心血管药理学的研究方法ppt课件

心血管系统的结构 1、心脏 2、血管 (1) 动脉 主动脉 外周动脉 (2) 静脉 高脂血症的研究 动脉粥样硬化的研究 血管再狭窄的研究 高脂血症的研究 血脂异常是血中总胆固醇（血脂异常是血中总胆固醇（TCTC）、低）、低 密度脂蛋白密度脂蛋白胆固醇（胆固醇（LDL-CLDL-C）、甘油三）、甘油三 酯（酯（TGTG）超过正常范围及（或）高密度脂）超过正常范围及（或）高密度脂 蛋白胆固醇（蛋白胆固醇（HDL-CHDL-C）低下。）低下。 高脂血症是指高脂血症是指TCTC或（和）或（和）LDL-CLDL-C或（或（ 和）和）TGTG增高。血脂异常在动脉粥样硬化（增高。血脂异常在动脉粥样硬化（ ASAS）的发生发展及其引起的心血管事件（）的发生发展及其引起的心血管事件（ CVECVE）中起非常重要的作用。）中起非常重要的作用。 高高TCTC血症，特别是血症，特别是LDL-CLDL-C增高，是发增高，是发 生生CHDCHD的最重要的危险因素。的最重要的危险因素。 流行病学资料显示，芬兰流行病学资料显示，芬兰TCTC最高，最高， CHDCHD发病率也最高，日本发病率也最高，日本TCTC最低，最低，CHDCHD发发 病率也最低。病率也最低。 饮食疗法开始标 准 药物疗法开始标 准 治疗目标值 1、动脉粥样硬化 病（） TC5.72mmol/LTC6.24mmol/LTC3.64mmol/L LDL- C4.16mmol/L LDL- C5.20mmol/LTC5.72mmol/LTC3.12mmol/L LDL- C3.64mmol/L LDL- C4.68mmol/LTC5.20mmol/LTC2.60mmol/L LDL- C3.12mmol/L LDLC2.60mmol/ L 高脂血症患者的开始治疗标准值及治疗目标值 降脂中药筛选及药理学研究 体外模型 体内模型 体外筛选细胞模型 (研究阶段) 肝细胞 卵细胞 胆固醇 甘油三脂脂酰CoA转移酶 羟甲基戊二酰CoA(HMG-CoA) 还原酶 脂酰辅酶A：胆固醇酰基转移酶 (ACAT) Y ? 体内筛选动物模型 (用于降脂药物筛选及机制研究) 家兔 大鼠 小鼠 金黄地鼠 家 兔 常用日本大耳兔或新西兰白兔。 兔是喂饲富含高胆固醇食物引起高脂血症 和动脉粥样硬化病变的敏感动物。 通过调整饲料可制作内源性高脂血症和外 源性高脂血症模型。 造模后形成的主动脉斑块及冠状动脉粥样 硬化病变与人类相似。 灌胃给药操作不便，灌胃不当易造成死亡。 高脂血症模型及动脉粥样硬化斑块形成时间较 长，耗费饲料，动物成本较高。 血清中VLDL占总胆固醇的比例过高，且兔为草 食动物，其脂代谢与人差异较大。 因无较为理想的高脂血症动物模型，目前有关调 脂新药和抗动脉粥样硬化药物的研究中，家兔仍然 是一种常用的实验动物。 家兔高脂血症造模 大鼠是目前国内研究人类脂质代谢使用最多的实验 动物。选用SD大鼠或Wister大鼠造模。 易于饲养管理，抵抗力较强 给药容易 采样方便，血量丰富，便于一次较多指标的检测 在国外高脂血症研究中，大鼠的使用逐渐减少。 a. 大鼠血清中高密度脂蛋白(HDL)是血浆胆固醇 的主要载体。 b. 对抗动脉粥样硬化形成的能力 大 鼠 用高脂饲料喂养大鼠，一般7-10天可形成高脂血 症模型。 影响因素： a. 饲料中掺人了胆固醇、猪油等油腻的高脂物 品，使饲料性质发生改变，有异昧，动物易出现“厌 食”；而且不易于掌握精确的饲料用量。 b. 进口胆酸纳价格昂贵。 c. 高脂乳剂黏稠，不易抽取，灌胃造模时，用量 不易准确控制。 d. 所造模型大多为外源性胆固醇摄入过量所致。 大鼠高脂血症造模 小鼠在调血脂药临床前研究中应用越来越多。 价格便宜，造模成本低，采样较方便。高脂饲 料喂养可成功建立高脂血症模型。基因缺损和基 因敲除小鼠已成功地用于药理学研究中。 具有清楚的遗传背景，繁殖力强，模型稳定。 血脂水平与人类接近，主动脉和冠状动脉均有 明显的斑块形成，可用于动脉粥样硬化的实验研 究。 apoE基因缺损小鼠及LDL基因敲除小鼠血脂升 高不受人为因素影响。 小 鼠 急性高脂蛋白血症的可用一种表面活化 剂(Triton WR-1 339)给小鼠尾静脉注射， 1224 h即可诱导出高脂蛋白血症模型 ， 可用作初筛新药。 正常小鼠用高脂饲料喂养造模时间长。 采血量少，指标的检测受限。 小鼠高脂血症造模 普通饲料喂养时，成年鼠血清胆固醇水平是 正常鼠的58 倍。 当给予高脂负荷饲料(20 %脂肪，0.3 %胆 固醇后) ，血清中胆固醇浓度可达普通饲料喂 养升高值的45 倍。 血脂升高稳定。 遗传背景为C57BL/6品系。 繁殖能力较强。 apoE-/-小鼠 行动灵敏，易发生逃逸。 性情较其他品系小鼠急，抓持不当易被 咬伤。 成年雄鼠之间易发生撕咬。 apoE-/-小鼠 较好地反映人类胆固醇代谢的调节。如肝脏合成 胆固醇的比例，人内源性胆固醇约有90%是肝外组 织合成的，雄性金黄地鼠肝外合成比例约为85%， 而雌性大鼠只有35%是肝外合成、雌性小鼠只有 55%在肝外合成。 较低的高脂负荷即可建立理想的动物模型。饲料 中胆固醇含为0.2%即可成功造模。大鼠饲料中胆固 醇的含量多为1-2%，超过自身合成量的10倍， 且要 在饲料中加入胆汁酸盐才有能达到理想的血脂水平 。 建立高脂血症模型所需时间短。喂饲高脂饲料后3 -4周，血TC、TG 可达较为稳定的水平。 金黄地鼠 (hamster) 降脂中药的药理学研究(一 ) 脂质含量及酶的测定 a. 血脂含量的测定 血清总胆固醇(TC) 血清甘油三酯(TG) 血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C) 血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C) b. 