抗体检测标准操作程序 ppt课件

HIV抗体检测标准操作程序 天津市卫生防病中心 夏建晖 全国艾滋病检测技术规范（2004年版） 共10章 * 样品的采集和处理 * HIV抗体检测 * HIV核酸定性检测 * HIV RNA定量测定（病毒载量测定） * CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞检测 * HIV抗原检测 * 艾滋病实验室安全防护和职业暴露预防 * 艾滋病实验室质量管理 * 艾滋病实验室质量考评办法 * HIV诊断试剂临床质量评估方案 HIV抗体检测标准操作程序 检测程序： 生物安全： 试验操作： 室内质控： 全国艾滋病检测技术规范中的许多内容，广泛适用于临床实验室。 HIV抗体检测程序:初筛-复检-确认 复检： 对初筛呈阳性反应的样品用原有试剂 和另外一种不同原理或不同厂家的筛 查试剂重复检测。如两种试剂复测均 呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性； 如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送 艾滋病确认实验室进行确认。 HIV抗体检测程序:初筛-复检-确认 重新采血，将两份标本一同送检HIV抗体复检化验单见技术规范附表2 见技术规范附表2 HIV抗体检测程序:现象一 出现HIV抗体筛查阳性时，有的实验室仅是通知受 检者到确认实验室采血检测，不向确认实验室送原 血样和HIV抗体复检化验单。这样是不符合要求的。 筛查阳性时，必须将原血样和HIV抗体复检化验单 送确认实验室。最好是在送样单上注明联系电话， 以便及时反馈结果。 HIV抗体检测程序:现象二 出现HIV抗体筛查阳性时，有的单位过度 重视，在没得到确认结果时，将受检者作 为HIV感染者对待，造成不必要的恐慌。 天津目前一般人群的HIV感染率在万分之一左右 ，尚属于低发区。 在术前、产前筛查中会出现许多筛查阳性、经确认为阴性的情况。 出现HIV抗体筛查阳性时，实验室没有必要扩大知情范围，及时送检 。 缩小知情范围，可能有助于减少恐慌。 HIV感染者，与乙肝感染者的消毒处理措施没有什么差别。 就传染性而言，乙肝病毒更为凶险 生物安全 实验室生物安全通用要求国家标准已正式发布， 并于2004年10月1日正式实施。 规定了实验室生物安全管理和实验室的建设原则 同时还规定了生物安全分级、 实验室设施设备的配置、 个人防护和实验室安全行为等方面内容。 该标准解决了实验室安全管理存在的隐患。 生物安全 全国艾滋病检测技术规范 第二章HIV抗体检测中提出 “HIV抗体检测实验室应符合实验室生物安全通用要求对II级生物安 全实验室（BSL-2）的各项要求。” 第七章艾滋病实验室安全防护和职业暴露预防中进一步指出 “艾滋病血清学检测（包括筛查和确认实验室）、免疫学和核酸检测应 在符合级生物安全实验室（BSL-2）要求的艾滋病检测实验室中进行。 ” 生物安全 级级生物安全实验实验 室，是对临对临 床实验实验 室的普遍要求， 是临临床实验实验 室发发展的方向。 一份未知样样品，无论检测项论检测项 目如何，都具有相同的潜在传传 染性。安全投入不足，将成为为今后临临床实验实验 室的重要隐隐患 生物安全 生物安全 生物安全 危害等级II（中等个体危害，有限群体危害） 能引起人或动物发病，但一般情况下对健康工作者、群体、家畜 或环境不会引起严重危害的病原体。实验室感染不导致严重疾病 ，具备有效治疗和预防措施，并且传播风险有限。 危害等级III（高个体危害，低群体危害） 能引起人类或动物严重疾病，或造成严重经济损失，但通常不能 因偶然接触而在个体间传播，或能使用抗生素、抗寄生虫药治疗 的病原体。 级生物安全实验室设施和设备要求 (实验室生物安全通用要求) u 实验室所用设施、设备和材料（含防护屏障）均应符合国家相关的标准和要求 u BSL-2 实验室 满足BSL-1的要求。 实验室门应带锁并可自动关闭。实验室的门应有可视窗。 