饲料中有毒有害物质的测定课件

饲料中有毒有害物质的测定 黎观红 江西农业大学动物科技学院 *1 9 饲料中有毒有害物质的测定P244 （一）饲料质量 n营养质量：饲料营养成分含量； n技术质量：饲料的物理特性、如颗粒大小、形状、硬度、 适口性等、混合均匀度； n卫生（安全）质量：对动物、人和环境的安全； n情绪质量：伦理标准或感觉可影响对质量的讨论， 如有争 议的动物性原料 或人造着色剂和调味剂。 一、概述 公众对饲料质量重要性的认识的变化 表1 Date2 9 饲料中有毒有害物质的测定 （二）几起典型的饲料安全事故 世纪年代中期至年代中期疯牛病（“牛海绵状 脑病” ）的暴发流行。 1999年1月15日以来，比利时、荷兰、法国、德国相继发生 因动物饲料被二恶英污染，导致畜禽类产品及乳制品含高浓度二 恶英事件。 “瘦肉精”中毒问题、“毒奶粉（2008）”、“红心鸭蛋（使用 苏丹红，2006）”、“多宝鱼（药物残留，2006）”等。 “配合饲料有毒”、“配合饲料生产的肉蛋奶不能吃”、“小孩 肥胖原因是吃了含激素的肉”。 一、概述 饲料安全等于畜产品安全！ Date3 都是药残惹的祸！都是药残惹的祸！ 苏丹红 三聚氰胺 n疯牛病 n二恶英 n瘦肉精 n三聚氰胺 n苏丹红（红心鸭蛋） n孔雀石绿（水产品） n抗生素等药物残留 n Date4 “饲料鸡”“土鸡” 新概念鸡蛋全是“扯蛋”？ Date5 9 饲料中有毒有害物质的测定 （三）饲料卫生标准强制性国家标准 对饲料中有独有害物质及有害微生物以法律形式做出的 统一规定。 * 1991年版饲料卫生标准： n覆盖面较小，造成许多事故纠纷无判定依据， 一些重要的产品卫生指标没有规定等。 一、概述 Date6 9 饲料中有毒有害物质的测定 （三）饲料卫生标准强制性国家标准 * 2001年新版GB130782001饲料卫生标准： n有害物质及微生物卫生指标项目增加了“铬”在皮革、蛋白粉和鸡、 猪配合饲料中的允许量指标。即由原标准规定的16项，修订为17项。 n新版标准覆盖的产品品种达66种，是原标准的3倍多。 n砷在磷酸盐产品中的允许量指标由每千克产品10毫克，修订为20毫 克。 n氟在磷酸氢钙产品中的允许量指标由每千克2000毫克，修订为1800 毫克。 n黄曲霉毒素B1指标将肉用仔鸡配合饲料分为前期料和后期料，其允 许量分别为每千克饲料中10微克和20微克。 n补充规定了与各项指标相对应的试验方法，消除了原标准没有指明特 定试验方法的缺陷。 一、概述 Date7 9 饲料中有毒有害物质的测定 （三）饲料卫生标准强制性国家标准 *现行的饲料卫生标准将进行不断的修订和完善！ n相对于发达国家的饲料卫生标准，我国的饲料卫生标准项目偏少。 n新农药的不断出现（现行饲料卫生标准只规定了两种农药的限量标准 ：六六六、滴滴涕）。敌敌畏 、敌百虫 、甲胺磷 、菊酯类 、马拉磷 、蚜螨磷 安全限量标准草案。 n测定方法灵敏度的提高，对于某些有毒有害物质限量的规定将可能发 生改变。 n新饲料资源的开发利用。 一、概述 Date8 9 饲料中有毒有害物质的测定 （四）饲料中有毒有害物质的分类 1. 按来源分： 天然：棉酚、硫甙、脲酶、胰蛋白酶抑制剂等 次生：微生物次生代谢产物，如黄曲霉毒素B1、由氨基酸产生的组胺 、尸胺、腐胺、精胺等 外源性：重金属污染， 2 按性质分： 有机：棉籽饼粕、菜籽饼粕、蓖麻饼粕中的蓖麻毒素和蓖麻碱、四 季豆中的皂甙（皂素）和胰蛋白酶抑制剂等，病原微生物、霉菌毒素、有 机农药等。 无机：铅、砷、铬、镉、汞、氟、钼等。 一、概述 Date9 9 饲料中有毒有害物质的测定 l砷的毒性：砷与动物体组织中酶的巯基结合使之失活， 损害机体全身组织。 l砷的氧化物毒性很高，三价砷毒性五价；无机砷毒性 有机砷：砒霜（As2O3 ）。 l一般情况下，植物性饲料砷含量很低。 l植物饲料中砷含量与土壤中的水平、农药污染和工业污 染有关。 