血细胞分析仪检测技术及临床应用课件

血细胞分析仪检测技术及临血细胞分析仪检测技术及临 床应用床应用 n血细胞分析仪检测是临床诊断工 作中最常用的实验方法之一 n40年代后期美国库尔特先生 (W.H.Coulter)发明了粒子计数技 术(电阻抗法),50年代初期应用于 血细胞计数 血细胞分析仪检测原理 n一.电阻抗法(库尔特原理) n1.血细胞具有非传导性质(不良导体) n2.E=I x R脉冲信号 n3.脉冲信号大小与细胞体积成正比 n4.脉冲信号的多少代表细胞数量 n细胞的三分群： n各种细胞在溶血剂中，经溶血剂中表面 活性剂对细胞膜表面的脂蛋白作用后而 分群，由于RBC膜表面的脂蛋白含量最少 而易被破坏溶解,白细胞的细胞浆漏出， 仅留下核与颗粒并使细胞缩小，原来最 大的单核细胞经溶血剂作用后，体积就 落在了小的淋巴和大的中性粒细胞之间 ，这样就按照溶血剂作用后体积大小， 将白细胞分成三群。 n淋巴细胞：35-90fl; 中间细胞：90-160fl; 粒细胞160fl n依照三群细胞在白细胞体积分布的直方 图上所分布区域的面积，计算得出每群 细胞的百分比，并依照白细胞计数总数 ，求得每群细胞的绝对值。 n注意:各厂家的溶血剂配方不完全相同,对 白细胞膜的作用程度不同,而各厂家对仪 器的各类WBC区分设置也不尽相同. nRBC及相关参数的检测 nRBC检测电阻抗原理 n脉冲信号高度的叠加HCT n单个脉冲信号高度的均值MCV nRBC:36360fL区间分析 nRDW:仪器将不同大小的脉冲信号分别贮 存在不同通道,计算出相应的体积和数目, 再统计处理得到RDW,用RBC体积的CV或 SD表示. nRBC计数中WBC含量可忽略不计,但在白 血病或WBC异常增高时则对RBC及其相 关参数有明显影响. nPLT检测:电阻抗原理 nPLT和RBC一起同时被检测 nPLT体积分布:228fL,不同仪器的PLT直 方图 范围不一. nMPV:是PLT体积分布直方图的产物 nMPV与PLT成非线性负相关 nPCT参考范围是一不恒定参数 nPDW:是PLT体积分布直方图的产物 nPLCR:12fL的PLT比率 n浮动界标技术 n1.RBC/PLT : 为便于识别， 在RBC/PLT通道一般把体积大于30f1的细 胞计为红细胞(RBC)，而把体积小于30f1 的细胞计为血小板(PLT)。一般的血细胞 分析仪，PLT和RBC的分界点是固定的(例 如30f1处)，这种情况属于固定界标。但 也有例外的情况，有些公司的血细胞分 析仪，可以把PLT和RBC的分界点人为地 设置在5-30f1的范围内，在实测样本时 ，仪器根据PLT和RBC的分布曲线，自动 在所设定的范围内寻找最低点，以得到 正确的PLT. RBC及相关参数的结果，这 就是浮动界标. n2.WBC : 当直方图出来后， 由软件程序自动判别并寻找直方图上三 个区域的起止点（即第一个高峰起止和 第二个高峰地点）作为界标线，并以此 为依据进行判读，由于设计理念的不同 ，稀释液和溶血剂对细胞的作用不同于 固定界标，因此，浮动界标的wbc直方图 很少有能超过350fl的横坐标。直方图每 次的结果是不一样的，因此界标线的位 置也是不一样，这就形成界标线的移动 ，就是浮动界标 nHb检测:与WBC一起被检测 nSLS-HGB检测血红蛋白： n测定原理：亚铁血红素中的Fe2+离子被 十二烷基磺酸钠氧化，形成SLS-HGB衍 生物，在550nm波长进行比色测定。 nSLS-Hb法测定与ICSH的参考方法相比， 具有非常高的相关性(r=0.999)。 二.血细胞检测技术的发展（五分类） 1。光散射法(Scatter): 来自激光光源的单色光束在10-70 对细胞进行扫描,提供细胞结构、形态的 光散射信息。 