动物实验室的生物安全防护课件

实验动物实验室实验动物实验室 的生物安全防护的生物安全防护 病毒学国家重点实验室 武汉大学医学病毒学研究所 主要内容主要内容 实验动物的护理和使用原则实验动物的护理和使用原则 实验过程的行为规范实验过程的行为规范 实验动物使用程序和要求实验动物使用程序和要求 动物安全实验室设施与防护要求动物安全实验室设施与防护要求 一、实验动物的护理和使用原则一、实验动物的护理和使用原则 实验动物是经过科学育种、繁殖生产，遗传背景 清楚，携带的微生物状况明确，并对其生态学、 生物学、生物化学、形态结构了解的特殊动物， 因此，对其护理和使用也有严格的要求。 实验动物饲养和使用应遵守国家相关法律和规定 应明确使用实验动物的理由和目的 明确实验所使用动物的种类和数量，动物的数量应满足统计学的要求 。 完善操作规程，避免或减轻因实验对动物造成的不适和痛苦。包括使 用适当的镇静、镇痛或麻醉方法；禁止不必要的重复操作 严格按程序实施实验后动物的处理，包括麻醉、止痛、实验后的护理 或用麻醉方法处死 实验过程中要求保证实验动物的良好生活条件，包括饲养环境、符合 需求的饲料及细心的护理等 研究人员和实验动物操作人员应接受实验动物的基本知识和操作技能 等方面的培训 使用过程中要求保证周围环境和实验人员的安全。 实验动物的护理和使用原则实验动物的护理和使用原则 二、动物实验过程的行为规范二、动物实验过程的行为规范 物理限制物理限制 手术操作手术操作 饮食的限制饮食的限制 废弃物和尸体处理废弃物和尸体处理 1.1.物理限制物理限制 指在实验过程中包括检查、收集标本指在实验过程中包括检查、收集标本 、给药、治疗或实验操作等，用手或工、给药、治疗或实验操作等，用手或工 具限制动物活动的过程。具限制动物活动的过程。 限制的工具不能作为常规的饲养工具。限制的工具不能作为常规的饲养工具。 工具的设计应合理，不要仅考虑实验的便利，主要考虑工具的设计应合理，不要仅考虑实验的便利，主要考虑 尽量减少动物的不适，避免伤害。尽量减少动物的不适，避免伤害。 尽量减少限制的时间，以达到实验目的为基准。尽量减少限制的时间，以达到实验目的为基准。 在限制过程中，如果发生损伤或严重的行为改变，应暂在限制过程中，如果发生损伤或严重的行为改变，应暂 停或禁止限制，并给予处理或治疗。停或禁止限制，并给予处理或治疗。 保证实验人员和周围人员的安全。保证实验人员和周围人员的安全。 物理限制的主要原则和要求物理限制的主要原则和要求 有些实验需要对动物进行手术，即打开或刺穿动物的身体有些实验需要对动物进行手术，即打开或刺穿动物的身体 ，对动物的身体或生理机能产生较大的损害，同时，对动物的身体或生理机能产生较大的损害，同时，实验人实验人 员也容易被血液员也容易被血液/ /体液污染或被器械、针头刺伤，存在潜在体液污染或被器械、针头刺伤，存在潜在 生物污染的威胁，生物污染的威胁，因此必须做到因此必须做到 操作一定要使用适当的镇静、镇痛或麻醉方法。操作一定要使用适当的镇静、镇痛或麻醉方法。 禁止不必要的重复操作。禁止不必要的重复操作。 不提倡利用一个动物进行多个手术实验，但是，为充分利用不提倡利用一个动物进行多个手术实验，但是，为充分利用 动物资源，经动物伦理委员会许可，在可能的条件下可以实动物资源，经动物伦理委员会许可，在可能的条件下可以实 施。施。 严格实验操作规程，防止发生血液严格实验操作规程，防止发生血液/ /体液外溅和针刺伤，避体液外溅和针刺伤，避 免生物污染。免生物污染。 手术后的动物、标本以及所用器具材料等必须按规定程序妥手术后的动物、标本以及所用器具材料等必须按规定程序妥 善处置。