生物化学4抗体制药ppt课件

第四章 抗体制药 4.1 概述 4.2 单克隆抗体 4.3 基因工程抗体 4.4 多功能抗体 4.5 抗体库技术 4.6 抗体诊断试剂 4.7 抗体治疗药物 4.1 概述 抗体（antibody）： 能与相应抗原特异性结合的免疫球蛋白（immunoglobulin ，Ig）。 抗体通过以下途径中和和除去有害物质： n直接使抗原失去活性 n促使免疫效应细胞将其吞噬并加以破坏 n使抗原表面弱化而易于受补体破坏 结晶片段 Fragment crystallizable IgM, IgG, IgA, IgD, IgE 抗原结合片段 fragment of antigen binding 110aa 抗体研究的3个阶段： 1、多克隆抗体 n含针对多个不同抗原决定簇的 不同抗体 n不同淋巴细胞产生、针对同一 抗原区存在多种抗体 中和外源性毒素（蛇毒、白喉毒 素） 非特异性交叉反应不能应用肿 瘤和其他疾病治疗。 2、单克隆抗体（ monoclonal antibody ，McAb） n仅识别单一抗原决定簇 n由同一细胞产生 高度特异性、均一性、来源稳定可大 量生产。 McAb（ monoclonal antibody ）在临床 上主要用于诊断和治疗： n疾病的诊断 检测某疾病相关的抗原（ELISA） n治疗 抑制器官移植排斥（抗分化抗原CD3 单抗） 作为药物载体对肿瘤进行定向治疗 McAb 在免疫导向疗法中存在的问题（障碍）： A、鼠源性，产生人抗鼠抗体（HAMA，human antimouse antibody），排斥反应，半衰期短，难维 持有效药物作用靶组织时间； B、相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达 不到有效的治疗浓度。 需要解决的问题 A、降低McAb的免疫源性 B、降低McAb的相对分子质量 3、基因工程抗体 人源化抗体（嵌合抗体，chimeric antibody；改形抗 体，reshaping antibody；等） 基因工程抗体片断（单链抗体，scFv，single chain antibody；单域抗体VH或VL等） 抗体片断只保留了与抗原特异结合的能力，Fc片断 所具有的补体激活、免疫调理等各种生物功能丧失。 4.2 单克隆抗体 McAb是将抗体产生细胞与具有无限 增殖能力的骨髓瘤细胞融合，通过有限稀 释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单 克隆细胞系而产生的抗体。 培养上清中培养上清中X X抗体的检测抗体的检测 克隆化培养克隆化培养 单克隆杂交瘤细胞培养上清中单克隆杂交瘤细胞培养上清中X X抗体的检测抗体的检测 杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体杂交瘤细胞可持续分泌单克隆抗体 规模化培养规模化培养 获得大量单克隆抗体获得大量单克隆抗体 动物免疫动物免疫 细胞融合细胞融合 混合细胞的混合细胞的HATHAT筛选筛选) ) 分泌分泌X X抗体抗体 B B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞 X X抗原抗原 B B淋巴细胞淋巴细胞 瘤的突变株瘤的突变株 培养数天后细胞死亡培养数天后细胞死亡 无限生长细胞无限生长细胞 分泌分泌 X X抗体抗体 只有杂交瘤细胞可长期存活下来只有杂交瘤细胞可长期存活下来 BALB/cBALB/c 杂交瘤技术操作流程图解杂交瘤技术操作流程图解 一、抗原与动物免疫 抗原： 种类上无限制（纯化分子、病毒、细菌、细胞等） 纯度无绝对要求（尽可能高纯度抗原） 动物： 骨髓瘤细胞系同品系动物（BALB/c小鼠和Lou大鼠 ） 免疫方法： 体内免疫 皮下、肌肉及腹腔免疫 颗粒性抗原（无需佐剂） 可溶性抗原（加佐剂） 脾内免疫 手术暴露脾脏，直接注入 来源有限、昂贵抗原 免疫效果差 体外免疫 从脾脏或外周血中分离淋巴细胞，加入抗原共培养45天。 