急性高血糖与内皮功能紊乱长城课件

急性高血糖与 内皮细胞功能 上海复旦大学附属中山医院内分泌科 高 鑫 血管内皮 血管内皮是维持血管功能的重要调节组织，主要参与： 黏附 物质传递与转运 渗透 迁徙 凝血与纤溶 介导炎症因子反应 NO的作用（内皮舒张因子 EDRF）: 维持与调节血管张力 血管内皮主要的抗动脉硬化因子 调节：单核细胞、粒细胞向内皮的黏附 血小板与血管壁相互作用，抑制血小板积聚 抑制平滑肌细胞增殖 血管内皮功能受损 l高血压主要发病机制之一 l早期发生动脉粥样硬化的风险增加 l导致心肌缺血和冠状动脉疾病 l糖尿病心血管并发症的发病机制 l也可能是2型糖尿病的发病机制？ 慢性高血糖与内皮功能受损 Chronic hyperglycaemia and endothelial dysfunction 体外：血管舒张功能受损 血管内皮凋亡增加 增加黏附因子表达 体内：血管舒张功能受损 易导致血栓形成 增加黏附因子表达 急性高血糖对内皮损伤的意义 1. 糖尿病并发症是长期高血糖和其他危险因素 共同作用的结果 2. 新诊断的2型糖尿病病人中约50%已经存在 不同程度的血管病变 3. 对糖尿病最早期血管的损害是如何发生的？ 4. 急性短暂高血糖是否造成伤害？如何造成伤害？ 5. 急性高血糖引起的血管损伤机制得到哪些启示？ 急性高血糖对血管内皮损伤的证据 1. 在体内、体外均证实引起血管舒张功能受损 2. 黏附因子浓度增加 3. 凝血功能亢进(高凝状态) 4. 氧化应激产物增多 脂质氧化产物增加（硫巴比妥反应物质TBARS增多） 体内抗氧化物质减少（氧化应激亢进） 急性高血糖与内皮依赖的血管舒 张功能受损 体外： 血管舒张功能的研究证实： 大鼠或家兔的动脉在高糖条件下孵育，可以抑制 NO介导的血管舒张功能。 体外研究证据 Tesfamariam B, Am J Physiol 1992 Aug;263(2 Pt 2):H321-6 高糖培养引起自由基介导的内皮功能受损(1) 糖尿病家兔主动脉和正常家兔主动脉在高糖孵育条件下 均导致内皮依赖的血管舒张受损。 测定：应用自由基清除剂probucol(脂溶性抗氧化剂)饲养家兔， 检测自由基对内皮细胞的作用 离体家兔主动脉环直径： 分别在葡萄糖(5.5 mM) 或(44 mM)条件下孵育6小时， 测定直径大小，氧化应激标志物。 预防：可被环氧化酶抑制剂、过氧化物歧化酶( SOD ), 等抗氧化剂阻断； probucol饲养的家兔不发生损伤， Acetylcholine-induced relaxation of rabbit aortic rings. The aortic rings were incubated in control glucose (5.5 mM) or elevated glucose (44 mM) for 6 hours. 0 20 40 60 80 100 8765 Relaxation (%) Acetylcholine, -Log M 44 mM glucose 5.5 mM glucose Tesfamariam B et al. Am J Physiol 1992;263:H3216 高糖培养引起自由基介导的内皮功能受损(2) 160 150 140 130 120 110 100 0204060 Control diameter (%) D-glucose L-glucose * * * *p0.05 vs baseline Vasodilation induced by 100nA dosage of acetylcholine recorded at 20-minute intervals during 1-hour exposure to isotonic physiological media containing D-glucose (n=5) or L-glucose (n=5) concentrations of 5 mg/ml. Bohlen HG et al. Am J Physiol 1993;265:H21923 Glucose exposure time (minutes) 高葡萄糖可以迅速抑制 NO介导正常大鼠动脉的舒张 急性高血糖引起血管内皮细胞凋亡 体外研究 内皮细胞间断地接受高葡萄糖刺激， 可以导致细胞死亡 AIM: To explore the effect of fluctuating glucose on endothelial cells, (human umbilical vein endothelial cells HUVECs) Methods: HUVECs were incubated for 14 days in media containing different glucose concentrations: 5 mmol/l, 20 mmol/l, or a daily alternating 5 or 