白内障课件_2

25 ROS引发的病理过程实例分析 1. 白内障 白内障（cataract）是以眼球晶状体蛋白（ crystallin,CR）变性，分子量增加为特征的显示视力降 低症状。在眼科疾病中为多发病。致病原因多样。病因学 统计发现的危险因子包括糖尿病、辐射、痢疾、营养不良 、肾功能衰竭，药物副作用等。但是相关性最明显的病因 有二：（）紫外线照射，如眼睛暴露在紫外线下的工人 的职业性白内障（光致白内障）和（）糖尿病后期并发 的糖致白内障。老年人白内障多发，大约是在长年不断被 光照和不断受各种因素损伤渐渐造成的。虽然致病因素不 同，但都与产生ROS有关。因此，可以认为白内障与ROS损 伤有明显联系。 （一） 眼球晶状体结构、性质和功能的关系 晶状体相当于一个透镜。但是，这个“透镜”要有特殊的 结构和性质以满足特殊功能的要求。首先，它必须没有吸 收可见光的能力（无色的），还要没有散射光的能力，要 有一定的折射率，要能变焦。这些是这个透镜的物理要求 。从化学上说，应该稳定，不发生相变。从生物学上说， 从胎儿到婴儿到成年，晶状体必需随年龄发育成长，那就 需要细胞参与。但是这里有矛盾：既要细胞参与又要没有 散射和吸收可见光。如何解决？ 眼球晶状体（lens）从结构和性质上基本上满足了这 些要求。粗略地说，它是由一层上皮细胞构成的膜包着一 个高浓度（35%-40%）的晶状体蛋白的溶液。细胞从前方 分裂，被推向两侧，转向中央，变成失去细胞核的纤维细 胞。这些纤维集中在晶状体中央成为晶状体核。这样形成 的晶状体在结构上和组成上的特征是： （1）没有血管，否则血管和血液成分会造成光吸收和 光散射。 （2）只有一层由上皮细胞构成的膜，由它们负责合成 CR,并且包容晶状体。这种细胞只在生长区（前方）分裂 ，推动细胞，向赤道方向移动。到达赤道后，便失去分裂 功能，代谢停止。而此时分化开始，细胞失去核并延长成 纤维，纤维向内集中成为晶状体核的一部分。到达这里， 细胞分化停止。这一巧妙的机制使眼球得以发育，CR不断 供应。但是这些功能的细胞不能像其他组织那样增长，始 终只有一层膜上的上皮细胞在工作。 (3)CR的结构决定了它在溶液中不能有、也不能产生造 成光散射的蛋白质聚合物、缔合物以及其他难溶物。一般 来说, 蛋白质的巯基容易形成二硫键, 从而形成难溶蛋白 质聚合物。蛋白质构象也容易改变,特别是线性分子。球 蛋白构象不易变, 但它们又是在很大程度上依赖二硫键 结合维持构象。因此,这是一矛盾。CR是一组蛋白,包括 A1,A2,B1,B2,H,L,等等。在白内障病理过 程中主要靶分子是CR。CR单体相对分子量28000,是 可溶性球蛋白。它的结构特征是, 富含芳香氨基酸残基( 色氨酸,酪氨酸,苯丙氨酸)及含硫氨基酸(甲硫氨酸,半胱 氨酸),但少二硫键, 少螺旋,多折叠。以上种种都为 维持和保护结构,稳定构象起重大作用。 (4) 在组成上,晶状体中氧分压低, 维生素C 含量高。皮 质内GSH 高,其次为核,再次为上皮细胞。它们(还有SOD等 酶)构成抗氧化机制, 能在一定范围内防御ROS造成氧化性 损伤和交联。 (二)白内障病理过程中的靶分子 1.晶状体蛋白 CR 是主要靶分子。它富含芳香族氨基酸和含硫氨基酸, 特别是半胱氨酸残基。这些残基既是作用靶点,也起保护 作用。前面讲过,要维持球蛋白构象不易变(刚性比较大), 需要半胱氨酸形成的二硫键。