应有足够的存储空间摆放物品以方便使用。在实验室工作区域外还应当有供长期使用的存储空间。 在实验室内应使用专门的工作服；应戴乳胶手套。 在实验室的工作区域外应有存放个人衣物的条件。 在实验室所在的建筑内应配备高压蒸汽灭菌器，并按期检查和验证，以保证符合要求。 应在实验室内配备生物安全柜应在实验室内配备生物安全柜( (避免的危害：气溶胶和喷溅避免的危害：气溶胶和喷溅) )。 应设洗眼设施，必要时应有应急喷淋装置。 应通风，如使用窗户自然通风，应有防虫纱窗。 有可靠的电力供应和应急照明。必要时，重要设备如培养箱、生物安全柜、冰箱等应设备用电源。 实验室出口应有在黑暗中可明确辨认的标识。 生物安全 生物安全柜生物安全柜( (避免的危害：气溶胶和喷溅避免的危害：气溶胶和喷溅) ) 确定可能形成传染性气溶胶或溅出物的实验过程 包括:离心、研磨、匀浆、剧烈震荡或混匀、超 声波破裂、开启装有传染源的容器(容器内部的 压力可能与大气压不一致)、动物鼻孔接种、从 动物或胚胎卵采集感染组织。 生物安全 生物安全 生物安全 生物安全 生物安全 对于已经建成的实验室，由于格局无法改变，需要提醒大家注意: 应努力将工作区与休息区分离，并尽可能满足生物安全实验室的其它要求。 个人防护装备：手套与实验室工作服 手套：所戴手套无漏损。 戴好手套后可完全遮住手及腕部， 如必要，可覆盖实验室长罩服或外衣的袖子（一次性袖套）。 在撕破、损坏或怀疑内部受污染时更换手套。 手套为实验室工作专用。在工作完成或中止后应消毒、摘掉并安全处置。 实验室工作服:离开实验室区域之前应脱去防护服。 当具潜在危险的物质极有可能溅到工作人员时，应使用塑料围裙或防液体的长罩服。 生物安全 生物安全 实验操作中的生物安全注意事项： 进实验室前要摘除首饰，修剪长的带刺的指甲，以免刺破手套。长发应束在 脑后。在工作区内不应配带戒指、耳环、腕表、手镯、项链和其他珠宝。 l 进入实验室应穿隔离衣，戴手套。必要时（手套质量欠佳或接触物传染危 险性大），则应戴双层手套和防护眼镜。 严禁在艾滋病实验室内进食、饮水、吸烟和化妆。 不用戴手套的手触摸暴露的皮肤、口唇、眼睛、耳朵和头发等。 食品、饮料及类似物品只应在指定的区域中准备和食用。食品和饮料只应 存 放于非实验室区域内指定的专用处。冰箱应适当标记以明确其规定用途。 禁止在工作区内使用化妆品和处理隐形眼镜。 l 离开实验室前必须脱去隔离衣，并洗手。 工作完毕，脱去手套后洗手，再脱去工作衣，用肥皂和流动水洗手。 HIV抗体检测技术要求 建立标准操作程序 禁止肉眼判读！ 保证酶标仪，洗板机正常运转 保证加样器准确 选择高质量的与加样器配套的TIP头 使用有效期内的试剂 保证样品质量 酶联免疫吸附试验（ELISA） ELISA是一种敏感性高、特异性强、重复性好的实验 诊断方法，由于其试剂稳定、易保存、操作简便、结果判 断较客观等因素，以及既适宜于大规模筛查试验又可以用 于少量标本的检测，既可以做定性试验也可以做半定量分 析等优点，已广泛应用于微生物学、寄生虫学、肿瘤学和 细胞因子等领域。ELISA的影响因素较多，加强 质量管理才能充分发挥其方法学的优点。 HIV抗体检测中常规使用ELISA试验 酶联免疫吸附试验（ELISA） 1971年Engvall等人把免疫组化的EIA技术 应用于临床检验发展为ELISA技术，酶联免 疫吸附剂试验。 特点 ： 在聚苯乙烯固相载体表面组装免疫活性物质 形成“免疫吸附剂” 酶标记免疫活性物质，化学显色剂进行信号 放大 ELISA试验结果判断 在进行ELISA试验时，要严格按照试剂 盒说明书操作。按照说明书中的方法，计 算临界值（Cutoff值）。 样品OD值临界值 阳性 样品OD值 临界值 阴性 注意事项 n保证实验室温度，室温过低有可能造成吸光度 值偏低。 n ELISA试验的敏感性很高，如果操作不当很容 易出现非特异性反应。在操作过程中，尤其应 注意洗涤过程。洗涤彻底可减少假阳性的机会 。 n进行ELISA试验时，必须用酶标仪进 行测定，不得目测结果。使用酶标 仪时，要避免酶标孔内产生气泡， 影响判读结果。 