20 mmol/l glucose. Apoptosis: studied by different methods: viability assay, cell cycle analysis, DNA fragmentation, and morphological analysis. the levels of Bcl-2 and Bax, (well known proteins involved in apoptosis were evaluated.) Risso A, Am J Physiol Endocrinol Metab 2001 Nov;281(5):E924-30 人脐静脉间断高葡萄糖培养可增加细胞凋亡 Experimental design H/L 0 14 High glucose (H) Low glucose (L) Time (days) Results: 1. Stable high glucose induced apoptosis in HUVECs and accompanied by a significant decrease of Bcl-2 a simultaneous increase of Bax expression. 2. Apoptosis was enhanced in HUVECs exposed to intermittent, rather than constant, high glucose concentration. In this condition, Bcl-2 was not detectable, whereas Bax expression was significantly enhanced. Conclusion: 高低交替的葡萄糖环境比持续高血糖 对内皮损害更为严重 Risso A, Am J Physiol Endocrinol Metab 2001 Nov;281(5):E924-30 人脐静脉间断高葡萄糖培养可增加细胞凋亡 Evidence suggests that intermittent high glucose levels induce high concentrations of ICAM and VCAM in endothelial cells both are involved in atherogenesis 急性高血糖与黏附分子对内皮的损伤 间断高葡萄糖培养可诱导内皮细胞分泌ICAM和VCAM增高 Adhesion molecules in vitro 014 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 s ICAM-1 (ng/ml) s VCAM-1 (ng/ml) Time (days) 014 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 Time (days) Normal glucose (5 mM) High glucose (20 mM) Intermittent low/high glucose (5/20 mM) s ICAM = soluble ICAM; s VCAM = soluble vascular cell adhesion molecule 人脐静脉内皮细胞培养液黏附分子定量 急性高血糖对内皮功能的影响 临床研究（群体、个体水平） 急性高血糖可导致正常人、IGT、糖尿病病人 血管舒张功能减退 此作用可被L-精氨酸(NO前体)或抗氧化剂阻断 目的: 研究急性高血糖诱导的血管 内皮损伤是否与NO降低有关。 Dario Giugliano, (Circulation. 1997;95:1783-1790.) 1997 American Heart Association, Inc. L精氨酸逆转急性高血糖诱导的 血管内皮功能异常 急性高血糖减少NO形成 急性高血糖对内皮功能的影响 临床研究（群体、个体水平） 方法与结果： 1. 在12例正常人诱导急性高血糖状态 (15 mmol/L高葡萄糖钳夹试验) 2. 高血糖状态30分钟时，受试者收缩压、舒张压、 血浆儿茶酚胺水平升高(p0.05) 3. 高血糖60、90分钟时，大腿血流灌注下降15%(P0.05) 4. ADP诱导血小板凝集和血流速度明显增加 (P0.05). L精氨酸逆转急性高血糖诱导的 血管内皮功能异常 5. 在高葡萄糖钳夹试验最后30分钟， 分别静脉灌注L-精氨酸 (n=7, 1 g/min)； D-精氨酸 (n=5, 1 g/min) L-赖氨酸 (n=5, 1 g/min) 仅在灌注L-精氨酸组可以逆转所有血流动力学异常 6. 给8例正常受试者灌注 NG-monomethyl-L-arginine (L-精氨酸衍生物 L-NMMA，抑制内源性NO合成; 2 mg/min)， 可以诱导与急性高糖相似的血流动力学异常。 