血清酶活性测定 羟甲基戊二酰CoA(HGM-CoA)还原酶 肝脂酶(HL) 脂蛋白脂酶(LPL) 卵磷脂胆固醇酯酰转移酶（LCAT） 载脂蛋白含量的测定 apoAI apoB apoC LDLR活性测定 放射性配基法 酶联免疫吸附法 激光共聚焦显微镜测定法 LDLR基因表达 降脂中药的药理学研究(二 ) 动脉粥样硬化的研究 与动脉粥样硬化形成有关的细胞和分子 Fatty-Streak Formation in Atherosclerosis Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis Unstable Fibrous Plaques in Atherosclerosis Formation of an Advanced, Complicated Lesion of Atherosclerosis ApoE Knockout Mice 0 6 12 18 wks of age High Fat 0.3% Cholesterol T-Chol 1500-1800 mg/dl Normal Chow T-Chol 500-700 mg/dl Atherosclerotic Lesion 抗动脉硬化中药的药理学研究(一 ) 血脂的测定 病理形态学研究 制作主动脉弓病理切片 染色及斑块面积的测定，测定斑块面积用 imagepro plus软件 分子病理学研究 通过免疫组织化学，用特定的抗体检测斑 块组织中相关分子的表达 抗动脉硬化中药的药理学研究(二 ) 分子生物学研究 巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)及其受体c- fms的基因表达 血小板来源的生长因子(PDGF)受体的基因 表达 凝集素样氧化低密度脂蛋白受体(LOX-1)的 基因表达 趋化因子(cxcl16、MCP-1及其受体CCR2等) 血管再狭窄的研究 动物模型 三种小鼠血管再狭窄模型 塑料微导管损伤模型（Cuff 植入模型） 金属丝颈动脉损伤模型 金属直弹簧丝股动脉损伤模型 塑料微导管损伤模型 金属丝颈动脉损伤模型 (据Lindner医师等所著论文的图例部分引用） 金属直弹簧丝股动脉损伤模型 （据Sada医师等所著论文引用） C57BL/6 Mice (Recipient) BM cells=5X105 Bone Marrow Transplantation GFP+/LDLR -/- Mice (Donor) Irradiation (9Gy) Polyethylene Cuff Sham Operation Left Femoral Artery Right Femoral Artery Mouse Vascular Injury Model Cuff Placement Cuff-placed ArterySham-operated Artery Bone Marrow-derived GFP-positive Cells in C57Bl/6 Mouse Vascular Remodeling Lesion Anti-Macrophage BM8 Macrophage like Cells in C57Bl/6 Mouse Vascular Remodeling Lesion Cuff-placed ArterySham-operated Artery GFPMerged Bone Marrow-derived Smooth Muscle Cells in Cuffed Femoral Artery of C57Bl/6 Mice Anti-a actin (2 weeks) SM1 (2 weeks) Cy3 Anti-a actin (1 week) Cuff-placed ArterySham-operated Artery CD31-positive Cells in C57Bl/6 Mouse Vascular Remodeling Lesion Bone Marrow-derived ECs in C57Bl/6 Mouse Vascular Remodeling Lesion Anti - vWF 1 week 2 weeks Anti-PDGFRb Anti-c-fms Control IgG （1mg/day） 9 Cuff Placement Day 2 10 Cuff Placement and Administration of anti-Cuff Placement and Administration of anti- c-fms and anti-PDGF-Rc-fms and anti-PDGF-Rb b mAb mAb C57Bl/6 (8 weeks of Age) on Normal Chow Diet Sacrifice 8 Age (wk) Anti-PDGF-Rb treated Staining of Macrophage and Smooth Muscle cells in Mice Injected with anti-c-fms and anti- PDGF-Rb mAb Anti-c-fms treated Immunostained with BM8 Immunostained anti a-actin Anti-Rat IgG treated Distinct Cellular Hierarchy in Atherogenesis Distinct Cellular Hierarchy in Atherogenesis andand Cuff-mediated Vascular RemodelingCuff-mediated Vascular Remodeling Endothelial CellEndothelial Cell Smooth Muscle CellSmooth Muscle Cell X X X X Smooth Muscle CellSmooth Muscle Cell MacrophageMacrophage Endothelial CellEndothelial Cell AtherogenesisAtherogenesisCuff-mediated LesionCuff-mediated Lesion MacrophageMacrophage Endothelial CellEndothelial Cell MacrophageMacrophage Smooth Muscle CellSmooth Muscle Cell GFPSMCmerged Bone Marrow-derived Smooth Muscle Cells in Cuff-induced Vascular Remodeling Lesion Scale Bars=100m Cuff Plac