光散射特别具有对细胞颗粒的构型和 颗粒质量的区别能力，从而将三种粒细 胞区分。 利用高低角度光散射可同时对PLT和 RBC进行计数.高角(5-15)测量RBC数,检 测PLT内容物.低角(1-3)检测RBCPLT体 积. n2。电导法 n 根据细胞壁能产生高频电流的性质采用 高频电磁探针，测量细胞内部结构、核 浆比、细胞内颗粒大小和密度。 n电导法可辨别体积相同而性质不同的两 个细胞群（如；小淋巴和嗜碱） n3。射频技术； n 在测量小孔的内外电极装有直流和高 频两个发射器，因此在小孔周围产生直 流和射频两种电流，直流电仅能测量细 胞大小，而射频可透入细胞内，测量核 的大小及颗粒的多少。 n 利用阻抗+射频技术可将淋巴、单核、 粒细胞区分。 n4.过氧化物酶染色技术 n过氧化氢酶含量:嗜酸粒细胞中性粒细 胞单核细胞. 淋巴和嗜碱粒细胞无 n由于酶反应阳性程度不同,通过激光束时 的吸光度也就不同,加上光散射及特殊溶 血剂的作用可进行五分类. n5.核酸荧光染色技术 n利用聚次甲基荧光染色液对有核细胞的核酸 (DNA/RNA)进行荧光染色。采用半导体激光流 式细胞检测，获得WBC/DIFF散点图并得到新 的检测参数IG和OTHER。通过对散点图的分析 ，可获得LYMPH、MONO、EOS、 NEUT+BASO及NRBC和Ret的测定结果。最早 的全自动网织红分析仪R-1000TM，用荧光染 料碱性槐黄；最新采用的是聚次甲基染料，用 来进行WBC四分类、网织红细胞测定、有核红 细胞测定，该染料被红色半导体激光（波长为 633nm）激发后发出660nm或更高波长的红色 荧光。 n该技术采用检测三种光学信号(前向散射光、 侧向散射光、侧向荧光)进行白细胞分类的测 定。 n前向散射光：细胞大小信息。所采集的前向散 射光信号用于对WBC/BASO的测定。 侧向散射光：反映细胞核及颗粒的信息(主要 是颗粒的复杂性) 。所采集的侧向散射光信号 用于WBC/BASO和WBC/DIFF的测定。 侧向荧光：通过对核酸(DNA和RNA)进行染色 ，荧光信号提示细胞核酸的信息。所采集的侧 向荧光信号用于WBC/DIFF 的测定。 n三.血细胞分析检测项目的进展 n1.幼稚细胞的检测: n幼稚白细胞膜上的脂质较成熟白细胞 为少，使用含有能固化细胞膜和胞浆的 硫化氨基酸的溶血剂，由于脂质的成分 、含量及在细胞膜上的占位不同，结合 在幼稚白细胞上的硫化氨基酸较成熟白 细胞为多，使胞膜和浆都固化，对溶血 剂中具有溶血作用的非离子表面活性剂 具有抵抗作用，加入溶血剂后，成熟白 细胞被溶解，而幼稚白细胞得以保存 ,通 过DC检测出幼稚细胞 n核酸荧光染色:根据细胞成熟度的不同 可以体现在其荧光信号的强弱上，其白 细胞分类通道除正常细胞分类外，还有 两个幼稚白细胞的定量参数： IG （幼稚 粒细胞）和 Other （原始细胞 / 异常淋 巴） ,激光照射后产生荧光信号，和侧向 散射光一道绘制成二维散点图进行白细 胞分类。 n利用幼稚细胞(IMI)的检测可应用于外周血干细胞移植 (PBSCT). nPBSCT技术的关键是确定移植所需PBSC的量和采集 PBSC的最佳时机. n在外周血幼稚或原始细胞增加的同时,伴随着干细胞的 增加,因此IMI+细胞可间接反映PBSC n骨髓多能干细胞无法检测,而粒巨噬细胞集落形成单 位系造血干细胞分化而来是造血祖细胞(HPC)的一种 n基于骨髓和外周HPC表达同样的CD34+因此可用流式分 析HPC, 含CD34+细胞不是单一细胞而是包括原始 到不成熟粒细胞的连续分布群。因此在血细胞分析仪 上利用幼稚细胞的检测可间接反映HPC n2.