L精氨酸逆转急性高血糖诱导的 血管内皮功能异常 图1-1 图1-2 saline L-Arginine 图3 结论： 在正常人，急性高血糖可以诱导血流动力学 和流变学异常； 这些异常可以被L-精氨酸逆转。 证明 急性高血糖导致血管内皮细胞NO生产减少。 L精氨酸逆转急性高血糖诱导的 血管内皮功能异常 Endothelial cells Guanylate cyclase activation Arterial relaxation cGMP NOO2 急性高血糖体内研究 （个体、群体水平） lMethods Forearm blood flow measured by ultrasonography combining B- mode imaging and Doppler beams or blood pressure monitoring lStimuli used （诱导急性高血糖状态） Hyperglycaemic glucose clamp Standard oral 75 g glucose loading Endothelium-dependent vasodilators Antioxidants （谷胱甘肽） lBlood samples taken to measure: levels of TBARS (脂质氧化产物) content of prothrombin fragments 1 + 2 (F1 + 2) circulating levels of soluble ICAM Marfella R et al. Am J Physiol 1995;268:E116773 Systolic blood pressure (mmHg) Time (minutes) 300306090120 140 135 130 125 120 115 110 105 100 葡萄糖 谷胱甘肽 谷胱甘肽可以逆转在正常人 急性高血糖诱导的血流动力学异常 急性高血糖诱导内皮功能受损 (I) NGT = normal glucose tolerance; IGT = impaired glucose tolerance; DM = diabetes mellitus Kawano H et al. J Am Coll Cardiol 1999;34:14654 NGT IGT DM Flow-mediated dilation of brachial artery (%) Flow-mediated dilation of brachial artery (%) Plasma glucose levels (mg/dl) 8 6 4 2 0 12 10 8 6 4 2 0 2 250 200 150 100 50 0 Fasting 1 hour 2 hoursFasting 1 hour 2 hours 0100200300400 Plasma glucose levels (mg/dl) Fasting1 hour 2 hours Plasma TBARS level (nmol/ml) 3 2 1 0100200300400 4 3 2 1 0 Plasma glucose levels (mg/dl) Plasma TBARS level (nmol/ml) NGT IGT DM Kawano H et al. J Am Coll Cardiol 1999;34:14654 急性高血糖诱导内皮功能受损 (II) 脂质氧化产物（硫巴比妥反应物质TBARS） 急性高血糖对人体凝血酶原片段 水平的影响 体内研究研究证实：正常人和2型糖尿病患者经 OGTT负荷后，血清凝血酶原片段水平增高， 应用抗氧化剂或谷胱甘肽后可恢复正常。 提示：急性高血糖通过氧化应激途径，诱导凝 血酶原活性增加。 Prothrombin fragment (F1 + 2) variations during OGTT in (A) type 2 diabetes and (B) normal subjects 300306090 120 150 180300306090 120 150 180 300306090 120 150 180300306090 120 150 180 2.0 1.5 1.0 0.5 20 15 10 5 10 8 6 4 1.5 1.0 0.5 F1+2 (nmol/l)Plasma glucose (mmol/l) F1+2 (nmol/l)Plasma glucose (mmol/l) AB Ceriello A et al. Diabetes 1995;44:9248GlutathioneOGTTOGTT + glutathione Time (minutes)Time (minutes) Time (minutes)Time (minutes) 急性高血糖对人体黏附分子 水平的影响 正常人和2型糖尿病患者经OGTT负荷后， 2型 糖尿病患者血清黏附分子 (ICAM) 水平高于正 常受试者高; 应用抗氧化剂或谷胱甘肽后可以得到纠正。 