善处置。 2.2.手术操作手术操作 实验用动物原则上要求随时饮食，如果一些实验需实验用动物原则上要求随时饮食，如果一些实验需 要动物限制食物或水的摄入量，应保证动物存活所需要动物限制食物或水的摄入量，应保证动物存活所需 要的最低需求量要的最低需求量 3.3.饮食的限制饮食的限制 1. 1. 血液和体液标本的处理血液和体液标本的处理 用于抗体、抗原、病原微生物、生化指标等检查用于抗体、抗原、病原微生物、生化指标等检查 的血液和体液，按照要求进行处理并检测，检测后的的血液和体液，按照要求进行处理并检测，检测后的 标本经标本经121121，30min30min高压消毒处理。高压消毒处理。 2. 2. 动物脏器组织的处理动物脏器组织的处理 动物器官组织，尤其是用于病原微生物分离的组动物器官组织，尤其是用于病原微生物分离的组 织按照标准程序进行处理；用于病理切片的组织，均织按照标准程序进行处理；用于病理切片的组织，均 需要经过需要经过甲醛固定甲醛固定后再进行切片。剩余的组织经后再进行切片。剩余的组织经 121121，30min30min高压消毒高压消毒处理。处理。 4.4.废弃物和尸体处理废弃物和尸体处理 3动物尸体的处理 安乐处死后的动物尸体，取材完毕后，经121 30min高压 灭菌处理后，集中送环保部门处理。动物生物安全三级（ABSL- 3）实验室及以上级的实验室的感染动物尸体需经室内和双扉两 道高压灭菌，才能移出实验室。 4. 动物咽拭子的处理 用于病原分离和PCR检测的咽拭子，按照各自的要求处理后 ，进行病毒分离和PCR检测，剩余的标本经121，30min高压消 毒处理。 5. 病原分离培养物的处理 病原分离的培养物，不论是阳性还是阴性结果，均需经 121，30min高压消毒处理。 三、实验动物使用程序和要求三、实验动物使用程序和要求 1.1.实验动物的基本使用程序和要求实验动物的基本使用程序和要求 实验室如需要使用实验动物，应首先向生物安全和伦理 委员会提出申请，填写申请表 使用实验室得到认可后，根据申请表中申请的动物种属 和数量，安排实验动物的饲养和使用。 实验动物必须在指定的区域内饲养和使用，禁止在实验 室饲养动物。实验操作结束时，动物须返回指定的饲养 区域内，不能在实验室内过夜。 动物实验应在实验室内指定的区域进行。 实验动物使用申请表 批 准 号：_ 批准日期：_ 有效日期：_ 一、申请请者基本情况 科室课题负责课题负责 人 电话电话传传真E- mai l 课题课题 名称 申请请目的初次申请请， 延长长 或 修改原申请请（原申请请批准号_） 二、所需实验动实验动 物 种类类年 龄龄 体重/大/小性 别别 来源 饲饲养场场所实验实验 场场所 数量_ + _ + _ = _ （第一年） （第一年） （第一年） （总计总计 ） 三、动动物的运送（是否需要运送，如果需要，说说明运送的路线线和使用工具等） 四、研究的目的（简单简单 描述研究的目的，和该该研究对对人类类，或动动物，或科学研 究的贡贡献） 五、使用实验动实验动 物的原理（解释释使用动动物的原理；阐阐述选择动选择动 物属种和数量的 依据） 六、描述动动物实验实验 的设计设计 和操作程序（具体包括：注射或接种的物质质、剂剂量、 部位、体积积和针针次等；血标标本的收集体积积、部位、方法、时间时间 ；非手术术的操作 步骤骤（手术术操作见见第七项项）；限制动动物的方法；放射性同位素的使用剂剂量和时时 间间；识别动识别动 物的方法，如耳朵标签朵标签 、饲饲养笼笼的卡片等；对动对动 物的损损害，如疼痛 、腹水等；实验终结标实验终结标 准，如肿肿瘤的大小、体重降级级的百分比、行为为学的改变变 、中毒症状等，及何时执时执 行安乐乐死。） 