n初筛阳性标本应做进一步确认。 n灰区 灰区 n 定义：通常把在临界值(Cutoff)下10 的OD值标本定为灰色带反应。 n 处理原则：对这类标本包括OD值等于 或略高于Cutoff值的标本，建议 进行复检或用其他方法(不同类 型的筛查试剂或确证试剂)进行 复检，这将有助于发现早期感染 者。 ELISA操作中的注意事项 n试剂准备 n加样 n温育 n洗板 n显色 n比色 试剂准备 n从冰箱中取出的试剂，待温度与室温 平衡后使用； n所用蒸馏水或去离子水应保证质量。 加 样 n加样不可太快，避免加在孔壁上部，不可 溅出和产生气泡。 孵育 ELISA孵育：水浴箱？干燥恒温箱？ n由于水的比热大于空气的，水浴箱里的各部分温差要小于恒温箱中的 。 n水浴箱也有他的不足出就是有水气对比色有影响 恒温箱没有水气，不会对杯底有干扰 孵育时，一定要用胶纸封将板子封好，而且不要叠放 洗 板 n洗板液一般为含0.05% Tween20的中性PBS。 nTween20为一种非离子去垢剂，既含亲水基团， 也含疏水基团。 n洗涤作用机理，借助其疏水基团与固相上蛋白的 疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白与固相的吸 附，同时在其亲水基团与液相中水分子的结合作 用下，促使蛋白质脱离固相而进入液相 ELISA试验中的疑问：洗板 洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，却也决定着实验成败 ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。 通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物 质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质 。 聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应 把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。 可以说在ELISA操作中，洗涤是最关键环节之一，应引起操作 者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。 ELISA试验中的疑问 洗板：洗板机? 手工? n只要操作合乎要求，都能得到正确的结果。 n最后要用吸水纸彻底拍干，方能得到好的结果。 ELISA试验中的疑问 洗板机：更为科学合理，效率高 n加强日常保养、维护，预防洗板机堵孔和机械故障 。 n合理设置洗板机参数，避免孔间交叉污染，减少残留液 （冲洗针位置调整好） （U or 平底） n出现问题及时与厂家联系 ELISA试验中的疑问 手工洗板：如何避免孔与孔之间的交叉污染。 第一次加液加8成（因为此时候污染的机会也最大）， 甩掉液体后立即扣干， 以后按照说明书要求进行洗板。 显 色 n加入底物A和B后，应振荡混匀 n当底物为OPD时，显色反应应避光进行 n一般商品试剂盒显色反应条件为37或室 温反应1530 min。（以试剂说明为准） 显 色 n显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催化 无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间 仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可 保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强 。 n各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可 用特定的波长（450nm）测读吸光值。 