Circulating ICAM-1 and plasma glucose in (A) patients with type 2 diabetes and (B) normal subjects 300306090120 150 180 Plasma glucose (mmol/l) Plasma glucose (mmol/l) c ICAM-1 (ng/ml) c ICAM-1 (ng/ml) AB Ceriello A et al. Horm Metab Res 1998;30:1469 20 15 10 5 10 8 6 4 300 250 200 150 100 400 300 200 100 300306090120 150 180 300306090120 150 180300306090120 150 180 Time (minutes)Time (minutes) Time (minutes)Time (minutes) Glutathione OGTTOGTT + glutathione Evidence has been shown to suggest that acute high glucose levels result in: lInhibition of vasodilation in blood vessels in vitro and in vivo this effect is reversed by the presence of L-arginine or antioxidants lEndothelial cell apoptosis in vitro lInhibition of flow-mediated vasodilation in vivo in normal, IGT and diabetic individuals lHigh concentrations of prothrombin fragments and ICAM in vitro and in vivo The damaging effects induced by acute hyperglycaemia are probably a result of free radical production 小 结 体外和体内研究均证实：进行高血糖可以诱导血管内 皮损伤； 血管内皮损伤在早期糖尿病心血管病发病机制中 起着重要作用； 抗氧化剂可以纠正急性高血糖诱导的内皮功能损伤； 提示：急性高血糖通过氧化应激途径诱导内皮功能受损， 抗氧化应激治疗对血管内皮具有保护作用。 一、氧化应激是机体内一种不平衡的状态。 由于自由基（特别是氧自由基）生成过多和/或 抗氧化防御机制的下降， 导致活性氧类（ROS）的稳态水平上升，即形成氧化应激。 当即体内活性氧的生成超出了生理范围和机体的抗氧化能力时, 则会造成细胞的损伤。 二、氧化应激与糖尿病的发生发展有密切关系， 而伴随糖尿病而来的高血压，高脂血症等代谢综合症 又可以加重氧化应激的程度， 三、有研究提示氧化应激对于胰岛B细胞的损伤作用 是糖尿病的发病机理之一。 糖尿病与氧化应激 糖尿病的血管并发症与内皮功能紊乱直接相关, 氧化应激是导致影响内皮功能的重要使动因素。 氧化应激是机体内氧化与抗氧化作用失衡， 倾向于氧化的状态， 活性氧类（ROS） 自由基(Free radicals) 氧化应激的靶分子：脂类，蛋白，核酸等大分子的损伤作用， 直接影响内皮的功能。 糖尿病与氧化应激 活性氧类（ROS reactive oxygen species） : 由氧化还原反应产生的，在分子组成上含有氧 的一类化学性质非常活泼的物质总称。 包括：氧自由基，过氧化物（如过氧化氢， 脂质过氧化物等），激发态氧。 其中一些ROS本生就是自由基， 如超氧阴离子，羟基自由基等， 而其他一些如过氧化氢，亚硝酸盐等没有不成对电子， 但具有很强的氧化性，并且易于反应产生自由基。 糖尿病与氧化应激 自由基：原子的最外层电子轨道上含有一个或多个 非配对电子的状态。是一种非稳定状态， 例如：( H .)，含一个核外电子，是最简单的自由基。 当从周围分子中获得另一个电子时恢复稳态。 结果，使其他分子形成非配对电子， 使其反应活性增加 一旦产生一个自由基，接着发生一系列电子传递事件 氧化还原反应（redox reactions) 自由基的种类： 氧自由基 ：为非脂性自由基，如超氧阴离子O 2 -， 羟自由基OH，单线态氧O2-等； 脂性自由基，烷自由基R , 烷氧基RO ,烷过氧基ROO; 一氧化氮NO. 糖尿病与氧化应激 高血糖时活性氧类的来源： 1）线粒体呼吸作用， 2）环加氧酶和脂加氧酶的催化，细胞色素P450， 3）黄嘌呤氧化酶，NADH/NADPH氧化酶， NOS，过氧化氢酶， 4）葡萄糖自动氧化，糖集终末产物形成和 AGEs与其受体的结合， 5）多元醇通路中底物流量的增加， 6）花生酸类代谢途径的激活等。 