二、 细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养 骨髓瘤细胞： 自身不合成或不分泌任何免疫球蛋白分子或片断。 HGPRT-（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶） 融合过程： 取脾细胞（1*108）与骨髓瘤细胞（2*1073*107） 进行混合，在PEG作用下诱导它们融合，时间控制在 2min以内，然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释 。 HAT选择性培养基培养 动物细胞核苷酸合成两条途径： 全合成途径、补救合成途径 氨基喋呤（Aminopterine，A）为四氢叶酸的结构类似物，能够和 二氢叶酸还原酶（能够将二氢叶酸还原生成四氢叶酸）发生不可逆结 合，阻止了四氢叶酸（核苷酸生物合成的甲基供体）的生成。从而阻 断了阻断GMP、TMP的生物合成。 GMP、TMP的补救合成途径： GMP可以在HGPRT（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）的作用下 由次黄嘌呤（hypoxanthine，H）合成。 TMP可以在TK(胸苷激酶)的作用下，由胸腺嘧啶（thymine, T）合 成。 A:氨基喋呤 H:次黄嘌呤 T:胸腺嘧啶 抗原免疫小鼠 HGPRT- 骨 髓瘤细胞 PEG 脾B细胞 HAT培养基选 择培养 B-瘤（2周 ） B、B-B、瘤、瘤-瘤、B-瘤 瘤细胞无补救途径，同时全合 成途径被A阻断，不能存活； B细胞具有补救途径但不能长 期存活； B-瘤细胞具有补救途径又可长 期存活 三、筛选阳性克隆与克隆化 检测方法：免疫酶技术 （ELISA常用）、免 疫荧光技术、放射免 疫技术 克隆化 克隆化方法：有限稀释法和软琼 脂法。 有限稀释法：杂交瘤细胞悬液 稀释后，加入到96孔板，使每 孔中在理论上只含有一个细胞 。 软琼脂法：在培养液中加入 0.5%的琼脂糖凝胶，细胞分裂 后形成小球样团块，培养基为 半固体状态，可用吸管吸出， 移入96孔板培养。 加入饲养细胞 杂交瘤细胞染色体不稳定，易 丢失，反复克隆化，34次， 至各孔100%抗体阳性 四、 杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 1、染色体分析 正常鼠的脾细胞染色体数：40，全部为端着丝粒。 小鼠骨髓瘤细胞染色体：SP2/0细胞为6268，NS-1为 5464，大多数为非整倍性，有中部和亚中部着丝点。 杂交瘤细胞的染色体数目： 接近两亲本细胞染色体数目的总和，在结构上多数为 端着丝粒染色体外，还应出现少数标志染色体。 染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价的抗 体；反之，则反 2、分泌抗体稳定性分析 连续传代，检测上清中抗体浓度； 一般需3个月。 3、Ig类别及亚类鉴别 羊或兔抗Ig不同类或亚类的抗体 免疫扩散或ELISA。 4、亲和力测试 高亲和力：体内应用或检测试剂 低亲和力：亲和层析 5、抗原识别位点等其他测试 Ig 抗IgG1 抗体 抗IgG2 抗体 抗IgA 抗体 抗IgD 抗体 抗IgE 抗体 五、单克隆抗体的大量制备 1、 动物体内诱生法 520mg/ml抗体 基本程序： 接种前12周，同品系鼠腹腔注射0.5ml 降植烷或液体 石蜡，然后注射1*106杂交瘤细胞，712d便有腹水生成 后注射器抽取，离心去细胞沉淀即得单抗腹水，每只小 鼠可得35ml。 