叶黄素—花青素脂质体制备及抗氧化与缓解视疲劳作用.pdf

哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 iii 目录 摘要i abstract.ii 第 1 章 绪论.1 1.1 立题背景1 1.2 叶黄素花青素脂质体国内外研究2 1.2.1 叶黄素的研究2 1.2.2 花青素的研究.4 1.3 叶黄素花青素脂质体生理功能研究6 1.3.1 氧化机制的和抗氧化作用6 1.3.2 缓解视疲劳作用8 1.4 食品脂质体的研究现状9 1.5 本课题研究目的及意义10 1.6 本课题研究的主要内容 11 第 2 章 实验的材料与方法.13 2.1 实验试剂及材料13 2.1.1 实验原料13 2.1.2 实验试剂13 2.2 实验仪器及设备14 2.3 测定方法15 2.3.1 叶黄素包封效果测定15 2.3.2 叶黄素花青素脂质体包封率测定16 2.3.3 制备叶黄素花青素脂质体单因素条件的确定16 2.3.4 响应面法优化叶黄素花青素脂质体工艺条件.17 2.3.5 各因素对叶黄素花青素脂质体稳定性影响17 2.3.6 叶黄素花青素脂质体的体外抗氧化实验18 2.3.7 叶黄素花青素脂质体对光诱导视疲劳大鼠眼部抗氧化损伤的防护能力 分析.20 2.3.8 大鼠眼球组织抗氧化指标测定21 2.3.9 统计学处理22 2.3.10 缓解视疲劳人群试食试验.22 第 3 章 叶黄素花青素脂质体制备工艺.25 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 iv 3.1 复合表面活性剂筛选25 3.1.1 叶黄素包封体系 hlb 值的确定25 3.1.2 叶黄素复合表面活性剂的筛选26 3.2 叶黄素花青素脂质体制备单因素条件确定27 3.2.1 超声温度对叶黄素花青素脂质体包封率的影响.27 3.2.2 均质时间对叶黄素花青素脂质体包封率的影响28 3.2.3 膜材用量对叶黄素花青素脂质体包封率的影响29 3.2.4 ph 对于叶黄素花青素脂质体包封率的影响30 3.3 响应面法优化脂质体制备工艺条件31 3.4 本章小结36 第 4 章 叶黄素花青素脂质体稳定性分析.37 4.1 ph 对叶黄素花青素脂质体稳定性影响. 37 4.2 光照对叶黄素花青素脂质体稳定性影响38 4.3 温度对叶黄素花青素脂质体稳定性影响39 4.4 本章小结40 第 5 章 叶黄素花青素脂质对氧化损伤的防护作用.42 5.1 叶黄素花青素脂质体体外抗氧化作用42 5.1.1 清除 abts 能力42 5.1.2 清除 dpph 自由基能力43 5.1.3 清除羟基自由基44 5.2 叶黄素花青素脂质体对光诱导大鼠眼部氧化损伤的防护能力45 5.2.1 叶黄素花青素脂质体对超氧化物歧化酶（sod）的影响45 5.2.2 叶黄素花青素脂质体对丙二醛（mda）的影响.46 5.2.3 叶黄素花青素脂质体对血清和组织总抗氧化能力（t-aoc）的影响 47 5.3 本章小结48 第 6 章 叶黄素花青素脂质体缓解视疲劳人群试食实验.49 6.1 视觉持久度测定结果49 6.2 远视力检查结果51 6.3 视疲劳症状判定51 6.4 本章小结53 结论.55 参考文献.56 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 v 攻读硕士学位期间发表的论文及其它成果.63 哈尔滨工业大学学位论文原创性声明及使用授权说明.65 致谢.66 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 1 第 1 章绪论 1.1立题背景 视疲劳是一种以自觉症状为主要临床表现的眼部综合症， 视疲劳1可能与用眼 习惯、环境因素和精神心理因素有关，但视疲劳的具体发病机制尚不清楚。随着 我国社会经济的发展和电子产品的普及，液晶显示屏已深入到人们的日常生活中， 眼睛长期暴露于闪烁的荧光屏前促使视网膜眼病与某些慢性眼病发病提前和患病 率升高。 在人体的正常机体代谢过程中，有氧代谢造成了活性氧自由基的产生。机体 内清除自由基和产生自由基的平衡被打破，从而导致氧化压力，这种氧化压力可 以损伤包括 dna，脂类，蛋白质，以及糖类等生物分子，涉及例如碳水化合物的 损伤、脂质过氧化、蛋白质裂解、基因突变、dna 氧化和癌变等2。长久以来， 人们向食品中添加工合成的抗氧化剂来预防由于脂质氧化造成的异味和食物变质 的产生。 