糖尿病与氧化应激 Glucose utilisation and generation of oxidants in the endothelial cell GLUT 1 Cell membrane Cytosol Glucose Reactive oxygen species Glycolysis Mitochondria Electron transport Chemiosmosis NADH FADH2 ATP GLUT 1 GLUT 1 Krebs cycle Nature 2000 Stimulus Cell death (apoptosis) ROH ROOH GPx GSSG GR GSH Neutrophil O2 XO O2 SOD H2O2 Fe NF-kB H2O2 SOD O2 O2 IL-8 TNF Adhesion molecules Neutrophil NADPH oxidation Endothelial cells SOD OH 中药复合制剂抗高葡萄糖诱导的 内皮细胞损伤研究 l高糖抑制内皮细胞生长 l中药和NAC预防高糖引起的内皮细胞生长抑制 l中药有抗高糖引起的内皮损伤的作用 l其机制与抗氧化应激有关 高鑫，李欣 等 复旦大学附属中山医院内分泌科 正常葡萄糖浓度24小时培养前后细胞形态 5mmol/L葡萄糖 初始培养 5mmol/L葡萄糖 24小时培养 （放大200倍，未加绿色滤光镜） （放大200倍） 高鑫，李欣 等 复旦大学附属中山医院内分泌科 高葡萄糖浓度24小时培养前后细胞形态 20mmol/L葡萄糖 初始培养 20mmol/L葡萄糖 24小时培养 （放大200倍，未加绿色滤光镜） （放大200倍） 高鑫，李欣 等 复旦大学附属中山医院内分泌科 各组24小时培养细胞比较 5mmol/L葡萄糖 20mmol/L葡萄糖 20mmol/L葡萄糖中药 20mmol/L葡萄糖NAC 高鑫，李欣 等 复旦大学附属中山医院内分泌科 中药复合制剂对高糖培养的 SD大鼠肺微血管内皮细胞基因表达谱的影响 高鑫，李欣 等 复旦大学附属中山医院内分泌科 用寡核苷酸基因芯片技术 研究： 中药对急性高糖诱导的大鼠微血管内皮细胞 基因谱表达影响 分组： 正常葡萄糖 高葡萄糖中药 高葡萄糖NAC 观察： 微血管内皮基因表达谱差异； 分析比较中药于NAC表达基因的异同， 探讨中药是否具有抗氧化应激作用。 中药复合制剂对高糖培养的 SD大鼠肺微血管内皮细胞基因表达谱的影响 结 果 基因芯片分析结果表明（差异表达在2倍以上的基因）： 高糖组较正常组下调基因22个、上调11个； 高糖加中药组较高糖下调基因36个、上调21个； 高糖加NAC组较高糖组下调基因37个、上调9个； 高糖加中药组和高糖加NAC组共同下调基因41个、上调基因9个 初步分析：中药和NAC共同上调基因中有2个与氧化应激 有关的基因，H+-ATP合成酶和细胞色素b5。 结论： 中药复合制剂可恢复高葡萄糖诱导的 内皮细胞增殖抑制， 并改变高糖环境下内皮细胞基因表达谱， 推测该中药制剂可能通过抑制氧化应激反应的有关 途径，保护内皮细胞，改善糖尿病血管病变。 中药复合制剂对高糖培养的 SD大鼠肺微血管内皮细胞基因表达谱的影响 糖尿病并发症的防治应从何时开始？ 血管病变与糖尿病的关系？因 果？ 微血管病变可能是2型糖尿病的致病原因假说 证 据： 1. 在糖尿病高危人群中 （IGT和2型糖尿病一级亲属）已经存在 皮肤、骨骼肌内血流异常和微血管反应受损 2. HOPE Study 结果(ACEI) 3. LIFE Study 结果提示(ARb)，阻断RAS系统， 改善糖尿病肾病，对微血管病变有益； 同时发现对2型糖尿病有预防作用 Incidence Of The Secondary And Other Outcomes (HOPE) LIFE Study Results l以氯沙坦为基础的降压治疗相比以阿替洛尔为基础的治疗方案：， 进一步： 减少心血管患病和死亡 (13%) 减少脑卒中 (25%) 减少新发生糖尿病 (25%) 左心室肥厚消退更明显 更好的治疗耐受性，由于不良反应而中断治疗的事件明显 低于阿替洛尔组 相同的降压水平 研究背景 假说：微血管病变可能在2型糖尿病的发病机理 中起到重要作用 证据：缺少前瞻性的临床证据 JAMA. 2002;287:2528-2533 Retinal Arteriolar Narrowing and Risk of Diabetes Mellitus in Middle-aged Persons 中年人视网膜动脉狭窄和糖尿病患病危险性的关系 研究目的 1、将视网膜动脉狭窄作为微血管损伤的标志， 2、研究健康中年人视网膜动脉狭窄程度与 2型糖尿病发病率的关系 动脉粥样硬化风险社区研究（The Atherosclerosis