优点：操作简便，比较经济，抗体浓度高，多用 于研究和诊断等一般用途，为一般用途单抗制备 首选。 缺点：混有来自小鼠的非特异性抗体，给纯化 带来难度。 2、体外培养法 悬浮培养、微载体培养等动物细胞大规模培养方式 抗体浓度比动物体内诱生发低 用于防病治病单抗的工业化生产 最好采用无血清培养 六、单克隆抗体的纯化 根据Ig的类和亚类以及用途选择不同的纯化方法： 体外诊断试剂IgG类-沉淀处理+亲和层析 IgM类-沉淀处理+凝胶过滤 体内诊断试剂或治疗用药-亲和层析+阴离子交换层析 六、单克隆抗体的纯化 动物体内诱生法制备的McAb纯化的一般程序： （1）澄清和沉淀处理： 1.11.9%正辛酸等电点沉淀白蛋白（血清中主要杂蛋白), 再硫酸铵沉淀。 小鼠腹水 90%以上的单克隆抗体 离心力为1000g 离心5min 离心力20000g 高速离心30min 0.2um微孔过滤膜 50%饱和硫酸铵沉淀 （2）分离 凝胶过滤 用于IgG和IgM类。 Sephadex G 200 3个峰，分子量最高峰为IgM，另外两个峰为 IgG。 抗体回收率5080%，纯度可达95%以上。 阴离子交换层析 适用于IgG类的分离纯化。 亲和层析 适用于IgG类 蛋白A（protein A, 金黄色葡萄球菌） 蛋白G （protein G，G群链球菌） IgG的 Fc片断 蛋白A、蛋白G与不同属来源的抗体结合强度不同 pH8.0 结合在亲和柱 降低pH至2.53之间进行洗脱 细胞培养液中单抗的浓缩： 离心或过滤 亲和层析 IgG 超滤 4.3 基因工程抗体 互补性决定区 (CDR， complementar ity determinant region) 骨架区（FR, frame region） Vk1 一、嵌合抗体（chimeric antibody） 将鼠源单克隆抗体 可变区和人抗体恒定区 连接起来的抗体。 免疫原性大幅度降低。 保留抗原结合特异性。 构建过程： 提取杂交瘤细胞 mRNA 反转录成 cDNA RT-PCR分别扩增 VL、VH 基因 表达载体共转 染骨髓瘤细胞 分别与人的轻链、 重链恒定区基因相连 人-鼠嵌合 抗体 1516aa 二、改形抗体（reshaping antibody） 抗原结合区域： H和L链 V区中的互补性决定区 (CDR，complementarity determinant region) 将鼠源性单克隆抗体的CDR以外序列替换人 Ig分子中的序列， 可基本消除免疫原性。 改型抗体也称CDR移植抗体 (CDR grafting antibody)。 1516aa 构建过程： 分别RT-PCR克 隆杂交瘤细胞H 、L链可变区基因 并测序 设计改形抗 体可变区基 因 化学合成可变区基 因 表达载体共转 染骨髓瘤细胞 分别与人的轻链、 重链恒定区基因相连 改形抗体 1516aa 问题： 抗体亲和力下降 原因： 骨架区（FR, frame region）影响CDR的空间结构。 提高亲和力： 从已知人可变区数据库中选择骨架区与鼠抗骨架区同源 性最高的序列 骨架区内可能影响抗原结合的氨基酸残基替换为鼠抗残 基：立体结构数据、结构预测、分子设计推测 合适保留CDR两侧骨架区序列 大都涉及VL、VH相互作用以及与CDR接触 选择性保留可变区N末端的数个氨基酸残基 N末端与CDR表面相距很近，可能参与抗原结合 三、镶面抗体（resurfacing antibody） 抗体可变区表面暴露的氨基酸残基位置和数量非常保 守，不因种属和型别改变。 为免疫原性主要来源 将鼠抗可变区表面暴露的骨架区氨基酸残基改为相应 的人源残基，使可变区表面人源化。 消除异源性，保持单抗特异性和亲和力。 