研究表明某些人工合成的抗氧化剂例具有毒性， bht 和 bha 开始受到人 们的质疑，但是许多人工合成的抗氧化剂仍被过度应用于食品生产过程中3。人们 开始寻求天然无毒的食用色素4，现阶段欧洲允许使用 13 种从植物资源中获得的 天然色素，其中包括姜黄色素（curcuminoid），叶黄素5（xanthophyll），辣椒红 素（capsanthin）甜菜红色素6（betalain），蒽醌类7色素（anthraquinones），卟 啉环类色素8,9（porphyrins），类黑精（melanoidins）以及花青素(anthocyanins) 等。叶黄素10和花青素11单体的改性和抗氧化性质的研究比较广泛，由于两种色 素的极性不同，在同一体系中不能稳定存在12，所以对叶黄素和花青素复配使用 对其抗氧化性能和生理功能的研究较少。 人们将欣赏高品质的食物和饮料作为一种享受，良好的色泽既起到美观的作 用同时也是鉴定食物品质的重要标准之一。食用色素13是用于食品着色的一类添 加剂，按其来源不同可分为天然食用色素和人工合成食用色素，旨在通过呈色增 进人们的食欲进而提高食品的商品价值。随着人们生活水平的提高和我国食品安 全知识的推广，天然食用色素的研究和应用越来越广泛，其中两类典型的食用色 素叶黄素和花青素以其丰富的原料来源，良好的使用安全性及高效的生理功能在 天然功能性食品添加剂和医药保健行业倍受关注。多项研究表明，适量的体育锻 炼和合理的膳食结构对维持眼部的生理功能起着重要的作用，叶黄素14和花青素 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 2 是眼睛视网膜和晶状体内被发现最多的天然色素，可作为眼部有益的抗氧化剂淬 灭活性氧自由基从而减少眼部组织的氧化伤害，起到保护眼部组织和缓解视疲劳 的作用，近年来花青素和叶黄素作为主要功能因子加入明目系列保健品和食品中 的例子屡见不鲜15,16， 但碍于叶黄素和花青素的极性不同不能在同一体系中稳定存 在，因而两者复合使用作为缓解视疲劳保健品的应用受到限制，复合食品表面活 性剂的研究和发展有助于解决这一难题，以下是对两种天然色素脂质体工艺及其 生理功能国内外研究现状的介绍。 1.2叶黄素花青素脂质体国内外研究 1.2.1 叶黄素的研究 叶黄素17（xanthophylls）包括紫黄质（violaxanthin） 、花药（antheraxanthin ） 、 玉米黄质（zeaxanthin） 、新黄质（neoxanthin） 、芦丁（lutein）等种类的化合物， 其中互为同分异构体的芦丁和玉米黄质是叶黄素家族的两大主要成员18，也是迄 今应用最广泛的两种叶黄素。 表 1-1 不同水果蔬菜中叶黄素的含量 tabel 1-1 concentration of xanthophylls in some fruits and vegetables 食物种类叶黄素含量（g/100g） 黄豆44 西兰花23 胡萝卜23 芹菜8 羽衣甘蓝266 玉米528 生菜187 桔子74 木瓜20 桃6 豌豆58 菠菜331 南瓜280 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 3 近年来，人们逐渐将目光转向从微生物中提取叶黄素，但是叶黄素并非像- 类胡萝卜素和虾青素被频繁地应用于合成类胡萝卜素的前体物质，所以生产叶黄 素的微生物种类十分有限，黄杆菌属（flavobacteriumsp） ，欧文氏菌（erwinia herbicola）等菌属可以提高叶黄素的产量，romer 等对两种土豆进行基因修饰19， 通过编码叶黄素环氧酶可以增加土豆中叶黄素的产量，基因修饰后叶黄素的含量 将提升 4 到 130 倍，含量可以达到 40g/g。叶黄素是自然界分布最广泛的植物色 素之一20，广泛分布于动植物和微生物中，在玉米，蛋黄，桔子和例如苜蓿的水 果以及万寿菊中含量较高21，表 1-1 为不同水果蔬菜中叶黄素的含量22。 叶黄素分子式 c40h56o2，分子量 568.88，分子结构中包含 40 个碳原子，由 于叶黄素具有独特的共轭多烯结构，所以其化学性质很不稳定，遇见光照、氧气、 酸、碱等条件容易发生降解而使其失去生物活性，在分离提取纯化过程中要保护 叶黄素以免受到不稳定因素的影响。e.e.moros23等应用高效液相色谱的方法分 析玉米中各种叶黄素（芦丁，玉米黄质，-隐黄质）含量，测定使用的流动相为 甲基叔丁基醚，甲醇及水，所有的叶黄素在 35 分钟之内被洗脱。