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亚型猪流感病毒基因的克隆与序列分析 亚型猪流感病毒基因的克隆与序列分析是小柯论文网通过网络搜集,并由本站工作人员整理后发布的,亚型猪流感病毒基因的克隆与序列分析是篇质量较高的学术论文,供本站访问者学习和学术交流参考之用,不可用于其他商业目的,亚型猪流感病毒基因的克隆与序列分析的论文版权归原作者所有,因网络整理,有些文章作者不详,敬请谅解,如需转摘,请注明出处小柯论文网,如果此论文无法满足您的论文要求,您可以申请本站帮您代写论文,以下是正文。 摘要 从鸡胚尿囊液中提取h1n2亚型猪流感病毒的rna,设计一对特异性引物,采用反转录-聚合酶链反应成功地扩增了ns1基因。将ns1基因的cdna克隆后进行了序列测定,所扩增的片段包含了完整的ns1基因的开放阅读框,并将该毒株与参考毒株进行了核苷酸及氨基酸序列同源性比较分析。关键词 ns1基因;克隆;序列分析中图分类号 q781文献标识码a文章编号 1007-5739(2008)22-0217-02猪流感病毒是正粘病毒科a型流感病毒属中的成员,其基因组由8个rna节段组成,其中ns基因是最短的,它含有2个读码框,可编码ns1和ns2 2种蛋白质。非结构蛋白ns1的基因序列高度保守,具有抗原性1,在siv检测中具有广阔的应用前景。本试验对该h1n2亚型猪流感病毒ns1基因进行克隆和序列分析,以期为后续研究提供参考。1材料与方法1.1试验材料trizol,载体pmd18-t、top10感受态细胞、rt-pcr试剂盒,agarose gel dna回收试剂盒、质粒小提试剂盒,限制性核酸内切酶和ecor、xho,t4 dna连接酶。猪流感毒株:a/swine/guangdong/1999(h1n2)。1.2引物设计与合成使用oligo 5.0引物设计软件,参考已发表序列,设计如下一对引物:上游引物:5-atggattccaacactgtg c-3;下游引物:5-ggc tgcatgaatgttatt-3。1.3病毒rna的提取取250l鸡胚培养尿囊毒液,参照文献2相关方法,提取总rna。将rna溶于无rnase水中,置-70备用。1.4目的基因的扩增1.4.1病毒rna反转录。在1l rna溶液中依次加入:mgcl2 4l,10rna pcr buffer 2l,rnase free dh2o 8.5 l,2.5mol/l dntp mixture 2l,rnase inhibitor 0.5l,反转录通用引物uni12(5-agcaaaagcagg-3)1l,amv reverse transcriptase 1l,共20l,轻轻混匀,放入pcr仪中,30 8min、50 30min、99 5min、5 5min,所得产物即为cdna。1.4.2pcr扩增。取5l cdna作为模版,依次加入mgcl2 6l,10pcr buffer 10l,d2h2o 76l,taq酶1l,上、下游引物各1l,共100l,轻轻混匀。置pcr仪中,94预变性2min、94变性30s、52退火30s、72延伸3min,进行35个循环,72延伸10s。取5l进行琼脂糖凝胶电泳。1.5克隆和序列测定按pmd18-t载体试剂盒说明书进行dna与载体质粒的连接,连接产物按常规方法转化top10感受态细胞。挑取白色可能的阳性菌落,提取质粒,进行pcr扩增和ecor、xho酶切鉴定。初步鉴定阳性克隆送生物公司测序。1.6序列比较分析用dnastar软件进行序列比较分析。参考毒株包括genebank中已公布序列a/swine/zhejiang/1/2004(h1n2)、a/swine/pingtung/7-12/1999(h1n2)、a/swine/hongkong/126/1982(h3n2)及试验对比毒株a/swine/guangdong/1999(h3n2)。2结果与分析2.1rt-pcr扩增出的dna片段约780bp(图1)。2.2阳性克隆的初步鉴定挑选的克隆提取质粒pcr、酶切鉴定与预测的结果一致,初步认为获得了ns1基因的阳性克隆(图2、图3)。2.3目的基因的核苷酸序列分析经序列测定,测得插入重组质粒中的外源dna片段包含了完整的ns1基因的开放阅读框(660bp)和上下游引物序列、蛋白质合成的起始密码子和终止密码子,表明已成功地克隆到了ns1的全长基因。