七、手术术操作程序（如需要，请请填写本目录录） 具体操作步骤骤 手术术操作人及培训训情况 手术执术执 行的地点 实验实验 后的护护理 是否在同一动动物上进进行多个手术术 否 是，具体说说明： 八、导导致疼痛的分类类 实验动实验动 物的数量 第一年 第二年 第三年 A 轻轻微，或一过过性，或无疼痛 _ _ _ B 有疼痛，但能够够解除 _ _ _ C 不能缓缓解的疼痛 _ _ _ 九、麻醉，镇镇痛（对对第八项项目中的B或C类动类动 物，应说应说 明使用麻醉或镇镇痛的方法 ，包括麻醉剂剂的名称、剂剂量、使用方式和时间时间 ） 十、实验终结实验终结 后，如何终终止动动物的生命（麻醉剂剂的名称、剂剂量和使用方法）和 如何处处理动动物尸体 涉及感染性材料的操作要在生物安全柜中进行，并防止泄露 在安全柜底面。操作包括感染动物的解剖、组织的取材、采 血及动物的病原接种。 动物笼具在清洗前先做消毒处理。 污物、一次性物品需放入医疗废物专用垃圾袋中，经高压灭 菌后方可拿出实验室。 动物尸体用双层医疗废物专用垃圾袋包裹后，放入标有动物 尸体专用的容器中，用消毒液喷雾容器表面后，运至解剖区 域剖检。 生物安全柜使用后应用消毒液擦拭、揩干。 2.2.含有感染性材料的动物实验要求含有感染性材料的动物实验要求 废液需按比例倒入有消毒液的桶中，倒入时需沿容器壁轻倒 并戴眼罩，防止溅入眼中。 如果有感染性物质溅到生物安全柜上、地上以及其他地方， 应按“菌，毒外溢在台面、地面和其他表面”处理。 每天工作结束时，应用消毒液擦拭门把手和地面等表面区域 。 废物放入高压灭菌器内时需同时粘贴指示条，物品移出前观 察指示条是否达到灭菌要求。颜色不符时需重复高压灭菌。 高压灭菌器需每月做灭菌测试一次，并作记录。 3.3.小动物的饲养小动物的饲养 小动物主要指小鼠、大鼠、豚鼠等啮齿类动物，其饲 养应遵循下列原则： 使用动物必须按国家标准或实验特殊要求检验合格，充 分准备后进入系统，饲养人员应按实验设施规定程序要 求进入系统。 及时观察动物饮食、精神状况，有无异常表现，患病或 死亡。 动物应可自由进食、饮水。定期检查水、料是否充足并 及时补给。同时保证其他饲养条件完备。 4.4.大动物饲养大动物饲养 大动物主要指狗、猪及非人类灵长类动物等 使用动物必须按国家标准或实验特殊要求，检验合格，充分准 备后方可进入动物实验室。 应将每只动物日摄取总量分批次喂给，以保证动物的进食量和 减少浪费。 应经常检查饮水装置，及时补充不足。 动物饲养区域应每天打扫，保持清洁，每周将地面消毒三次。 喂给瓜果、蔬菜等须洗净消毒。禁止喂给腐烂发霉不洁的食物 ，饮水要清洁。 对饲喂动物所用的小推车、食物、水容器等用品每周进行两次 消毒。 室内光照，要求明暗各12h自动交替。 5.5.动物的检疫动物的检疫 实验动物进入检疫室 在检疫室的缓冲间内，用75%酒精 喷洒动物的外包装进行消毒，打开紫外灯照射1015min 。 将经上述处理的动物移入检疫室，根据要求进行检疫。 各动物的检疫期不同，大动物为2周，小动物为1周。 在检疫期内观察动物的精神状态、食欲、营养状况、排泄 物等，如有任何异常，动物不得用于实验，应退出动物检 疫室。 检疫合格的动物经适当处理后由缓冲间或物流通道进入动 物实验室。 6.6.动物实验的有关操作动物实验的有关操作 1. 给药 根据实验要求，按不同的动物，不同途径给药。灌胃 和静脉注射。