黄色马蹄形玉米 的芦丁含量为 15.7g/g，玉米黄质的含量为 5.7g/g，-隐黄质的含量为 0.57 g/g。在叶黄素的定性分析方面，除应用紫外、红外方法为，研究表明拉曼光谱在 定性叶黄素结构方面更为精确，叶黄素的拉曼光谱散射峰很明显24，拉曼光谱显 示叶黄素两个标志性散射峰 1159cm-1与 1525cm-1分别是碳骨架上 c-c 单键和 c=c 的振动峰。不同溶剂溶解叶黄素的最大可见光吸收波长如表 1-2 所示。 表 1-2 叶黄素的可见和紫外吸收 table 1-2 ultraviolet and visible absorption data of xanthophylls 类胡萝卜素溶剂max 叶黄素丙酮（430）452 479 叶黄素氯仿（433）462 493 叶黄素乙醇（428）450 478 叶黄素石油醚（424）449 476 叶黄素25是类胡萝卜素中的一种，与其他类胡萝卜素成员不同之处是叶黄素 可以在禽类和鱼类中作为色素沉积。叶黄素的疏水基团是细胞膜和血浆中重要的 脂溶性的清除自由基的抗氧化剂26，其作用与维生素 e 类似。作为自由基的清除 剂，类胡萝卜素中-胡萝卜素和叶黄素清除自由基的能力最强，抗氧化能力仅次 于有 11 个共轭双键的番茄红素。zora27等研究了处于不同生长阶段番茄中芦丁、 番茄红素和-胡萝卜素以及抗坏血酸含量的变化，同时分析了每种物质的抗氧化 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 4 能力以及彼此之间协同抗氧化能力，结果表明番茄红素与芦丁、番茄红素与-胡 萝卜素、抗坏血血酸与胡萝卜素具有很好地协同抗氧化功能。 叶黄素28作为食品添加剂被广泛应用于饲料和食品工业中，禽类利用叶黄素 作为其皮肤着色剂。此外，流行病学研究发现服用叶黄素可以降低患喉癌、肺癌 和膀胱癌、白内障和低密度脂蛋白氧化等患病的风险而被应用于功能性食品中29。 1.2.2 花青素的研究 在天然色素王国中，花青素占有水溶性食用色素很大的比重，据报道已经从 植物中分离出 539 种花青素，1992 年至今已经鉴定出 277 种花青素。由于花青素 骨架 b 环（图 1-1）上甲氧基和羟基取代位置和数量的不同而构成不同的花青素， 常见的花青素一种有六种30，它们分别是：天竺葵色素（pelargonidin）,矢车菊色 素（cyanidin）,芍药色素（peoindin）,飞燕草色素（delpyhinidin） ，牵牛花色素 （petunidin）和锦葵色素（malvidin） （表 1-3） 。 o + o o o oh h h h o o o o- - - -r r r r3 3 3 3 o o o oh h h h r r r r1 1 1 1 r r r r2 2 2 2 ab c o o o oh h h h 图 1-1 花青素的骨架结构 fig.1-1the skeleton of anthocyanins b 环上的基团取代可以影响花青素的呈色，例如 b 环上羟基化的变化可以使 花青素的颜色从红色渐变为紫色 （天竺葵色素矢车菊色素飞燕草色素） 。 其次， 母核上所连接的糖的种类，酰基化与否以及酰基化的位置都会影响花青素的呈色。 虽然花青素生理功能倍受关注31，但是花青素产业化由于以下几个原因受到 制约。首先，花青素的生产成本高，尽管花青素32广泛存在于自然界的蔬菜水果 和微生物中，但是花青素含量相对较低，受季节影响严重，在储存过程中容易被 氧化腐败变质，提取色素后产生的副产物数量多，综合利用率低33；其次，与人 工色素相比，花青素等天然色素的稳定性差，达到相同的染色效果天然色素较人 工合成色素的使用量大。花青素易受氧化剂、酶、光照、温度、金属离子等因素 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 5 影响，特别是受 ph 影响严重，随着 ph 的增加花青素的颜色从红色渐变到蓝色， 花青素在使用和储藏过程中受到一定的限制，因而天然色素代替人工合成色素需 要解决以上因素的影响。表 1-4 是几种不同水果蔬菜中花青素的含量。 