四、小分子抗体 1.Fab片断（fragment of antigen binding） 完整轻链和重链Fd段（单价） 完整抗体的1/3 木瓜蛋白酶水解抗体 重组方式生产 抗原特异性、制作简单 2.Fv与单链抗体（single chain Fv，ScFv ） （1）Fv （可变区片断） VL、VH非共价键结合（单价） 完整抗体的1/6 基因工程重组生产 易解离 （2）ScFv 常用连接肽：(Gly4Ser)3 优点： 分子量小（1/6），免疫原性低 容易进入瘤体组织 无Fc，免疫诊断成像清晰，本底低 单链容易改造 可采用大肠杆菌大量生产 缺点： 单价，亲和力下降 半衰期短，体内清除过快 功能单一，仅能与一种抗原结合 可形成scFv二聚体和多聚体 3. 单域抗体 VH或VL 仍保留了抗原结合活性 亲和力低 4. 分子识别单位（MRU，molecular recognition unit） 单个 CDR区 亲和力相当低 4.4 多功能抗体 一、双功能抗体(bispecific antibody,BsAb) 具有两种抗原结合特性 主要指双特异性单链抗体( bispecific single-chain Fvs, BsFvs) 构建双特异性单链抗体的方式： 末端半胱氨酸残基共价交联 大肠杆菌表达 链间连接肽相连 微型抗体 利用专门的二聚化结构域将两scFv连接成异二聚体 亮氨酸拉链（a螺旋每两圈7个氨基酸出现一个亮氨酸，位于同一侧） 转录因子Fos和Jun蛋白中含亮氨酸拉链，形成稳定Fos-Jun二聚体 其他二聚体结构：螺旋-转角-螺旋等 双体形式 短连接肽（312aa）: 同一scFv分子内VH和VL内不能 配对，只能和另一分子VH和VL配对，形成双体分子。 双特异性抗体的应用： 在免疫诊断中应用 两 抗原结合位点分别设计为针对靶抗原和酶分子 可取代酶标抗体 优点： 不需要标记抗体，避免化学交联抗体和酶对蛋白的损伤，生物活 性高，可大量制备，应用方便。 例（肝癌等癌症诊断）： 抗辣根过氧化物酶(HRP)-抗甲胎蛋白（AFP）双特异性抗体 ELISA 检测AFP最低浓度5ng/mL 在肿瘤放射免疫显像中应用 一端针对肿瘤细胞表面的抗原 一端能与带放射性核素的半抗原结合 二次导向： 先注入双特异性抗体定位肿瘤，一定时间后游离抗体被清除 注入放射性核素的半抗原，定位于肿瘤细胞 与常规放射免疫显像比，可提高清晰度和灵敏度 双特异性抗体介导的药物杀伤效应 常规肿瘤导向： 单抗与化疗药物、毒素或放射性核素偶联 导致抗体或偶联药物失活 双特异性抗体 很好避免这点 双特异性抗体介导的细胞杀伤效应 一端针对肿瘤细胞表面的抗原 一端针对免疫活性细胞表面的效应分子，活化该细胞 二、多功能抗体 将scFv链内连接肽从12aa 减少0aa，可形成二聚体、三 聚体、四聚体等。 分子量比scFv大，克服scFv清 除速度过快的缺点 多价，亲和力增强 成功报道的不多 三、抗体融合蛋白 将目的蛋白基因与抗体或抗体部分片断基因相连表达出来的重组蛋 白。 目的蛋白： 细胞因子、受体、酶、配体等。 目的蛋白与抗体或抗体可变区片断（ scFv 、 Fab等）融合 利用抗体的特异性结合，将生物活性靶向至特定部位 重组免疫毒素：蛋白毒素（蓖麻毒素、白喉毒素等)-抗体片断 抗体-细胞因子 酶-抗体 ：抗体靶向的酶前体药物治疗（antibody directed enzyme prodrug therapy，ADEPT） 抗体、酶、前体药物 前体药物 药物 目的蛋白与抗体恒定区片断 （Fc）融合 Fc片断作用： 增加蛋白的半衰期 可利用protein A进行亲和层析 Fc具有补体激活、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用等生物活性 CD4-Ig：CD4-Fcr HIV病毒表面糖结合 CTLA4-Ig: CTLA4的胞外区- Fcr (细胞毒T淋巴细胞抗原4) CTLA4-Ig: CTLA4(细胞毒T淋巴细胞抗原4)的胞外区- Fcr 抑制器官移植的免疫排斥反应 与B7分子结合, 阻断T细胞活化的第二信号 Fc 有利于Protein A纯化，CTLA4 为免疫球蛋白超家族成员,胞 外段与Ig Fc段结合后能较好维持分子完整性和空间结。 