比 色 n加酸终止显色反应后，比色测定前应振荡混匀 n 测定时，要注意酶标仪的波长是否已调至合适 n 比较好的酶标仪可选择单波长或双波长比色测定 ，所谓双波长比色，即在敏感波长（此时对所显 色具最大光吸收）如450 nm和非敏感波长（所测 得的光吸收为微孔板上的划痕、污迹以及指纹等 所致），最后从仪器得到的读数为在敏感波长测 得的吸光度与非敏感波长测得的吸光度之差。 比 色 n酶标仪的可测范围视各酶标仪的性能而不同。 n普通的酶标仪在0.0002.000，新型号的酶标仪 上限拓宽达2.900，甚至更高。超出可测上限的A 值常以“*”或“over”或其它符号表示。 n应注意可测范围与线性范围的不同，线性范围常 小于可测范围，比如某一酶标仪的可测范围为 0.0002.900，而其线性范围仅0.0002.000， 这在定量ELISA中制作标准曲线时应予注意。 n酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室 温宜在1530，使用前先预热仪器15-30分钟， 测读结果更稳定。 ELISA试验中假阳性产生原因？ ELISA试验中的疑问：假阳性产生原因？ 样品加错位置，标本搞错 洗板机设置不当，洗板时洗涤液溢出，污染其它孔 洗板机内部管道有真菌生长 实验中，实际孵育时间过长，温度过高 待测标本溶血或含有血细胞。 待测标本长菌或其它原因混浊。 不明原因的假阳性 假阳性产生原因？ 标本溶血 n注意避免出现严重溶血。 n血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过 氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶 的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓 度较高，则其就很容易在温育过程中吸附 于固相，从而与后面加入的HRP底物反应 显色。 假阳性产生原因？标本被细菌污染 n细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对 抗原抗体等蛋白产生分解作用 n细菌的内源性酶如大肠杆菌的-半乳糖苷酶 本身会对用相应酶作标记的测定方法产生 非特异性干扰。 假阳性产生原因？标本贮存时间过长 n标本在28下保存时间过长，IgG可聚合 成多聚体，在间接法ELISA测定中会导致本 底过深、甚至造成假阳性。 n血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2 8下保存一周，如为有菌操作，则建议 冰冻保存。样本的长时间保存，应在 70以下。 假阳性产生原因？标本凝固不全 n血液采集后，如收集管中无促凝剂和抗凝剂，则 血液通常在半小时后开始凝固，1824h完全凝固 。日常检验中，常在血液还未开始凝固时即离心 分离血清，此时因血液没有完全凝固，离出的“血 清”并非为完全的血清，其中仍残留部分纤维蛋白 原，如将其加入微孔中，在ELISA测定过程中仍 可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性 结果 n血液标本采集后，应使其充分凝固后再分离血清 ，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管 中加入适当的促凝剂。 冰冻保存标本避免反复冻融 n反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中 的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假 阴性结果。 影响ELISA测定的因素 n试剂盒的因素： 妥善保存试剂，在有效期内使用 n试验操作 形成良好的操作习惯：加样时应将所加物加在ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出， 不可产生气泡。 