对接种了高致病性病原微生物的动物，尤其 是大动物，将动物麻醉后方可进行灌胃或静脉注射。小动 物灌胃或静脉注射可根据情况选择是否麻醉，静脉注射时 需使用固定器。 2. 采样 原则上活检时应对动物进行麻醉。对接种了病原体的 大动物进行采血或体检时，要求将动物麻醉。对小动物进 行灌胃、注射和采血时，可不麻醉动物，但要防止动物咬 抓。 四、动物生物安全实验室设施四、动物生物安全实验室设施 与防护要求与防护要求 病原微生物的传播途径病原微生物的传播途径 病原微生物标本使用的容量和浓度病原微生物标本使用的容量和浓度 病原微生物接种途径和方法病原微生物接种途径和方法 病原微生物能否和以何种途径被排出体外病原微生物能否和以何种途径被排出体外 病原微生物的总体危险程度病原微生物的总体危险程度 对于使用的动物，需要考虑的因素包括对于使用的动物，需要考虑的因素包括 动物的自然特性，包括动物的攻击性和抓咬倾向性动物的自然特性，包括动物的攻击性和抓咬倾向性 自然存在的体内外微生物和寄生虫等自然存在的体内外微生物和寄生虫等 易感的动物性疾病易感的动物性疾病 动物接种病原微生物后可能产生的结果等动物接种病原微生物后可能产生的结果等 动物实验室所使用微生物的危害评估应考虑的因素 实验动物设施实验动物设施 实验动物设施依其使用功能的不同，划分为各 个功能区域，各自有不同的要求。按照“实验动 物环境与设施”国家标准2001规定，实验动物环 境设施分为三等，控制程度从低到高，依次为开 放环境、隔离环境和屏障环境。 与普通动物设施的区别与普通动物设施的区别 动物房的建筑要求是避免外界微生物感染饲养的动物房的建筑要求是避免外界微生物感染饲养的清洁级或清洁级或SPFSPF 级动物，级动物，所以所以空气是外排的，空气是外排的，而动物是清洁的。此时，进入而动物是清洁的。此时，进入 实验室的工作人员反而可能作为传染源感染动物。实验室的工作人员反而可能作为传染源感染动物。 生物安全实验室的建筑理念则与之相反，在生物安全实验室的建筑理念则与之相反，在BSL-3BSL-3实验室内的实验室内的 动物是不安全因素，动物是不安全因素，要要避免动物及其排泄物污染外界环境，避免动物及其排泄物污染外界环境， 所以所以BSL-3BSL-3实验室内是负压，空气是向内流的。实验室内是负压，空气是向内流的。 一级动物生物安全防护实验室一级动物生物安全防护实验室 ABSLABSL1 1 1.1.标准微生物学规范标准微生物学规范 实验人员从事在实验工作，需由实验室负责人批准，并决定限制 或禁止其他人员进入实验室 工作面每天消毒一次，及时对溅落活微生物的材料进行消毒。 采用机械吸液装置，禁止用嘴吸液。 在实验区内禁止饮食、吸烟、处理隐性眼镜及化妆，食物应存放 在专用的储藏柜或冰箱内，保存食物的柜子或冰箱应放置在实验 区以外。 实验人员在操作活微生物材料及动物，离开实验室之前均应洗手 。 所有污染的液体或固体废弃物在处理前应去除污染。感染动物尸 体需用防漏、有盖容器运出并焚化。 所有操作均应按规程仔细小心进行，使气溶胶的产生减至最低限 度。 实验室应有防昆虫及鼠类的措施。 2.2.特殊规范特殊规范 需告知进入实验室人员潜在危害，符合特定要求人员方能由 负责人批准进入。 实验室要制定生物安全手册，供需要进入的工作人员阅读并 按程序执行。 建议穿长工作服，以防止污染或溅污便服。动物房工作服不 能穿到其它实验区域。 需运至实验室外进行消毒处理的污染材料，应装入坚固、不 漏的容器、密封室。 制定安全使用锐利器具的方案。 3.3.防护防护设备（初级屏障）设备（初级屏障） ABSLABSL1 1一般不要求使用专用防护设备。