表面黏附分子,又称为细胞外基质金属蛋白酶诱导因子, 可以刺激成纤维细胞的几种 MMP 的合成，参与基质的降解 10.Young9等通过免疫组化在人动脉内膜粥样硬化 斑块富含巨噬细胞的区域中检测到 CD147 分子.在人心衰模 型中，CD147 与 a31 整合素形成复合体，通过外部信号及 上调局部 MT1，MMP 的表达诱导 MMP 的产生从而降解基质， 引发斑块的破裂促进心衰的发生.这些研究提示，CD147 分