2.4目的基因与参考毒株的核苷酸及氨基酸同源性比较经序列比较分析,猪流感毒株guangdong/1999(h1n2)与参考毒株hs1基因核苷酸及氨基酸同源性如表1所示。可以看出,试验毒株与参考毒株zhejiang/2004(n1n2)ns1基因同源性最高,核苷酸、氨基酸同源性分别达到96.6%、96.0%。3小结与讨论(1)由于流感病毒基因的分段性,每个基因组外部非编码区序列非常有限,加上整个基因组(特别是非编码区)的gc含量较低,这给引物设计带来较大困难3,4。本试验在ns1基因5端和3端的保守区设计了一对相对理想的引物进行扩增,这可能给以后的试验带来一定困难,如退火温度低、pcr产量低等5,但其优点是可顺利扩增出特异性良好的目的片段。(2)本试验毒株ns1基因开放阅读框全长660bp,编码219个氨基酸。该毒株与参考毒株ns1基因的序列比较显示,核苷酸同源性在92.5%96.6%之间,氨基酸同源性在92.2%96.0%之间,试验毒株与参考毒株都属于等位基因群a群1,试验毒株与参考毒株zhejiang/2004(h1n2)基因同源性最高,进化关系较为密切。非结构蛋白ns1进化稳定,具有较高的保守性,可用ns1蛋白作为抗原建立猪流感的elisa诊断试剂盒。4参考文献1 殷震.动物病毒学m.北京:中国农业大学出版社,1996.2 金冬雁,黎孟枫.分子克隆试验指南(第2版)m.北京:科技出版社,1993.3 huddlastetalj a.nucletcacids researchj.vet res,1982,10(3):1029-1038.4 傅生芳,常惠云,独军政,等.h9n2亚型禽流感病毒m基因的克隆及序列分析j.甘肃农业大学学报,2005,40(5):579-582.5 astrid v,guillaume s.comparision of three nonnested rt-pcr for the detection of influenza virusj.j clin virol,2000,17(3):167-175.其他参考文献baker, sheridan. the practical stylist. 6th ed. new york: harper & row, 1985.flesch, rudolf. the art of plain talk. new york: harper & brothers, 1946.gowers, ernest. the complete plain words. london: penguin books, 1987.snell-hornby, mary. translation studies: an integrated approach. amsterdam: john benjamins, 1987.hu, zhuanglin. 胡壮麟, 语言学教程 m. 北京: 北京大学出版社, 2006.jespersen, otto. the philosophy of grammar. london: routledge, 1951.leech, geoffrey, and jan svartvik. a communicative grammar of english. london: longman, 1974.li, qingxue, and peng jianwu. 李庆学、彭建武, 英汉翻译理论与技巧 m. 北京: 北京航空航天大学出版社, 2009.lian, shuneng. 连淑能, 英汉对比研究 m. 北京: 高等教育出版社, 1993.ma, huijuan, and miao ju. 马会娟、苗菊, 当代西方翻译理论选读 m. 北京: 外语教学与研究出版社, 2009.newmark, peter. approaches to translation. london: pergmon p, 1981.quirk, randolph, et al. a grammar of contemporary english. london: longman, 1973.wang, li. 王力, 中国语法理论 m. 济南: 山东教育出版社, 1984.xu, jianping. 许建平, 英汉互译实践与技巧 m. 北京: 清华大学出版社, 2003.yan, qigang. 严启刚, 英语翻译教程

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