严格按试剂说明书操作:空白孔不加样品和酶标试剂 操作过程中集中精力：避免加样错误 什么是“花板” n空白和阴性，阳性对照以及室内质控孔结果正常 ，而标本的阳性率很高，每板除对照孔外，有时 阳性高达10孔之多，而大多数阳性标本都出现弱 阳性结果。这就是试验中所说的“花板”问题。 n这种现象对检验结果的正常判断造成了很大的影 响。 “花板”产生的原因： n检测过程存在瑕疵： 首先考虑检测过程中的操作是否存在问题。 通过完善的质量控制措施，可以查找可能存在的操作 问题，或排除“操作”造成“花板”的可能。 n2 试剂质量问题： 用户，有权利反应产品质量问题，要求厂家提供服务。 反映问题时要有根据，至少应该能够证明主要问题在于试剂质量 在检测过程中采取措施预防“花板” q1 抽取样本时应抽出足够检验量的血液标本，按比例加抗凝剂 ，便于离心，得到足够的血清（血浆）。 q2 血液标本应置于室温下12h，使血液凝固收缩，然后离心 检测或让血液过夜后再检测。这样才能使得血液充分收缩，让 标本中的非特异性物质所致的假阳性率降至最低。 q3 检测之前，加大离心转速，尽量延长时间，使血细胞和纤维 蛋白充分沉淀，让血细胞与血清彻底分离。 q4 加样时不能加入红细胞或纤维蛋白，要按照操作说明书去做 ，否则会影响实验结果。 q5 封板温育时，各孔一定要封严，防止阳性标本的液体蒸发， 产生周边现象从而导致“花板”的出现。 q6 用洗板机洗板时应防止针口有纤维蛋白或异物，这些异物在 洗板的过程中易产生拖带现象而导致“花板”的出现。 提 问 n 某实验室将若干HIV抗体初筛阳性标本，送确认实验室检 测，确认结果为阴性。此初筛实验室检测质量存在问题吗 ？ n 某HIV抗体初筛一年的检测量在30005000份，所有试 验均未出现呈阳性反应的标本，连续多年。此初筛实验室 检测质量存在问题吗？ n 某实验室在使用某种ELISA试剂进行HIV抗体初筛时，多 次出现“花板”现象。此初筛实验室检测质量存在问题吗？ 在缺乏有效的实验室质量控制和质量管理的情况下， 不能排除实验室检测质量存在问题的可能。 n 某实验室将若干HIV抗体初筛阳性标本，送确认实验室检 测，确认结果为阴性。此初筛实验室检测质量存在问题吗 ？ n 某HIV抗体初筛一年的检测量在30005000份，所有试 验均未出现呈阳性反应的标本，连续多年。此初筛实验室 检测质量存在问题吗？ n 某实验室在使用某种ELISA试剂进行HIV抗体初筛时，多 次出现“花板”现象。此初筛实验室检测质量存在问题吗？ 全国艾滋病检测技术规范（2004年版） 第八章 艾滋病实验室质量管理 HIV抗体检验质量保证 质量控制（quality control） 对医学检验来说是实施医学检验质量保证 中的一部分，主要由实验室来完成，将质 控物和待测标本一起进行实验操作，从控 制值了解分析过程的质量情况，同时使用 一些统计方法进行归钠和分析，严格控制 外来误差，所以质量控制又被称为过程质 量控制或统计质量控制。 质量控制（quality control） 在理论和实践上，又可分为两个主要部分： n室内质量控制：用来评价实验室批间精密度 n室间质量评价/能力验证(Proficiency Testing) 目的在于帮助实验人员发现检验的准确度，以利提高实验室常规工作质量。 每年的血清考评与能力验证本质是相同 由于考评结果具有惩罚性，考核样品经常受到特殊照顾，并且存在互通结果的 情况。作为组织者，为了使考评更为公正，不得不对样品组成、样品号顺序进 行组合，减少互通结果的情况，从而偏离了能力验证的目标。 室内质量控制 (internal quality control,IQC) 全国艾滋病检测技术规范中要求：在每次实验中必须包含有内 部对照质控血清和外部对照质控血清。 n内部对照质控血清指试剂盒内提供的阳性和阴性对照血清。 内部对照是质量控制的基础。每一次检测必须使用内部对 照，而且只能在同批号的试剂盒中使用。 n外部对照质控血清是为了监控检测的重复性和稳定性以及试 剂盒批间或孔间差异而由实验室设置的一套对照血清，包 括强阳性、弱阳性和阴性对照血清。也可