半胱氨酸与交联二硫键之间 的转变是一个可逆过程,为光辐射催化,也为ROS推动。 ROS,h CR-SH CR-S-S-CR 单从这一反应看,二硫键的增加会导致交联度增加、构象 改变以及分子聚集态改变。但事实上, 生活在光照之中并 且不断接触ROS并没有造成晶状体内发生影响视力的变化 。这是因为CR 分子有一套自我保护的结构特点,在晶状体 内也有一套保护系统(如GSH、NADPH等)。因此ROS能够被 及时清除, 交联物能够被及时逆转。但是白内障患者晶状 体蛋白的-S-S-含量增加,而且,随着病情发展,越来越不能 逆转。 甲硫氨酸残基的硫醚键可以被氧化成亚枫 : -SCH3 -S-CH3 色氨酸残基在CR氧化上起两种作用。第一,它和酪氨酸、 苯丙氨酸等芳香族氨基酸残基一起起着电子受体的作用。 当巯基在光照下变成二硫键时,释放的电子在蛋白质结构 深处, 这些电子被缺电子的芳香环接受。为-S-S-逆转为 -SH保留所需的电子,因而起着保护作用。但是,色氨酸(酪 氨酸和苯丙氨酸不是)可以起光敏化剂的作用,把基态氧变 成单线态氧,成为光致白内障的触发环节(见后)。 虽然蛋白质的氨基不是ROS主要靶部位,但是由磷脂过 氧化产生的羰基化合物,如丙二醛,可以与氨基形成 Schiff碱,使蛋白链交联,水溶性下降。不过与CR的氧化性 交联比,后者贡献小。 ROS O 2.磷脂 前面已经讲过,细胞膜是一个以磷脂双层为基质的双 层膜。磷脂容易在ROS作用下发生过氧化,造成膜损伤。而 且通过花生四烯酸代谢级联反应产生一系列降解物,其中 有些可以造成蛋白质之间、磷脂与蛋白质之间的非氧化性 交联。膜损伤造成细胞内外离子平衡(ionic balance)改 变,致使K+ 漏出和Na+流入,Ca2+流进使细胞内游离Ca2十浓 度增加,CR和其他蛋白质聚集沉淀。为抵消 Ca2+浓度增加 和K+、Na+离子浓度异常,Na+/K+ATP酶和Ca2+/Mg2+ATP酶必须 加紧工作。因此迅速消耗ATP,造成ATP耗竭。 (三)白内障自由基机理的提出 1.证据 白内障病理过程中, 晶状体的以下变化都提示ROS的参与 : (1)引发白内障形成的因素都可以促进ROS的产生,如紫 外线、博莱霉素等。 (2)在白内障患者晶状体内可测出自由基信号,并可测 出H202浓度的增高。 (3)在白内障晶状体IR-拉曼光谱中可看到 SH含量减少 , -S-S-含量增多。 (4)用抗氧化剂SOD可减轻白内障发展。 (5)白内障晶状体内GSH含量下降。 另外,用过氧化氢处理晶状体,使其产生白内障时,可见 膜损伤引起的 Na+/K+ATP酶损伤(Na+结合部位受损),K+ 流 入被抑制,细胞外K+增多,Na+对ATP 水解控制能力减少,ATP 耗竭,糖酵解增加。 2.GSH与白内障的关系 前面讲过,白内障晶状体内GSH含量下降。在ROS推动 白内障的机理中,GSH所起的作用有几个可能 : (1)本来蛋白质与蛋白质之间容易通过巯基变成二硫键 而聚集。不过,在一般情况下,GSH可以使反应逆转,维持巯 基状态 : PSH P-S-S-P GSSG GSH 那么GSH水平的降低,就会引起蛋白质交联度的提高。 GSH水平下降可以是因消耗在处理ROS中,也可以是由于其 他原因。 (2)膜两侧离子平衡紊乱提示离子通道、离子泵受损伤, 因为这些膜蛋白参与离子转运,也决定膜的通透性。这些 蛋白质的构象与装配都与它们的巯基状态有关。如前所述 ,维持巯基状态需GSH。 (3)GSH作为GSHpx 的辅助因子, 清除过氧化氢及过氧化物 。 以上3个问题虽不能作为ROS机理的直接证据,但支持 ROS机理。 在晶状体内有较高浓度的GSH,就是为了保护蛋白质(保 护它的构象)。维持GSH 浓度的第一条件是合成。合成GSH 的第一步是在-谷氨酰半胱氨酸合成酶(- glutamyIcysteine synthetase)作用下,使Glu与Cys结合 成-谷氨酰半胱氨酸,然后再一步与Gly结合生成GSH。这 都需要ATP。大部分ATP来自糖酵解。在能量被大量消耗, 缺氧情况下,ATP水平就低,GSH合成就受影响。营养不良成 为白内障的危险因子可能就是因为这个原因。除GSH合成 减少外,影响GSH 水平或GSH/GSSG比的另一重要 原因是GSH被氧化。ROS和其他氧化剂都能使GSH减少,GSSG 增多。但是,前面讲过,只要反应停留在GSH GSSG之间, 就可以被一系列细胞内还原电势维持系统所恢复。这一系 列的末一步是己糖磷酸旁路,因此与糖代谢有关。所以糖 代谢有两重意义,一是与ATP有关,一是与GSH 有关。不过 这并不是糖致白内障产生的主要原因。 3.Spector 设想 Spector把以上所讲的几个因素联系在一起,提出了一个 由ROS触发的白内障发生机理。如图1所示。他设想: 一方 面,ROS损伤膜结构、改变膜通透性,影响离子平衡,消耗 ATP; 另一方面,直接作用于晶状体蛋白, 使蛋白氧化交联 聚集。虽然有很多证据支持ROS 的参与,但是白内障发生 发展过程并不像 Spector 所想的那么简单。不同白内障 虽然在结果上都是CR变性,但在诱因和反应过程中均 代谢损伤 ATP水平下降 有所不同,因此在病情发展过程中,出现的症状变化不同。 下面我们就最常见的光致白内障和糖致白内障从分子水平 讨论。 ROS 膜损伤 膜通透性改变 离子平衡受干扰 直接对蛋白氧化 CR中高分子量 聚集物形成 图1 白内障病理过程的Spector设想 (四)光致白内障的ROS机理 光致白内障是由紫外照射所引起。强紫外线照射引起 的不可逆转的CR变化是这种白内障的特征; 而短时的、弱的紫外照射(实际上人总要接受一些紫外线) 引起的变化是可逆的,不能构成白内障。但小剂量长时间 照射(包括老年人一生几十年中在日光下生活和工作)也易 形成白内障。老人中绝大多数有不同程度的白内障,原因 之一是一生中所受的低剂量照射。 光致白内障有一个独特的表现,就是晶状体核呈棕色 。因此,它不只是CR交联问题。 光致白内障病理过程包括在膜、晶状体和核三个部位 发生的事件。 1膜上的事件 膜上发生的事件是ROS诱导的膜损伤过程。在这里ROS 基本上不是由细胞的吞噬作用产生,差不多完全是UV 照射 引起的。UV照射启动自由基反应后,发生脂质过氧化并且 ROS转化、增殖,引起一连串反应。反应一经发生便难以 Na,K-ATP酶 Ca泵 蛋白质交 联与聚集 ATP酶负担 蛋白质构 象改变 蛋白质结合 相分离 图2 光致白内障发生发展中的生物学事件 终止。 ROS以及脂质过氧化产物中的二羰基化合物向膜蛋 白及晶状体内蛋白质进攻,使它们发生交联或降解。这些 事件与前面讲过的原则上相同。 UV ROS 膜磷脂 脂蛋白 膜 丙二醛 膜蛋白交联降解 光敏化剂 产生1O2 胞内K+ Na+ 胞内Ca2+ 产生荧光物质 胞内水 与晶状体核 空泡 ATP消耗 光照 GSH合成减少 ROS 光散射 S-S键形成增多 2.