中欧预防控制口蹄疫2011年培训课件

Diagnostic Tests for FMD and New Diagnostic Tests for FMD and New Developments in Diagnosis of FMD Developments in Diagnosis of FMD 口蹄疫诊断方法与最新进展 Training to Improve Control and Prevention of Foot and Mouth Disease (FMD), 旨在提高口蹄疫预防与控制行动的培训 Lanzhou, China, 8-12 August 2011 Chris MorrissyChris Morrissy CSIRO Livestock Industries, Australian Animal Health Laboratory (AAHL), Geelong, Australia. Outline（概要） Disease Diagnosis can take longer in cell lines（FMDV在原代细胞生长迅速，通常1 2代就能出现明显的CPE，在传代细胞系所需时间会长一些） FMD Virus Isolation （病毒分离） virus isolation requires live virus but can detect smaller amounts（病毒分离需要的活病毒的量较小） virus isolation requires specialized facilities （要求 有专门设施） reference laboratories need to grow virus to undertake vaccine comparison studies（参考实验室需要 培养病毒来进行疫苗抗原配比研究） virus used for looking at R value comparing current field isolate against vaccines being used （通过测定R值来比较当前流行毒与疫苗毒的抗原关系） virus isolate used for genetic studies （用分离病毒进行遗传关系研究） Molecular Technologies: FMD （分子诊诊断技术术） PCR PCR Conventional PCR/RT-PCR （传统PCR） *Group & serotyping primers（群与型鉴定引物） Real-time PCR （实时荧光PCR） Group primers & probe (*confirms FMD but not serotype) （群特异性引物与探针，不能定血清型） Pirbright & Plum Island test Sequencing PCR product Sequencing PCR product （PCRPCR产生测序）产生测序） confirm PCR product is from FMDV （确定基因来自FMDV） sero-typing (确定血清型) geno-typing: molecular epidemiology 基因型：分子流行病学 information on vaccine to be used （以上信息指导疫苗免疫） Molecular Technologies: FMD （分子诊断技术） Detection of virus genetic information Detection of virus genetic information （检测病毒的遗传信息）（检测病毒的遗传信息） Latest technology that detects the nucleic acid that makes up the genetic code （最新技术是检测包含遗传密码的核酸序列） PCR used for primary diagnosis where sample quality allows （如果样品质量允许可以用PCR作初步诊断） PCR for confirmation diagnosis （采用PCR进行确诊） Expensive and not necessary where FMD is an endemic problem (serotype important) 分子诊断比较昂贵，在FMD流行区不是很必要 （血清定型诊断更重要） Molecular Technologies: FMD （分子诊断技术） Technology is used in reference laboratories to undertake genetic studies to link viruses into families 参考实验室利用该技术进行遗传关系研究 Epidemiological studies: molecular epidemiology 流行病学研究：分子流行病学 field strain to vaccine strain （流行毒与疫苗毒关系） virus source and evolution （疫源与进化分析） FMDV Serology （血清学诊诊断） C-ELISA (structural) (OIE) 测定结构蛋白抗体的竞争ELISA（OIE） serotype specific （血清型特异性） 7 ELISAs (minimum) （至少7种ELISA试剂） Liquid-phase (LP) blocking ELISA（液相阻断ELISA） Standard test used to determine protection from vaccination 是测定疫苗免疫保护水平的标准方法 Non-structural protein antibody tests 非结构蛋白抗检测方法 Standard test to determine antibody from infection 检测感染产生抗体的标准方法 Virus Neutralisation test (OIE) 病毒中和试验（OIE） Virus Neutralisation test 病毒中和试验 BHK-21, IB-RS-2 & lamb kidney cells (LK) 细胞系BHK，IBRS2与羔羊肾细胞（LK） results 2 to 3 days （23天出结果） current gold standard test 目前的金标准方法 titres of 1:32 or less are considered negative 抗体滴度小于等于1:32为阴性 antibodies appear as early as 7 days, in most by 14 days post-infection 抗体最早在感染后7天出现，多数在感染后14天出现 FMDV non-structural protein antibody tests 非结结构蛋白抗体检测检测方法 3ABC C-ELISA （3ABC竞争ELISA） Prionics (Cedi) Baculo expressed NS antigen & MABs 杆状病毒表达NS抗原与单抗 AAHL Baculo expressed & chicken antibody 杆状病毒表达NS抗原与鸡抗体 Indirect NS ELISA Kits （间接ELISA试剂盒） Intervet/Bommeli, UBI, Panaftosa & Svanova Ruminant & Porcine ELISAs （区分反刍兽与猪） E-coli expressed NS antigen （大肠杆菌表达NS抗原） NS peptide （NS 肽段） FMDV non-structural protein antibody tests 非结构蛋白抗体检测方法 VIAA(3D) AGID （VIAA琼脂扩散试验） AAHL 3D C-ELISA (3D LP-ELISA) Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot assay (EITB) Sth Amercia 酶联免疫电转印（EITB）,用于南美洲 Western blot Combination of NS proteins （五种NS蛋白） Confirmatory Test （确认性的诊断方法） AAHL FMDV 3ABC NS C-ELISA AAHL/IAEA funded project 澳大利亚动物健康实验室/国际原子能机构资助项目 Competition ELISA: can be to test all species 竞争ELISA:可检测所有易感动物 Detects antibody from all serotypes 适用于所有的血清型 Detects antibody from NS proteins (3ABC) 检测非结构蛋白3ABC抗体 Detects antibodies from infected animals (Indicates infection & possible Carrier status) 检测感染动物抗体，指示感染与带毒状况 Preparedness for Disease Control 疫病防控的战备战备状态态 detailed protocols on handling outbreak 疫病发生时的详细操作程序 trained field & laboratory staff 训练有素的野外与实验室工作人员 diagnostic network from field to laboratory in place 从田间到实验室的诊断工作网络 sample collection materials available to field vets to allow same day collection and transport to laboratory 田间兽医能够随时拿到样品采集的物资，以便在疫病发生的 同一天将样本采集运送到实验室 diagnostics established & in use inlaboratories to allow same day result 所用的实验室与诊断方法能够在同一天得出结果 Quality Assurance (QA) Quality Assurance (QA) （质量保证）（质量保证） Ensures tests are preformed to a standard 依据某一标准开 展检测 Paperwork/Documentation for all tests 记录所有的测试数据 Internal Quality Control (IQC): Positive & Negative controls used in each test run 内部质量控制：每一个测试都要有阳性与阴性对照 Charting/documenting IQC controls used in each test 记录 或填写每一个测试的内部质量控制措施 calibration of equipment 设备的校准 Laboratory Accreditation to a StandardLaboratory Accreditation to a Standard实验室质量标准认证实验室质量标准认证 AAHL accredited to ISO 17025 AAHL通过了ISO17025认证 Quality Assurance (QA) 质量保证质量保证 Internal Quality Control (IQC) Internal Quality Control (IQC) 内部质量控制内部质量控制 IQC controls must standardised against Reference Controls 质控必需依据标准对照进行标准化 Charting IQC results (Graph & Sheet) 质控结果以图 表形式出示 Use of Low Positive controls important to confirm sensitivity 应用弱阳性对照来确认检测的敏感性 Important for test validation 质控对方法验证很重要 External Quality Assurance (IQA) External Quality Assurance (IQA) 外部质量保证外部质量保证 Proficiency Testing (PT) 熟练程度测定 Samples from Reference Laboratory tested in your laboratory 在你们的实验室检测来自参考实验室的样品 Important for test validation IQA对于检验能力验证很重要 Suspect case of disease LOCAL CLINICAL OBSERVATION LABORATORY DIAGNOSIS (Local or NRL) New Developments in Diagnosis 诊诊断方法的新发发展 1.Lateral-flow devices for FMDV antigen 检抗原的试纸条 2.Mobile PCR 移动PCR 3.Isothermal assays 等温扩增检测技术 Faster (more rapid detection) 更快速 Ability to support diagnosis based on clinical signs 支持临床诊断 疑似病例临床观察 实验室诊断 Lateral-flow devices for FMDV Antigen detectionLateral-flow devices for FMDV Antigen detection 检测检测FMDVFMDV抗原的试纸条抗原的试纸条 Developed by IAH in collaboration with Brescia and Svanova 由IAH,Brescia与Svanova合作研发 Quick and simple to perform 快速简单 Pan-serotypic 适用于多个血清型 During 2007: used for rapid (10 mins) confirmation of FMD in the field 2007年：用于快速确认田间疫情（小于10min） Also useful in the Lab 也可用于实验室 LFD marketed by 由Svanova销售 Progress with the Enigma Diagnostics FLProgress with the Enigma Diagnostics FL 实时荧实时荧 光光检测检测 技技术术 Enigma have licence to use TaqMan PCR technology basis for routine assays used in most diagnostic labs (FMDV, ASFV, BTV, BVDV, CSFV etc) 2009-2010: Evaluation of machines capability at IAH wet assay with MagNA PURE reagents performance can be equivalent to routine rRT -PCR assays used in the WRL Results in 60 minutes （60min内出结果 ) Future project to develop a dry-down consumable for FMDV? Nucleic acid amplification at a single temperature 等温条件下扩增 No need for fragile precision instrumentation 不需精密设备 More suitable for use in the field 适合野外条件 Very rapid, similar sensitivity to rRT-PCR 快速，与实时荧光PCR敏感性相似 Isothermal amplification (RT-LAMP) 等温扩增技术 Dukes et al., 2006 James et al., 2010 Alternative amplification technologiesAlternative amplification technologies 可选的扩增技术可选的扩增技术 Simple Rapid Sensitive Disposable test? Opportunities for non-invasive samplingOpportunities for non-invasive sampling 非侵入性采样非侵入性采样 FMDV excreted in air FMDV随呼吸排入空气中 Air-samplers (MesoSystems) 空气采样器 Hand held and simple-to-use 手持、易于操作 Integrated with FMDV detector? 整合FMDV检测仪？ Static located in high-risk areas? 固定于高风险地区？ Diagnosis Diagnosis Pen-side/field use testsPen-side/field use tests Thermal imaging 热成像 LFD PCR Future challenges Future challenges 未来挑战未来挑战 Many technologies （有许多技术方法） picking the “winning” assay format （需要筛选出最优检 测模式） Key role of commercial partners 商业伙伴的关键作用 Is the market viable?市场前景？ IP freedom to operate 操作的自由度 Who uses the tests? 谁来使用这些方法？ expectation of stakeholders 利益相关各方的期望 Freely available vs control of local diagnosis/reporting 自由获取与限于本地诊断/报告 Use in FMD-endemic countries 用于FMD流行国家 Sero-typing Realtime PCR 血清定型实时荧光PCR Summary （总结总结） Control of Disease Control of Disease （疫病控制）（疫病控制） Rapid detection in the field (same day response to disease outbreak) 田间快速检测（疫病发生的 当天要作出反应） Rapid Response 快速反应 quarantine, movement control etc 检疫，移动控制等 disease investigation (data collection) 疫病调查（数据收集） penside tests (?) 试纸条检测（？） samples for laboratory 实验室检测样本 Requires trained staff & resources 人员训练有素，物资准备充分 Summary（总结） Sample Collection Sample Collection 样样品采集品采集 SOPs 标准操作程序 cold chain 冷链 collect appropriate samples 采集恰当的样本 collect in appropriate sample collection buffer 使用恰当的样品采集缓冲液 phosphate/glycerol 磷酸盐缓冲液/甘油 possible use of RNAlater for PCR 可能的话，使用保存RNA的缓冲液 Summary（总结总结） Disease Diagnosis Disease Diagnosis （疫病诊断）（疫病诊断） Initial diagnosis based on clinical signs 临床初步诊断临床初步诊断 Diagnosis confirmed by laboratory 实验室确认诊断实验室确认诊断 same day result 同一天出结果同一天出结果 Final Diagnosis 最终的诊断结论最终的诊断结论 based on clinical & laboratory diagnosis 基于临床观察与实验室诊断基于临床观察与实验室诊断 detailed history from outbreak area 发病地区的详细病史发病地区的详细病史 Rapid feedback of result to field 快速反馈结果，指导田间防疫 supports direction of field response 诊断结果指导疫病防控行动 Summary（总结总结） Serology Serology 血清学血清学 ELISA Kits: commercial & in-house 商业化生产或内部使用的试剂盒 Serosurveillance: prevalence & post-vaccination 血清学监