二、饲料中总砷的测定（P248） Date10 9 饲料中有毒有害物质的测定 二、饲料中总砷的测定 l有机砷饲料添加剂：对氨基苯砷酸（阿散酸）、对氨基苯砷酸钠 和3-硝基-4-羟基苯砷酸 （洛克杀生 ）。 促生长，抗球虫及着色（使皮肤红润，毛色发亮）等功效。 l我国制定的饲料中砷测定标准方法是测定饲料中总砷含量（目前 的检测方法还不能区分有机砷和无机砷），而卫生标准中砷的限量标 准为无机砷，造成了使用有机砷添加剂的配合料，含砷量超过我国国 家允许量标准，这也使得检测结果无法依据产品卫生标准进行质量判 定。 Date11 9 饲料中有毒有害物质的测定 二、饲料中 总砷的测定 Date12 9 饲料中有毒有害物质的测定 （一）概述 黄曲霉毒素（aflatoxins, AF）是由一组真菌（黄曲霉、曲霉等）产生的一 组化学结构类似的真菌毒素。主要污染花生、玉米、棉籽及其饼粕等。对人和 动物均具有极强的毒性和致癌性。黄曲霉毒素还可在动物产品中蓄积，影响人 体健康。 目前已分离鉴定出12种，包括B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q、H1 、GM、B2a和毒醇。其中黄曲霉毒B1最为多见，其毒性和致癌性也最强。 在自然条件下，饲料污染的黄曲霉毒素主要为AFB1、B2 、G1 、G2，其 中以AFB1含量最高。 黄曲霉毒素的毒性、致癌性和蓄积性饲料产品质量控制中的必检项目 。 二、饲料中黄曲霉毒素B1的测定 Date13 9 饲料中有毒有害物质的测定 (二)检测方法 n酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） n薄层层析法（thin layer chromatography， TLC） n快速筛选法 二、饲料中黄曲霉毒素B1的测定（P288） Date14 9 饲料中有毒有害物质的测定 酶联免疫吸附法 1、原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。 以待测抗原（或抗体）与酶标抗体（或抗原）的特异结合反应为基 础，通过酶活力测定来确定抗原（或抗体）含量。 特点： 很强的特异性：建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上 。 很高的灵敏度：酶催化反应。对于黄曲霉毒素B1， ELISA法最低可检出0.1g。 二、饲料中黄曲霉毒素B1的测定 Date15 9 饲料中有毒有害物质的测定 酶联免疫吸附法 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测 定方法中有3种必要的试剂： n固相的抗原或抗体， n酶标记的抗原或抗体， n酶作用的底物。 二、饲料中黄曲霉毒素B1的测定 Date16 酶联免疫吸附法 A、抗体 o将某种抗原经各种途径免疫动物，成熟的B细胞克隆受到抗原 刺激后，将抗体分泌到血清和体液中。实际上血清中的抗体是多 种单克隆抗体的混合物，因此称之为多克隆抗体。 9 饲料中有毒有害物质的测定 Date17 o单克隆抗体是 由生长在细胞培养 物中的同一B细胞 的群体（一个克隆 ）合成并分泌的、 均一的、识别同一 抗原表位的抗体。 Date18 酶联免疫吸附法 B、酶与底物： n在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。在少数 商品ELISA试剂中，应用的酶尚有葡萄糖氧化酶、-D-半乳糖苷酶和 脲酶等。 n辣根过氧化物酶底物：邻苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、 四甲基联苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS。用 2mol/L硫酸终止酶反应。 n碱性磷酸酶底物：一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate, p-NPP)作为底物，用NaOH终止酶反应。 