膜内外离子平衡的扰乱 这一过程和炎症时发生的相近。主要是 Na+/K+ATP酶和 Ca2+/Mg2+ATP 酶受损后工作能力下降,细胞内游离Ca2+浓度 升高,K十浓度降低,Na+浓度升高。Ca2+浓度居高不下又引起 一系列变化。这些都是普遍的事件。但是对眼球晶状体来 说, 可能有三个后续变化与白内障有关: (1)因为Na+/K+ 泵工作能力下降后,每次少进2个K十,就 少出3个Na+,所以细胞内渗透压增高,水进入细胞,细胞被 破坏,形成空泡,导致相分离,光散射增加。 (2)Na+/K十泵与Ca2+ 泵为维持离子平衡,全力工作,导致 ATP浓度下降,GSH合成减少。虽然在别的细胞中也有这一 事件, 但在这里,则因GSH 减少增加了ROS 对CR 氧化交联 的程度。 (3)细胞内Ca2+浓度增加也会引起蛋白质构象改变或凝聚 。 这三者都对白内障形成有贡献,不过,都是间接的。 3.晶状体内CR的交联 这是指 ROS 直接与CR 作用的结果,是所有白内障都 具有的核心事件,包括疏基氧化成二硫键及与二羰基化合 物缩合形成 Schiff 碱而交联等。红外和Raman光谱指示 这一变化的进度。 4.晶状体核内发生的事件 这是光致白内障的特点,也是核心问题。从本质讲,光 致白内障的发展要有某种光敏化剂在里面起作用。这种敏 化剂能吸收一定波长的紫外光,把所得能量传给基态氧,把 氧变成单线态,单线态氧再去氧化CR。这一反应本身并无 特点。值得注意的是通过光敏化剂传递能量不是简单的物 理过程, 它是一系列化学变化的组合。我们在光致白内障 晶状体核中看到的棕色物质就是光敏化剂生成的荧光物质 与核中的蛋白质(可能是已经交联的蛋白质)结合的产物。 这种棕色蛋白质带着光敏化剂,就会在光照时继续不断地 产生ROS, 把对CR 的氧化如此进行下去。 问题是光敏化剂从何而来?虽然它可以是外源的,但主要 是眼球内部就有的。视网膜中的视紫红质(rhodopsin)就 可以吸收紫外线,把基态氧变成单线态氧。不过它的损伤 部位主要在视网膜。在光致白内障发展中的前光敏化剂 (pro-photosensitizer) 可能是蛋白质中的色氨酸残基。 在白内障晶状体中色氨酸残基的荧光强度下降,非色氨酸 残基荧光强度相对增加提示这一可能。实验证明下面一系 列变化的可能性(图3) 。 P P P 1K 3K 3O2 图3 色氨酸的光敏化作用和活性氧的生成 CH2CH-COOH NH2 N H ROS O2- O2 C-CH2CH-COOH O NH2 COCH2CH-COOH NH2 NH HCO NH2 H2O UV UV UV 犬尿氨酸 荧 光 磷 光 1O2 蛋白质 聚合 N-甲酰基犬尿氨酸 色氨酸残基本身不是光敏化剂,而是产生光敏化剂犬尿 氨酸(kynurenine) 的前体。第一步,色氨酸残基在光照下 氧化开环,这是氧分子在光照下产生的超氧离子作用的结 果。开环后形成的N- 甲酰基犬尿氨酸 (N- formylkynurenine) 中的酰氨基不稳定,即水解生成犬尿 氨酸。这是第二步反应。然后,便是犬尿氨酸的光敏化作 用。它获得紫外线提供的能量后,分两步跃迁(lK及3K)。单 线态的IK可以发出荧光回到基态,3K则发出磷光返回基态。 放出的能量适于基态氧转化为单线态,因此反复作用产生 单线态氧,不断氧化CR 及其他蛋白质。