表 1-3 六种常见的花青素 table 1-3 six common anthocyanins anthocyaninr1r2 max(nm)* r3=hr3=gluc 飞燕草色素ohoh546541 牵牛花色素ohoch3543540 锦葵色素och3och3542538 矢车菊色素ohh535530 芍药色素och3h532528 天竺葵色素hh520516 *以上花青素溶于含有 0.01%的 hcl 中进行测定30 表 1-4 一些食物中花青素的平均含量 table 1-4average amount of anthocyanins in some foodstuffs(clifford 2000)33 花青素来源含量（mg.kg-1） 黑莓1150 蓝莓8254200 樱桃204500 花楸果506010000 越橘6002000 黑加仑13004000 接骨木200010000 红葡萄3007500 血橙2000 李子20250 草莓150350 树莓17004277 茄子7500 红卷心菜250 红酒240350 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 6 花青素是国内外公认的可以代替人工合成色素的理想资源，特别是自从 20 世 纪末世界卫生组织和国际粮农组织联合禁止人工合成染料作为食用色素后，花青 素被广泛地应用于食品工业中。 据统计， 美国人夏季花青素的摄入量大约是215mg， 而冬季花青素的摄入量为 180mg 左右，研究表明花青素不仅仅是一种很好的天然 食用色素，同时具有美容养颜，降脂减肥，抗老化等重要生理功能。花青素的主 要作用在于清除自由基34，例如金海英35等研究了沙棘籽原花青素提取物的抗氧 化作用。该提取物按 100mg/kg,300mg/kg,600mg/kg 给小鼠灌胃，每一剂量都可以 提高小鼠全血的谷胱甘肽过氧化物酶的活性以及提高小鼠红细胞的超氧化物歧化 酶的活性，同时降低小鼠肝脏中过氧化脂质的含量。邹元生36等研究了沙棘花青 素软胶囊的抗氧化活性，研究选用昆明种小鼠作为实验动物，测定其体内抗氧化 酶的活力以及过氧化脂质的含量，研究表明沙棘原花青素可以降低过氧化脂质 （mda）含量同时提高超氧化物歧化酶（sod）的活性。 此外，花青素37药理研究发现成分花青素具有视紫红质再合成、改善血液循 环、抗炎症等多种药理功能，可以缓解很多与自由基氧化引起的疾病，如心脏病、 糖尿病、癌症、老年黄斑变性、帕金斯病和阿尔海默老年痴呆症等的发生。含有 花青素类食物的生理作用体现在世界各地的饮食中，法国人常年大量食用胆固醇 和高脂肪类物质，但心脑血管疾病的患病率和死亡率的水平较低，这可能与法国 人常年应用富含花青素的葡萄酒有关，同时花青素还应用于多个国家的军事食品 中，在我国花青素被加入军事食品中提高作战人员的抗应激能力增强我军的战斗 力。花青素的生理花青素作为一种安全的天然食用色素38，同时具有一定的药理 作用，在食品行业、化妆品行业、医药行业等方面有着巨大的应用潜力。 1.3叶黄素花青素脂质体生理功能研究 1.3.1 氧化机制的和抗氧化作用 大约于 2.7 亿年前，随着光合有机物的进化氧原子被引入到我们的环境中， ros 不可避免地伴随需氧生物而产生。产生和清除活性氧自由基之间的平衡可能 会因为例如盐度，uv 放射，重金属，极端环境，空气污染，病菌的攻击而遭到破 坏。这些平衡的紊乱将会导致细胞内 ros 的增长，ros39包含 o2、h2o2、1o2、 ho2、oh、roo以及 ro，这些活性氧自由基都具有毒性同时引起蛋白 质、脂肪、碳水化合物、dna 的损伤进而造成细胞结构的严重损伤甚至导致细胞 死亡。 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 7 人们已经注意到 o2 通常是产生的第一个活性氧自由基。首先，生物体中 吸收的大约 1-2%氧气通过一系列反应会引起 o2 的产生40。由于氧原子具有两 个受损的电子，这两个电子有相同的旋转量子数，旋转限制使 o2易于一次一个地 接受其他电子，导致所谓活性氧自由基的形成，这种活性氧自由基可以损伤正常 细胞。最终，细胞色素 c 氧化酶和交替氧化酶和 o2反应，转移了四个电子同时释 放出水分子。然而，o2偶尔还会与其他的 etc 成分反应，这里只有一个电子被转 移，结果产生了 o2 ，其半衰期大约为 2-4s。o2的产生可能会引起类似于 oh的更多活性氧自由基的形成，更有可能形成单线态氧 1o2，两种自由基都可 能引起脂质过氧化和细胞衰老的产生。 人们已经注意到 o2 41可以经历质子化产 生一种猛烈的氧化剂-ho2，在带负电的膜表面，它可以直接攻击不饱和脂肪酸 42。还原 o2 还可以产生 h2o2，h2o2的反应很温和，与其他活性氧自由基相比 有相对长的半衰期（1ms）,oh、1o2的半衰期（24s）很短。