全文预览已结束
下载本文档
版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领
文档简介
亚型猪流感病毒基因的克隆与序列分析 亚型猪流感病毒基因的克隆与序列分析是小柯论文网通过网络搜集,并由本站工作人员整理后发布的,亚型猪流感病毒基因的克隆与序列分析是篇质量较高的学术论文,供本站访问者学习和学术交流参考之用,不可用于其他商业目的,亚型猪流感病毒基因的克隆与序列分析的论文版权归原作者所有,因网络整理,有些文章作者不详,敬请谅解,如需转摘,请注明出处小柯论文网,如果此论文无法满足您的论文要求,您可以申请本站帮您代写论文,以下是正文。 摘要 从鸡胚尿囊液中提取h1n2亚型猪流感病毒的rna,设计一对特异性引物,采用反转录-聚合酶链反应成功地扩增了ns1基因。将ns1基因的cdna克隆后进行了序列测定,所扩增的片段包含了完整的ns1基因的开放阅读框,并将该毒株与参考毒株进行了核苷酸及氨基酸序列同源性比较分析。关键词 ns1基因;克隆;序列分析中图分类号 q781文献标识码a文章编号 1007-5739(2008)22-0217-02猪流感病毒是正粘病毒科a型流感病毒属中的成员,其基因组由8个rna节段组成,其中ns基因是最短的,它含有2个读码框,可编码ns1和ns2 2种蛋白质。非结构蛋白ns1的基因序列高度保守,具有抗原性1,在siv检测中具有广阔的应用前景。本试验对该h1n2亚型猪流感病毒ns1基因进行克隆和序列分析,以期为后续研究提供参考。1材料与方法1.1试验材料trizol,载体pmd18-t、top10感受态细胞、rt-pcr试剂盒,agarose gel dna回收试剂盒、质粒小提试剂盒,限制性核酸内切酶和ecor、xho,t4 dna连接酶。猪流感毒株:a/swine/guangdong/1999(h1n2)。1.2引物设计与合成使用oligo 5.0引物设计软件,参考已发表序列,设计如下一对引物:上游引物:5-atggattccaacactgtg c-3;下游引物:5-ggc tgcatgaatgttatt-3。1.3病毒rna的提取取250l鸡胚培养尿囊毒液,参照文献2相关方法,提取总rna。将rna溶于无rnase水中,置-70备用。1.4目的基因的扩增1.4.1病毒rna反转录。在1l rna溶液中依次加入:mgcl2 4l,10rna pcr buffer 2l,rnase free dh2o 8.5 l,2.5mol/l dntp mixture 2l,rnase inhibitor 0.5l,反转录通用引物uni12(5-agcaaaagcagg-3)1l,amv reverse transcriptase 1l,共20l,轻轻混匀,放入pcr仪中,30 8min、50 30min、99 5min、5 5min,所得产物即为cdna。1.4.2pcr扩增。取5l cdna作为模版,依次加入mgcl2 6l,10pcr buffer 10l,d2h2o 76l,taq酶1l,上、下游引物各1l,共100l,轻轻混匀。置pcr仪中,94预变性2min、94变性30s、52退火30s、72延伸3min,进行35个循环,72延伸10s。取5l进行琼脂糖凝胶电泳。1.5克隆和序列测定按pmd18-t载体试剂盒说明书进行dna与载体质粒的连接,连接产物按常规方法转化top10感受态细胞。挑取白色可能的阳性菌落,提取质粒,进行pcr扩增和ecor、xho酶切鉴定。初步鉴定阳性克隆送生物公司测序。1.6序列比较分析用dnastar软件进行序列比较分析。参考毒株包括genebank中已公布序列a/swine/zhejiang/1/2004(h1n2)、a/swine/pingtung/7-12/1999(h1n2)、a/swine/hongkong/126/1982(h3n2)及试验对比毒株a/swine/guangdong/1999(h3n2)。2结果与分析2.1rt-pcr扩增出的dna片段约780bp(图1)。2.2阳性克隆的初步鉴定挑选的克隆提取质粒pcr、酶切鉴定与预测的结果一致,初步认为获得了ns1基因的阳性克隆(图2、图3)。2.3目的基因的核苷酸序列分析经序列测定,测得插入重组质粒中的外源dna片段包含了完整的ns1基因的开放阅读框(660bp)和上下游引物序列、蛋白质合成的起始密码子和终止密码子,表明已成功地克隆到了ns1的全长基因。2.4目的基因与参考毒株的核苷酸及氨基酸同源性比较经序列比较分析,猪流感毒株guangdong/1999(h1n2)与参考毒株hs1基因核苷酸及氨基酸同源性如表1所示。可以看出,试验毒株与参考毒株zhejiang/2004(n1n2)ns1基因同源性最高,核苷酸、氨基酸同源性分别达到96.6%、96.0%。3小结与讨论(1)由于流感病毒基因的分段性,每个基因组外部非编码区序列非常有限,加上整个基因组(特别是非编码区)的gc含量较低,这给引物设计带来较大困难3,4。本试验在ns1基因5端和3端的保守区设计了一对相对理想的引物进行扩增,这可能给以后的试验带来一定困难,如退火温度低、pcr产量低等5,但其优点是可顺利扩增出特异性良好的目的片段。(2)本试验毒株ns1基因开放阅读框全长660bp,编码219个氨基酸。该毒株与参考毒株ns1基因的序列比较显示,核苷酸同源性在92.5%96.6%之间,氨基酸同源性在92.2%96.0%之间,试验毒株与参考毒株都属于等位基因群a群1,试验毒株与参考毒株zhejiang/2004(h1n2)基因同源性最高,进化关系较为密切。