由犬尿氨酸产生的 荧光物质即与核内蛋白质结合。而且由于ROS 的作用, 蛋 白质可能已经交联。所以荧光物质与已经变化的蛋白质结 合而形成棕色蛋白质。 上面讲的过程只说明光敏化机理,并不是说光致白内障 就是由单线态氧造成的。在光致白内障中,ROS可能起多重 作用,不能认为只有一种特定的过程在起作用。 。 (五)糖致白内障的 ROS 机理 糖致白内障是血中葡萄糖、半乳糖等浓度长期居高不下 引起的白内障。除糖尿病外,有一种遗传性疾病,半乳糖血 症。这种病的患者缺少一种能把磷酸化的半乳糖转化为葡 萄糖的酶 半乳糖1-磷酸尿苷转移酶(galactose-l- phosphate uridyl transferase)。血中半乳糖持续浓度 过高,也容易促使白内障发展。 两种情况的最终结果是相同的白内障,说明某些糖类有 诱导CR交联变性的共性。 1. 生物学事件的联系 糖致白内障有两个生物学事件特征。 (1)脏器转移。糖尿病原发部位是胰脏的胰岛部位,但由 之引起血糖浓度过高,经血循环使晶状体葡萄糖浓度升高, 从而把致病因子转移到眼球,发展成白内障。这种从一个 脏器发生的事件,通过物质传递在另一脏器产生新的病理 过程很多。只要找到这个传递物质就可跟踪其来龙与去脉 。两个部位的病理过程可能有先有后。比如并不是在糖尿 病初期血糖一高就表现出白内障来, 这是因为造成不可逆 损伤需要较长的时间过程。我们知道,损伤需要积累,而且 是一慢过程。 (2) 病理过程的阶段性。粗略地说,糖尿病引起白内障 的早期(那时还不能算做白内障), 可以看到血糖浓度与晶 状体折光指数同步升降。这个过程是可逆的。在这个时期 ,为了把血糖降下来,大多数患者都服用降糖药。但是在持 续用降糖药维持血糖不太高(事实上并非正常)过程中,白 内障却在渐渐发展进入第二阶段。这时可见晶状体纤维 细胞充水,破裂,产生空胞,视力明显减退。经过在更长时 期发展以后,也可以说到第三阶段,开始见到蛋白质聚集而 后成熟,形成白内障。在病理过程的可逆转性上也有阶段 性。在抗氧化系统的工作能力范围内,病理过程还是可逆 的、可修复的。但当这个系统调控能力渐渐降低,ROS水平 长期超过它的调控能力时,病理过程变成不可逆的。病情 就是这样发展的。 2. 渗透压增加说 有人曾从生物化学研究提出解释糖致白内障形成的机 制。其中心环节是晶状体内糖浓度升高, 渗透压增高,从 而使细胞充水、破裂。但是其中有一个难以解释的地方: 那就是既然葡萄糖是可以代谢的, 也是可以透过膜而扩散 出细胞的,为什么细胞内糖浓度高时糖不能被代谢掉,也不 向细胞外扩散呢? 己糖激酶 产生糖致白内障的渗透压学说的依据是葡萄糖正常代谢是 在己糖激酶（hexose kinase）催化下磷酸化成葡萄糖-6- 磷酸，后者再被氧化成二氧化碳。但是这条加工线处理葡 萄糖的容量有限。在葡萄糖浓度超过这条限度时，多余部 分就要走糖醇途径代谢，即经醛糖还原酶（aldose reductase）把葡萄糖还原成山梨醇，再在山梨醇脱氢酶 (sorbitol dehydrogenase)催化下，氧化成果糖。 NADP+ NADPH 葡萄糖 葡萄糖-6-磷酸 CO2（正常代谢 ） NADPH NADP+ NADP+ NADPH 醛糖还原酶 山梨醇 山梨醇脱氢酶 果糖（糖醇途径 ） 渗透压说认为，经糖醇途径生成的山梨醇和果糖不能 透过细胞膜，而储留在胞内，使渗透压增高。 血糖 增高 晶状体葡萄 糖超过正常