而且，o2 可 以给 fe3+一个电子生成还原铁 fe2+，还原铁可以还原过氧化氢，这种通过 o2， h2o2和铁离子迅速产生 oh的反应成为哈伯伟兹反应，然而最终涉及 h2o2氧 化 fe2+的反应被称作 fenton 反应： 22 3 22 2 3 2222 2 2 13 2 ohohfeohfe feohoho feofeo sod + + + + + + + 特别地，羟基自由基是高度活跃的活性氧自由基。在有适合的过度金属存在 的情况下，特别是 fe 的存在，羟基自由基也是由 h2o2和 o2 产生，在中性 ph 和室温下同多铁催化和 o2 驱动的 fonton 反应。这些过氧化氢被认为要对活的 有机体的氧化毒性负主要责任。过氧化氢有潜在的和所有生物分子反应的能力， 这些生物分子包括 dna，蛋白质，脂质和几乎任何的细胞组分，同时由于酶机制 的缺乏不能消除过量的活性氧自由基，过量产生的羟基自由基最终会导致细胞死 亡43，同时 o2 会导致 h2o2，oh和其他 ros 的形成。 机体防御体系的抗氧化能力的强弱与健康程度存在着密切联系44，应激产生 的活性氧自由基（ros）积累可以通过包括一系列清除剂的还原酶系统中和，例 如 sod，apx，gpx，gst，和 cat 以及非酶活低代谢分子如 ash，gsh，- 生育酚，类胡萝卜素和类黄酮。此外，脯氨酸也被列为非酶类抗氧化剂的行列， 用于中和微生物，动物和植物所需的清除 ros 的影响。天然色素绿色天然，逐渐 成为受食品加工业和消费者欢迎的抗氧化剂来源。众多研究表明天然食用色素不 仅具有很好的呈色作用，同时具有很好的抗氧化的功能，天然色素可以以单独或 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 8 者结合的形式作为抗氧化剂，而天然色素之间相互作用达到协同抗氧化作用的报 道很少，叶黄素45和花青素是自然界中两种常见的天然色素，叶黄素和花青素分 别是自然界中广泛存在的脂溶性和水溶性色素，研究表明叶黄素和花青素的单独 作用呈现出良好的抗氧化等生理功能由于两者的溶解条件差异显著，故对于两者 协同清除自由基抗氧化等生理防护功能研究受到局限。本文旨在通过包封方式改 善两者于溶液中的稳定性46，进而应用体外和体内实验验证两者复合抗氧化功能 是累加，协同亦或者是拮抗作用。 1.3.2 缓解视疲劳作用 人的眼部是构造极其精密的部位，眼部的毛细血管十分脆弱，渗透压的微小 变化都可以引起眼底视网膜和视网膜血管的变化。视疲劳的产生原因较多47，但 目前临床并未对产生视疲劳的原因下一个明确定论。周芳红48对陕西省宝鸡市西 京医院 846 例视疲劳患者进行统计，按发病原因分析可归纳为 3 种：眼部因素性 视疲劳占 75.06%，环境因素性视疲劳 19.98%，体质因素性视疲劳占 4.96%。其次， 氧化损伤可以损伤血管壁的细胞，使细胞壁变得很脆失去弹性，对视力产生损伤 甚至失明。 叶黄素51可以降低太阳直射产生的眩光对于人眼的刺激同时过滤掉对人眼损 伤最严重的蓝色光线，从而保护视网膜免受氧化损伤和光污染，预防老年性黄斑 变性和白内障等眼科疾病。 人体中摄入的叶黄素49,50分布于眼睛的两个部分分别为 视网膜黄斑区以及晶状体，叶黄素是人眼中唯一存在的类胡萝卜素，有证据表明 叶黄素可以保护光接收器或者延迟与年龄有关的视黄斑衰退51,52。 动物研究数据表 明食用叶黄素有保护视网膜的作用，实验验证视黄醛叶黄素可以保护由光刺激引 起的光感受器细胞死亡。1995 年美国美国 fda(foodanddrugadministration)就已 经批准叶黄素作为食品增效剂应用用于食品饮料，2006 年 6 月，在日内瓦举行的 63 界食品添加剂专家委员会 （jecfa） ， 食品农业组织/世界健康组织 （fao/who） 以及食品添加剂专家委员会（jecfa）三个组织联合完成了一项毒理学评价，会 议建立了一组叶黄素的每日允许摄入量 （adi） ， 叶黄素的每日允许摄入量 2mg/kg。 翟鹏贵208等对万寿菊提取物缓解视疲劳作用的人体试食实验效果观察，结果表明 万寿菊提取物能改善眼胀、眼干涩等视疲劳症状，并能提高远视力和明视持久度 水平，而且明视持久度的提高率为（11.218.12）%。 花青素具有抗氧化的作用53，可以防止眼部的脂质过氧化缓解假型近视，阻 止轻度近视的进一步发展。