有核红细胞的测定 n将血液和测定有核红细胞的试剂相混合 ，正常红细胞中的血红蛋白渗出，只剩 下光学透明的细胞膜或碎片。有核红细 胞和白细胞被试剂中的聚次甲基染料快 速渗入。但有核红细胞的核很难和染料 结合，因为它的核染色质发生固缩，不 易着色。 n着色后的细胞排成流式细胞，并被 633nm的红色激光束照射，测得细胞所 产生的前向散射光强度和侧荧光强度。 二维散射图的横坐标表示侧荧光强度、 纵坐标表示前向散射光强度。 n以前检测有核红细胞的分析系统中，用酸 性低渗性盐溶液作为溶血素，用PI（ propidium iodide）或EB溴化乙啶 （ ethidium bromide）染有核红细胞的核， 但是该方法不能从损伤（死亡）的淋巴细 胞中区分有核红细胞 n3.网织红细胞检测(血细胞分析仪器) n1.用新亚甲蓝(A 液) 染红细胞内RNA;再 用含透明剂的硫酸(B 液) 使红细胞内血 红蛋白溢出,成为影细胞,处理后的血液在 仪器上应用VCS原理进行检测(Coulter) n2.将抗凝全血加入网织红细胞试剂(氧氮 杂芑750)中，孵育1545 min上机测定 ，数据分析由仪器中网织红细胞分析程 序完成，无需人工干预。(Technicon H*3) n此两种方法均为人工机外染色 n3. Sysmex 早期采用碱性槐黄作染料,用 于网织红计数仪(R系列). 后采用激光流 式原理和细胞核酸染色。除了进行自动 的 RET 数目和百分比计数外，还可以通 过核酸染色得到的荧光信号强度区分低 、中、高荧光强度的网织红（ LFR 、 MFR 、 HFR ）。由于幼稚的网织红荧光 信号较强， MFR 和 HFR 之和即反映未 成熟网织红的一个有用参数RMI .(XE- 2100 、 XT-2000i )。 n4.运用免疫表型法配合VCS检测技术分析 CD4、CD8白细胞亚群 n先以抗CD4及CD8的抗体包被乳胶球标 记CD4、CD8阳性细胞，被标记的细胞 在激光散射的特性方面与其它细胞明显 不同，上机后可被仪器识别并计数。 可在5分钟内快速得到CD4、CD8细胞的 绝对值、百分比、和CD4CD8比值 n5.网织血小板检测 网织血小板（Reticulated Platelets, RP）是从骨髓 释 放入血的新生血小板，与成熟血小板相比 ，体积大，蛋 白质合成能力强，RNA含量多。 1 网织血小板的得名:1969年国外学者应用新亚甲蓝染 料,对犬外周血进行染色，发现血小板内有一种网状结构 物，故将这一部分血小板命名为网织血小板 2 网织血小板检测方法 :荧光色素-噻唑橙（thiazole orange,TO）。奥黄O（Auramine O,AO） n四.保证计数精密度准确性的技术 n1容量限定:稀释液容量控制 n 浮球定量 n2控制细胞通过小孔时及计数准确性的技术 n 重叠校正 n 脉冲编辑 n 高精度体积分析 n 扫流技术 n 鞘流技术 n 浮动界标技术 n 延时 计数 n 电子拟合曲线 n在目前国内众多的五分类血液分析仪当中 ，主要品牌有：光电、ABX、东亚，库尔特 、雅培、拜尔 nCOULTER MAXM五分类血细分析仪 n集库尔特原理及VCS技术于一身，提供完 整的白细胞五项分类和全血细胞计数 n运用流体动力（鞘流）令细胞成单一排 列，逐个通过检测位置，每个细胞同时 接受VCS三项技术的测量，VCS测量技术 包括细胞体积(V),细胞传导性 (C)及细胞 激光散射性（S）。 n以活性染料新亚甲蓝（NMB）对网织红 细胞进行染色，漂清本底后，运用激光 散射技术从成熟的红、白细胞和血小板 中辨别出网织红细胞并计数。 n XE-2100 XE-2100采用了先进的半导体流式细胞 分析系统结合核酸荧光染色技术