一般不要求使用专用防护设备。 接触非人类灵长动物的人员应进行黏膜暴露危险评估接触非人类灵长动物的人员应进行黏膜暴露危险评估 ，并且应用合适的眼部和头面部防护设备。，并且应用合适的眼部和头面部防护设备。 4.4.实验室的设施要求实验室的设施要求( (二级屏障）二级屏障） 动物设施应与大楼内的公共区分开。动物设施应与大楼内的公共区分开。 动物饲养区的门需能自动关闭，向内开启，平时保持关闭状 态。 实验室设计与建筑应便于清洁。实验室设计与建筑应便于清洁。 实验台表面不透水，耐酸、碱、有机溶剂、并耐热。实验台表面不透水，耐酸、碱、有机溶剂、并耐热。 实验室设备坚固。实验台、柜及设备之间的空间应有适当距实验室设备坚固。实验台、柜及设备之间的空间应有适当距 离便于清洁。离便于清洁。 实验室区及动物饲养区应设洗手池。实验室区及动物饲养区应设洗手池。 如实验室有可开关的窗子应装上纱窗。如实验室有可开关的窗子应装上纱窗。 实验室空气直接外排，不得再循环或回流至其它动物饲养区实验室空气直接外排，不得再循环或回流至其它动物饲养区 。 动物用笼架具可用手洗及机洗。机洗最后冲洗温度最少应为 90。 二级动物生物安全防护实验室二级动物生物安全防护实验室 ABSLABSL2 2 该级与动物实验一级生物安全水平相似，适用于那些对 人及环境有中度潜在危险的微生物和动物实验工作。其 不同点在于 (1) 人员经过操作病原性物质专门训练，并由能胜任的 科学人员监督管理 (2) 正在工作时限制外人进入实验室 (3) 某些产生传染性气溶胶的工作在生物安全柜或其他 物理封闭设备内进行 应有适当的医疗监测方案。实验室人员须针对所应用的病原 体或潜在的病原体接受适当的免疫或检测（如乙肝疫苗或TB 皮试），并且应建立适当的血清监测系统。 制定安全使用锐利器具的方案。 （1）动物实验室内限制使用针头和注射器或其他锐利器械 ，只在没有其他选择时才应用，如胃肠外注射、血液收集、 从实验动物或带隔膜的瓶子中吸取液体等。 （2）可重新接入针头的注射器、无针系统以及其他安全装 置在适当的时候可应用。 （3）尽量用塑料制品代替玻璃制品。 其他标准微生物学规范同ABSL-1。 1.1.标准微生物学规范标准微生物学规范 2.2.特殊规范特殊规范 实验室负责人应确定进入实验室人员的资质。在一般情况下， 应禁止高度易感人群，如孕妇或免疫受损人员进入。 操作传染性物质的实验室，要有进入实验室的特殊规定(如进 行预防接种)。在进入动物实验室实验区的门上标明“生物危 险”的警告标志，包括通用的生物危险性标志，标明传染性物 质种类、实验室负责人或其他人姓名、电话、以及进入实验室 的特殊要求。 工作人员需进行意外事故发生后的紧急处理方法的培训，并保 存培训记录。 由于泄漏或事故导致传染性材料明显暴露时，应立即向实验室 负责人报告。应按规定进行医学评估、检查及处理，并保存书 面记录。 要特别注意防止经皮肤感染，尤其是要避免被动物抓、咬伤 。 废物在处理前应去除污染。 笼具需经高压灭菌或去污后方可洗涤。 与实验无关的动物不允许放在实验室内。 根据传染因子的情况，开展工作前采集并保存所有实验人员 及有被感染危险的其他人员的本底血清样品。采集第二份血 清样品的间隔时间可随所用传染因子及实验室情况的不同而 异。 制定生物安全手册，对工作人员说明特殊的危险性，并要求 他们严格遵守。 2.2.特殊规范特殊规范 3.3.防护设备防护设备( (初级屏障）初级屏障） 下列操作要用生物安全柜或其他个人防护用品，或物理阻隔 装置。 