花青素同样可以促进视紫红素的再生，增加睫状肌的 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 9 血流量，消除视疲劳改善视神经细胞的功能，增强眼睛对较暗光线和变化光线的 适应能力。随着深入研究花青素，人们发现花青素不仅有助于糖尿病型白内障的 预防和治疗， 而且可以通过抗氧化机制缓解人体全身及眼部的疲劳症状。 刘春民54 等采用双盲法研究了花青素对近视青少年视疲劳及视力的影响，结果表明花青素 能有效缓解由视疲劳引起的眼胀、眼痛、畏光、眼干涩和视物模糊等症状，同时 能够改善近视和轻度近视的远视力，有效率达 77.12%。周淡宜55等研究越橘提取 物复合维生素 a 视疲劳的改善能力，经过 30d 的试食实验研究表明受试者的视疲 劳症状明显减轻，明视持久度提高（13.2310.34）%，总效率为 51.9%。 1.4食品脂质体的研究现状 脂质体56（liposome)又称为人工膜，主要的壁材为两亲性的类脂质，如天然 磷脂（pc、pe）与合成磷脂（dppc，dspc，dppe）以及被誉为“流动缓冲剂” 胆固醇组成。脂质体是将原料包封于类脂双分子层所制成的超微型球状载体制剂， 脂质体具有仿生性、靶向性、低毒副作用以及透皮吸收性等一系列其他制剂没有 的独特优点，近年来在全球范围内被广泛关注和研究。脂质体常用的制备方法有 逆向蒸发法、超声波分散法、注入法以及薄膜分散法等四种，脂质体凭借其良好 的流动性和稳定性广泛应用于包括抗菌、抗肿瘤等药物载体和基因载体中。 卵磷脂（lecithin）57是常见的天然表面活性剂，自从 1843 年法国科学家从蛋 黄中发现卵磷脂，卵磷脂迅速风靡整个世界，卵磷脂能显著降低油水间的表明张 力， 是我国最早批准作为食品表面活性剂的品种之一。 卵磷脂58,59按其来源可分为 植物卵磷脂、蛋黄卵磷脂、分选卵磷脂、酶解卵磷脂等几类。大豆卵磷脂主要是 脑磷脂、卵磷脂、肌醇磷脂和少量磷脂酸、磷脂丝氨酸酯等物质的混合物。卵磷 脂中磷脂酰胆碱（pc）含量达到 95%以上，是起着生理功能的主要成分，磷脂酰 胆碱能将大脑中的指令迅速传递，具有健脑、益智、增强记忆等功效60。大豆卵 磷61脂来源广泛、价格相对比较低廉，所以目前商用所用的卵磷脂多为豆油生产 过程中的副产物提炼出的卵磷脂61，其 hlb 值约为 9，不耐高温，达到 80时开 始变性， 温度升为 120时开始分解。 大豆卵磷脂添加到食品中除了具有包封功效， 同时还具有预防脂肪肝、促进胆固醇排泄、增强维生素 a、d、e、k 吸收等生理 功能，享有“血管清道夫”和“天然解毒剂”等美誉。考虑到天然食品表面活性 剂绿色天然的营养功能特性，本课题选用大豆卵磷脂作为叶黄素花青素脂质体 的包埋剂。 脂质体作为药物载体的发展十分迅速， 美国fda(foodanddrugadministration) 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 10 已经批准肉红霉素、阿霉素等多个脂质体制剂上市，在我国 2000 年已经批准静脉 注射用放射增敏剂紫杉醇上市，此外多个脂质体制剂的研究已经进入临床试验的 阶段62。 张志勤等63对茶多酚脂质体的制备方法包括逆向蒸发法 64、 薄膜分散法、 乙醇注入法以及冻融法等方法，以及茶多酚脂质体在抗氧化、抗氧肿瘤和皮肤药 理学等方面表现进行了研究。李子臣65等研究含有共轭炔基的两性脂质体的聚合， 实验首先用超声波分散法制备 ddca-dmpc 与 ddca-dmpc 两种脂质体，然后 混合好的脂质体在紫外光的照射下发生双炔基团的聚合。 陈燕军66等制备了原花青素柔性纳米脂质体，并比较原花青素柔性纳米脂质 体与普通脂质体的体外释药情况，作者选用卵磷脂和胆酸钠作为脂质体的膜材， 采用薄膜分散法脂质体经过旋蒸超声工艺制得。胡博67等优化原花青素脂质体的 制备，实验膜材选用大豆卵磷脂和胆固醇，采用逆向蒸发法制备原花青素脂质体， 对制备条件进行优化，结果原花青素的包埋率可达到（88.892.5）%。 1.5本课题研究目的及意义 现代生活中，人们越来越重视有害气体、固体、噪声和电离辐射的污染，而 光污染很少被提甚至被人们淡忘。日光灯68的普遍使用改变了人类原有的生活模 式，不断闪烁的日光灯可导致疲劳、偏头痛，增加幼儿佝偻病和老年人骨折的发 病率，同时严重地影响视力健康，是造成当代青少年早熟和视力偏低的主要因素 之一。视疲劳是诱发近视度数加深的主要因素，视疲劳是用眼过度而得不到及时 休息造成的以眼部不适为主的系列体征和症状，不但影响人的视觉同时也是其他 疾病的诱因，特别是神经系统疾病的诱因，例如视疲劳会抑制人的中枢神经让人 感到疲惫和瘫软。