T淋巴细胞 CD28 CTLA-4 B7 CTLA4-Ig 4.5 抗体库技术 早期用于构建基因工程抗体的抗体基因来源于 杂交瘤细胞，杂交瘤细胞为鼠源且要经过动物免疫、 细胞融合、筛选复杂过程，获得的抗体基因还需进行 改造。 20世纪90年代，产生抗体库技术。 两大突破： PCR出现和发展，使得一套引物可扩增全套免疫球 蛋白可变区基因 利用大肠杆菌成功表达出具有抗原结合功能的抗体分 子片断 抗体库（antibody library）技术： 克隆全套抗体重链和轻链可变区基因，重组到特 定原核表达载体中，转化大肠杆菌表达有功能的抗体 分子片断，通过亲和筛选得到特异性抗体可变区基因 的技术。 经历了组合抗体库、噬菌体抗体库、核糖体展示 抗体库3个阶段。 噬菌体抗体库发展最成熟、应用最广泛。 噬菌体抗体库技术是在噬菌体展 示（phage display）基础建立的。 丝状噬菌体（M13、fd、f1） P3、P8 N端融合 P3展示系统（展示数百氨基酸， 适合筛选高亲和力配体） P8展示系统 外源基因插入在特殊的质粒，即噬 菌粒上，噬菌粒含质粒和噬菌体的复制 起始点，但需要辅助噬菌体提供产生单 链所必需的蛋白。 噬菌体的繁殖需要野生型P3、P8蛋 白，也由辅助噬菌体提供，野生型的P3( 或P8蛋白)和P3融合蛋白(或P8融合蛋白) 共同组装到噬菌体颗粒的表面。 噬菌体颗粒中单链DNA主要来自于 带外源基因的噬菌粒。 外源基因 噬菌体复制子 质粒复制子 有缺陷的噬菌体复制子 P3、P8、P5 等蛋白 辅助噬菌体 P3外源蛋白 融合蛋白 噬菌体抗体库的构建： 扩增全套抗体可变区基因 从人外周血获取B细胞，提取B细胞mRNA，RT- PCR扩增全套抗体可变区基因 构建合适的噬菌体表面展示载体 Fab抗体库展示载体 scFv抗体库展示载体 转化大肠杆菌 Fab抗体库展示载体pComb3 周质腔表达 P3 scFv抗体库展示载体pHEN2 周质腔表达 琥珀型终止密码子TAG 琥珀突变 （supE，编码琥珀突变 型tRNA)抑制菌株 谷氨酸 噬菌体抗体库的筛选：9天可完成3次筛选 对目的克隆进行表达和检测 噬菌体抗体库技术的特点： 能包含B细胞全部克隆，库容量大，可筛选到各种抗体 避开了人工免疫和杂交瘤技术，直接获得抗体基因 可获得高亲和力的人源化抗体 筛选得到的抗体更易于在大肠杆菌中表达 噬菌体抗体库为抗体工程发展的一个里程碑。 成功筛选出大量抗体，有些已经进入临床实验阶段 噬菌体抗体库还可用于抗体分子定向进化的筛选 新型抗体库技术： 选择性感染噬菌体展示抗体库技术 核糖体展示抗体库技术 4.6 抗体诊断试剂 抗体诊断药物基本分为三类： n血清学鉴定用的抗体试剂 n免疫标记技术用的抗体试剂 n体内导向诊断药物 一、血清学鉴定用的抗体试剂 血清学鉴定： 用已知抗体来鉴定未知的抗原型，主要用于疾病的病 原菌诊断和血型鉴定。 基本原理： 抗体与抗原之间的凝集反应 （1）鉴定病原菌用的抗体试剂 诊断血清 162种 （2）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向被动血凝诊断试 剂 灵敏度与酶免疫测定法相同，操作简便快速。 （3）妊娠诊断试剂 检测血液和尿液中的绒毛膜促性腺激素HCG。 （4）抗ABO血型系统血清 红细胞表面存在A或B凝集原，鉴定血型 二、免疫标记技术用的抗体类试剂 n荧光抗体诊断试剂 n酶免疫测定用抗体诊断试剂 n放射免疫用抗体诊断试剂 （1）荧光抗体诊断试剂 荧光抗体: 荧光色素, 如异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明 （RB200）、藻红素（PE）等标记抗体蛋白而成。 主要用于组织内或细胞内抗原物质的定位测定： 用荧光抗体浸染含有抗原物质的组织切片或细胞， 荧光抗体与抗原结合，在荧光显微镜下成为发光的可视 物，达到诊断和定位目的。 直接法: 荧光抗体直接与抗原反应，抗原鉴定、定位和分布。 需要制备所需检测抗原的相应抗体。 荧光CD单克隆抗体： 白细胞分化抗原（表面标志）： CD（分化群，cluster of differentiation），按发现先后编号（1247） 相应的CD抗原的荧光标记单克隆抗体用于细胞的鉴定、分离。 间接法 标记抗免疫球蛋白抗体（二抗、抗抗体） 标记一种抗体，可检测多种抗原抗体系统，灵敏度比直接法高 510倍。 根据一抗不同，二抗 种类不同：羊抗兔抗体、羊抗人抗体等。 （2）酶免疫测定用抗体诊断试剂 用酶标记抗体来检测抗原或抗体，酶的显色反应。 常用酶：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)等。 标记抗体：一抗或二抗 分类：免疫酶染色（组化法）和酶免疫测定 免疫酶染色（组化法） 用于组织内抗原物质的定位测定。 酶标（辣根过氧化物酶，HRP ）抗体与抗原发生特异 性结合， HRP催化底物二氨基联苯胺（DAB）生成棕褐 色沉淀物,标本的抗原部位显色，光学显微镜下观察。 酶免疫测定（定量测定溶液中抗原 或抗体浓度） 抗原抗体结合后，分离结合物， 利用所标记酶将底物转化为有色产 物，使用分光光度进行测定。 ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay, 酶联免疫吸 附试验）： 抗原或抗体吸附于聚苯乙烯塑料表面，抗原抗体在塑料 表面进行, 非结合抗原或抗体容易洗去，简化抗原抗体结合 物的分离。 ELISA灵敏度ng/ml 基本方法：夹心法、间接法、竞争法。 间接法（测抗体） 夹心法（测多价抗原） 竞争法(可测单价抗原) 生物素-亲和素放大ELISA (biotin-avidin system-ELISA，BAS-ELISA) 生物素（维生素H） 亲和素（avidin，碱性糖蛋白，鸡蛋清提取） 链菌亲和素（streptavidin，链霉菌培养液提纯） 亲和力: biotin-avidin 比抗原-抗体高1万倍 采用生物素化抗体 替代酶标抗体 一个抗体可结合90 个生物素 一个亲和素结合4个 生物素 生物素或亲和素与 酶偶联 灵敏度 pg/ml HBsAg(乙型肝炎表面抗原)酶标诊断试剂 HBeAg(乙型肝炎e抗原)酶标诊断试剂 HAVAg(甲型肝炎病毒抗原)酶标诊断试剂 测定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶标诊断试剂 AFP（甲胎蛋白）酶标诊断试剂 CEA（癌胚抗原）酶标诊断试剂 （3）放射免疫用抗体诊断试剂 抗体或抗原采用同位素标记，通过测定放射量测 定浓度。 常用125I 测定方法与ELISA相同（夹心法、间接法、竞争 法），检测方法不同 灵敏度高pg/mlng/ml 放射性对人有害，需防护措施 标记物半衰期短 检测仪器昂贵 三、导向诊断药物 肿瘤放射免疫显像 抗肿瘤单抗（Ab）与 二乙基三胺五乙酸（DTPA）偶联成 Ab-DTPA Ab-DTPA注入体内与肿瘤结合（3d） 注入In-113 (铟) ，与DTPA络合显像（2h） 4.7 抗体治疗药物 一、抗体 封闭类抗体 与抗原结合，封闭抗原生物活性，阻断其与其他蛋 白或配基作用。 如： 封闭各种细胞因子，破坏信号传导通路 效应杀伤类抗体 与抗原结合后，通过Fc片断