产生气溶胶可能性大的操作，包括离心、研磨、匀浆、强烈振荡 或混合、超声波破碎、开启内压与环境压力不同的传染材料容器 、动物接种、由动物或鸡胚收获感染组织。 使用高浓度或大容量传染性物质时，如采用密封转头或离心机安 全罩可在实验室内离心上述材料。 进入非人灵长类动物实验室的人员需配戴保护头面部、眼镜的装 备。 在实验室内应穿专用的工作服、帽子、鞋、口罩，离开实验室到 非实验室区时，应脱下工作服。 4.4.实验室设施实验室设施( (二级屏障二级屏障 ） 除满足ABSL-1的设施要求外，还应有高压蒸汽灭菌器 ，供传染性实验室废弃物去污染用。 三级动物生物安全防护实验室三级动物生物安全防护实验室 ABSLABSL3 3 ABSL-3的标准微生物学规范同ABSL-2 。 1.1.标准微生物学规范标准微生物学规范 2.2.特殊规范特殊规范 当实验室或封闭单元内有传染性材料或感染动物时，在进入实验当实验室或封闭单元内有传染性材料或感染动物时，在进入实验 室或动物室的门上应标明室或动物室的门上应标明“ “生物危险生物危险” ”警告标志，包括通用的生物警告标志，包括通用的生物 危险性标志，标明传染因子名称，实验室负责人或其他负责人姓危险性标志，标明传染因子名称，实验室负责人或其他负责人姓 名，电话号码，以及进入实验室的一些特殊要求，如必须免疫，名，电话号码，以及进入实验室的一些特殊要求，如必须免疫， 戴防毒面具或采取其他个人防护措施。戴防毒面具或采取其他个人防护措施。 所有涉及传染性材料的活动都应在封闭单元中的生物安全柜或其所有涉及传染性材料的活动都应在封闭单元中的生物安全柜或其 他物理封闭设备内进行。不得在敞开的实验台上进行敞口容器操他物理封闭设备内进行。不得在敞开的实验台上进行敞口容器操 作。作。 在传染性材料工作结束时，生物安全柜及其他封闭设备的工作面在传染性材料工作结束时，生物安全柜及其他封闭设备的工作面 应去除污染。应去除污染。 真空管线用高效空气过滤器及液体消毒剂消毒装置保护。真空管线用高效空气过滤器及液体消毒剂消毒装置保护。 3.防护设备(初级屏障) 在实验室内穿上保护便服用的实验服在实验室内穿上保护便服用的实验服 ( (如后开口服、全身如后开口服、全身 覆盖服、两件套服、连衣裤覆盖服、两件套服、连衣裤) )。 在有传染性动物的室内应戴模压面罩或防毒面具。在有传染性动物的室内应戴模压面罩或防毒面具。 动物实验需加戴防撕咬手套，无菌方式摘除后与动物房废动物实验需加戴防撕咬手套，无菌方式摘除后与动物房废 弃物一同处理。弃物一同处理。 专用靴子等防护性鞋罩，脱除之前要消毒。专用靴子等防护性鞋罩，脱除之前要消毒。 动物饲养笼可戴滤过帽或在负压式动物饲养笼可戴滤过帽或在负压式IVCIVC或隔离器饲养。或隔离器饲养。 4.4.实验室设施（二级屏障）实验室设施（二级屏障） 动物实验室须在整体建筑自成一区。可通过隔离门与公共走廊 相连。 动物实验室通道的门需互锁，向内开启。 墙、地面、天棚的内表面应耐水，以便于清洁这些表面的贯 通处应已密封或能密封，以便于该区域去除污染。 每个实验室设置洗手池洗手池要有支架、肘推开关或自动开 关；并没在实验室出口处。 实验室内窗户关闭，并密封。 实验室的进出门、或封闭组件能自动关闭。 动物实验室通风设备启动时，按先开排风机后开送风机顺序 进行，关闭时先关送风机后关排风机。 由生物安全柜排出的气体经HEPA滤器过滤后可直接排放，或 通过建筑物中的排气系统排放；生物安全柜应每12个月检查 验证一次，其排出的空气可以在实验室内再循环。如由生物 安全柜排出的经HEPA滤器过滤的空气要通过建筑物的排气系 统排放，其连接方法如套管部件