由于花青素作用于视黄醛异构酶，能提高视紫红质生成速率， 视紫红质为视网膜视觉细胞的观光物，当眼睛受到光线刺激时，视紫红质能够瞬 间分解，并将化学变化传送至脑部而产生“可见物”，而且花青素可以促进视紫 红质在暗处的再合成，所以从越橘、蓝靛果等浆果中提取的花青素具有缓解视疲 劳的作用。同样，叶黄素是被称为“天然墨镜”的黄斑色素的主要成分，也具有 缓解视疲劳的重要功效。 综上所述，叶黄素69和花青素70类物质兼有缓解视疲劳和光氧化等重要生理 功能，本文旨在通过体外抗氧化实验、体内抗氧化实验以及人群试食实验研究叶 黄素花青素脂质体生理功能，同时在叶黄素花青素脂质体制备过程中根据浊 度法筛选出最佳的表面活性剂和最佳的工艺条件，为天然色素的利用提供一条崭 新的途径。 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 11 1.6本课题研究的主要内容 本课题以叶黄素花青素脂质体制备及其生理功能研究作为研究重点，主要 进行了以下几个方面的研究： （1）叶黄素花青素脂质体制备工艺的研究 采用实验室的常规方法提取、 纯化、花青素作为制备脂质体的原料，根据 hlb 值对叶黄素的复合表面活性剂进行筛选， 用响应面方法优化叶黄素花青素脂质体 的制备工艺，确定最佳的工艺条件。为得到质地均一且稳定存在的叶黄素花青素 脂质体，本课题先后采用两次包封工艺，第一次应用具有最适 hlb 值复合表面活 性剂包封叶黄素， 第二次用两性离子型食品表面活性剂卵磷脂作为膜材将经过包封 的叶黄素和花青素复配到一起，超声制备叶黄素花青素脂质体，卵磷脂的极性基 团与花青素相连，非极性基团与叶黄素相连，形成一种 w/o/w 的结构，最外层水 相中分布花青素，中间复合包封剂相分布叶黄素，最里层水相中包含花青素，叶黄 素花青素脂质体的结构如图 1-2 所示。 图 1-2:叶黄素花青素脂质体结构图 fig.1-2 xanthophyll-anthocyanin liposome structure （2）叶黄素花青素脂质体稳定性研究 通过保存率测定不同光照条件（室内暗光、室内自然光、室外自然光）、ph 条件、温度对于叶黄素花青素脂质体在储存过程中的影响，探究叶黄素花青素 脂质体最佳存放条件。 （3）叶黄素花青素脂质体抗氧化研究 ： 卵磷脂 ： 叶黄素 ： 花青素 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 12 分别测定叶黄素、花青素、叶黄素花青素脂质体清除 abts、dpph、羟基 自由基的能力，根据 ci 值评定脂质体的协同体外抗氧化性能。建立大鼠眼球光照 损伤模型，测定叶黄素花青素脂质体对大鼠眼球组织和血清超氧化物歧化酶 （sod）、丙二醛（mda）、总抗氧化能力（t-aoc）的影响，评价叶黄素的体 内抗氧化能力。 （4）叶黄素花青素脂质体的人群试食实验 在体外实验和体内抗氧化实验的基础上，参照保健食品人体试食试验规程 设计人群试食实验，对受试者进行症状评定、远视检查、视觉持久度三个方面的综 合分析，评价叶黄素花青素脂质体缓解视疲劳功效。 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 13 第 2 章实验的材料与方法 2.1实验试剂及材料 2.1.1 实验原料 本课题花青素为原料，卵磷脂、叶黄素均购自哈尔滨双环生物科技有限公司， sd 雄性大鼠由黑龙江中医药大学提供，人群试食实验的志愿者均来自东北林业大 学林学院。 2.1.2 实验试剂 表 2-1 实验中的主要试剂和原料 table 2-1 the regant be used in the experiment 名称规格产地 无水乙醇分析纯天津市天力化学试剂有限公司 丙酮分析纯天津津宇化工厂 甲苯分析纯天津科密欧公司 span80广州润华食品添加剂有限公司 tween80广州润华食品添加剂有限公司 冰醋酸分析纯天津市恒兴化学试剂制造有限公司 乙酸钠分析纯天津市石英钟厂霸州市化工分厂 abts标准品aldrich 公司 dpph标准品aldrich 公司 蔗糖脂肪酸单酯郑州大河食品 双乙酰酒石酸单甘油酯郑州大河食品 辛奎酸甘油酯郑州大河食品 硬脂酰乳酸钠郑州大河食品 三聚甘油单硬脂酸酯郑州大河食品 sod 试剂盒南京建成生物工程研究所 mda 试剂盒南京建成生物工程研究所 t-aoc 