非结构蛋白ns1进化稳定,具有较高的保守性,可用ns1蛋白作为抗原建立猪流感的elisa诊断试剂盒。4参考文献1 殷震.动物病毒学m.北京:中国农业大学出版社,1996.2 金冬雁,黎孟枫.分子克隆试验指南(第2版)m.北京:科技出版社,1993.3 huddlastetalj a.nucletcacids researchj.vet res,1982,10(3):1029-1038.4 傅生芳,常惠云,独军政,等.h9n2亚型禽流感病毒m基因的克隆及序列分析j.甘肃农业大学学报,2005,40(5):579-582.5 astrid v,guillaume s.comparision of three nonnested rt-pcr for the detection of influenza virusj.j clin virol,2000,17(3):167-175.其他参考文献baker, sheridan. the practical stylist. 6th ed. new york: harper & row, 1985.flesch, rudolf. the art of plain talk. new york: harper & brothers, 1946.gowers, ernest. the complete plain words. london: penguin books, 1987.snell-hornby, mary. translation studies: an integrated approach. amsterdam: john benjamins, 1987.hu, zhuanglin. 胡壮麟, 语言学教程 m. 北京: 北京大学出版社, 2006.jespersen, otto. the philosophy of grammar. london: routledge, 1951.leech, geoffrey, and jan svartvik. a communicative grammar of english. london: longman, 1974.li, qingxue, and peng jianwu. 李庆学、彭建武, 英汉翻译理论与技巧 m. 北京: 北京航空航天大学出版社, 2009.lian, shuneng. 连淑能, 英汉对比研究 m. 北京: 高等教育出版社, 1993.ma, huijuan, and miao ju. 马会娟、苗菊, 当代西方翻译理论选读 m. 北京: 外语教学与研究出版社, 2009.newmark, peter. approaches to translation. london: pergmon p, 1981.quirk, randolph, et al. a grammar of contemporary english. london: longman, 1973.wang, li. 王力, 中国语法理论 m. 济南: 山东教育出版社, 1984.xu, jianping. 许建平, 英汉互译实践与技巧 m. 北京: 清华大学出版社, 2003.yan, qigang. 严启刚, 英语翻译教程
温馨提示
- 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
- 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
- 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
- 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
- 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
- 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
最新文档
- 2026年呼叫中心行业研究报告及未来五至十年技术突破与应用落地
- 2025-2026年江苏版小学科学四年级卷
- 2025-2026物理高三测试卷苏教版
- 2025-2026年苏教版高三物理上学期测验卷
- 爱情至上的教学课件
- 2026年七年级上册第4章 一元一次方程 第9套 拓展拔高
- 2026年医学拉丁语专业医学拉丁语评估测试试卷及答案
- 2026年医学护理学老年护理服务试题及答案
- 美国调整AI出口管制规则新监管理念带来新挑战 -
- 安全主管竞聘模板
- 《中国教育史》孙培青1
- 雨课堂学堂云在线《经典与思考-人文清华大师面对面 》单元测试考核答案
- T-ACRI 0049-2025 锂离子电池正极材料烧结用匣钵
- e基建2.0成功施工方案
- 草原有害生物防治项目施工方案
- 透析患者病历汇报
- 贵州家乡介绍课件
- 2025榆林能源集团有限公司招聘工作人员(473人)笔试参考题库附带答案详解
- 景区开发战略框架协议书
- 互联网骨干直联点监测系统项目需求
- 基于HAL库的STM32F1开发实践教程-课件全套 第1-11章 GPIO输出-云平台接入(485、CAN、云平台)
评论
0/150
提交评论