9 饲料中有毒有害物质的测定 Date19 酶联免疫吸附法 B、酶与底物： n在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。在少数 商品ELISA试剂中，应用的酶尚有葡萄糖氧化酶、-D-半乳糖苷酶和 脲酶等。 n辣根过氧化物酶底物：邻苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、 四甲基联苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS。用 2mol/L硫酸终止酶反应。 n碱性磷酸酶底物：一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate, p-NPP)作为底物，用NaOH终止酶反应。 9 饲料中有毒有害物质的测定 Date20 酶联免疫吸附法 ELISA最常用的四种方法： u直接法测定抗原 ； u间接法测定抗体 ； u双抗体夹心法测 定抗原； u竞争法测定抗原 。 9 饲料中有毒有害物质的测定 Date21 （1） 直接法测定抗原 A. 将抗原吸附在载体表面； B. 加酶标抗体，形成抗原抗体复合物； C. 加底物。底物的降解量抗原量。 Date22 （2）间接法测定抗体 A. 将抗原吸附于固相载体表面； B. 加抗体, 形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体； D. 加底物。 测定底物的降解量抗体量。 Date23 （3）双抗体夹心法测定抗原 A. 将抗体吸附于固相表面; B. 加抗原，形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体; E. 加底物。底物的降解量抗原量。 Date24 （4）竞争法测定抗原 A. 将抗体吸附在固相载体表面; B. 加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入 酶标抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量 。 Date25 黄曲霉毒素B1酶联免疫竞争检测法 *26 样品 黄曲霉毒素B1分子 *27 微 孔 表 面 情 况 AFB1抗体 Date28 标准品 Date29 标准溶液 Date30 酶标抗原 Date31 酶标抗原 酶 AFB1 Date32 标准品, 样品 和 酶标抗原 加进微孔 Date33 样品 酶标抗原 样 品 孔 先 加 后 加 Date34 标准品酶标抗原 标 准 孔 先 加 后 加 Date35 孵育30分钟 抗 原 与 抗 体 结 合 Date36 微 孔 清 洗 Date37 洗涤5次，间隔2分钟 Date38 加入酶催化反应底物 Date39 加入反应底物A和B 孵 育 15 分 钟 Date40 显 色 Date41 Date42 反反 应应 孔孔 Date43 阴阴 性性 对对 照照 孔孔 Date44 阴性对照孔=没有黄曲霉毒素B1分子与酶标抗原竞争 所有抗体都与酶标抗原结合 Date45 阳阳 性性 对对 照照 孔孔 Date46 1 ng/ml 标准孔 = 黄曲霉毒素B1分子结合到抗体上 剩余的抗体再与酶标抗原结合 Date47 阳 性 样 品 酶标抗原结合得越少，颜色越浅 Date48 加入终止液，反应液由蓝色变成黄色， 上酶标仪读取数据，画标准曲线 Date49 调零孔 阴性孔 0.1 ng/ml 0.5 ng/ml 1 ng/ml 5 ng/ml 10 ng/ml 酶酶联免疫竞争法标准曲线联免疫竞争法标准曲线 0.1 1 10 ng/ml O.D. Date50 不不同温度条件下的标准曲线同温度条件下的标准曲线 0.1 1 10 ng/