试剂盒南京建成生物工程研究所 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 14 续表 2-1 名称规格产地 考马斯亮蓝蛋白质测定试剂盒南京建成生物工程研究所 双氧水分析纯天津智惠工贸有限公司 水杨酸钠分析纯天津市化学试剂一厂 柠檬酸分析纯天津科密欧公司 磷酸二氢钠分析纯天津科密欧公司 磷酸氢二钠分析纯天津科密欧公司 2.2实验仪器及设备 表 2-2 实验所用的主要仪器 table 2-2 the instruments be used in experiment 仪器名称型号生产厂家 高速万能粉碎机fw100北京光谱仪器有限公司 紫外可见分光光度计specord plus德国耶拿分析仪器股份公司 台式离心机tdl-5上海安享科学仪器有限公司 水浴锅tda-8002天津市泰斯特仪器有限公司 电热鼓风干燥机101-2a天津市津东天正精细化学试剂厂 漩涡混合器ql-901江苏海门市麒麟医用仪器厂 电子天平alc-110.4北京赛多利斯仪器系统有限公司 循环水式多用真空泵shb-3郑州长城科工贸有限公司 ph 计pb-10北京赛多利斯仪器系统有限公司 卧氏离心机l-530湖南相依实验室仪器开发有限公司 匀浆机fa 25 上海弗鲁克流体机械制造有限公司 高速离心机tgl-16g上海安亨科学仪器厂 灭菌锅长春白奥生物仪器有限公司 加热磁力搅拌器ems-8a天津欧诺仪器仪表有限公司 均质机fa-25 上海弗鲁克流体机械制造有限公司 榨汁机hr200飞利浦 冷冻干燥机lgj-18s北京松源华兴科技有限公司 旋转蒸发仪re-3000上海亚荣生化仪器厂 间歇式高速剪切分散乳化机hishear上海弗鲁克机械制造有限公司 数控超声波清洗器kq5200db昆山市超声仪器有限公司 移液器dragonmed大龙医疗设备（上海）有限公司 电子调温电热套98-1-b天津市泰斯特仪器有限公司 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 15 2.3测定方法 2.3.1 叶黄素包封效果测定 油溶性的叶黄素漂浮分散于体系的表面，为使均质过程中叶黄素被充分包封， 同时得到具有良好贮藏稳定性能的叶黄素花青素脂质体，溶液体系中应添加一 定量的食品表面活性剂。 本课题采用浊度法筛选叶黄素的复合表面活性剂。浊度 法的测定原理是乳状液稳定性正比于界面的总表面积，而界面积越大体系的浊度 越高，且浊度的大小正比于乳状液在 500nm 的吸光度。因此，可以通过吸光度的 测定来反映表面活性剂的包封能力。 本课题选择两种表面活性剂 span80 和 tween80 作为标准， 按不同梯度浓度将 两种表面活性剂配制成不同 hlb 值的混合表面活性剂，再将各种 hlb 值的混合 表面活性剂分别加到叶黄素水相体系中，在 20mpa 的高压均质机下均质包封，取 下层液体，在分光光度计 500nm 处测定吸光值。以横坐标表示 hlb 值，纵坐标表 示吸光值作图，求得吸光值最大的 hlb 值为该乳浊液包封叶黄素所需最佳 hlb 值。 2.3.1.1 hlb 值的确定 hlb（hydrophilic-lipophilic balance）71为表面活性剂的亲水亲油平衡值， 是测定体系包封率的重要指标。 选取 hlb 值差值为 5 以内的表面活性剂进行复配， 混合表面活性剂的 hlb 值（hlbmix）可由组成它的各种表面活性剂的 hlb 值按 重量平均加和得到。 hlbmix=hlbawa%+hlbbwb%（2-1） 其中，wa% 和 wb%分别为 a、b 两种表面活性剂的重量百分数，hlba和 hlbb分别为 a、b 两种表面活性剂亲水亲油平衡值。 用 span80 和 tween80 确定好最适 hlb 值后， 在此 hlb 值下筛选最适合包封 玉米黄质的复合表面活性剂进行复配。 向 100ml 的蒸馏水中添加 10mg 的叶黄素加 入一定量的复合表面活性剂，在 20mpa 高压均质机下均质包封，取下层液体，在 分光光度计 500nm 处测定吸光值，吸光值越大，表明表面活性剂的包封效果越好。 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 16 2.3.2 叶黄素花青素脂质体包封率测定 包封率对于评价叶黄素花青素脂质体制备效果至关重要，方程如下： %100(%) 1 2 = w w e （2-2） e 为叶黄素花青素脂质体的包封率，w1和 w2分别代表向体系中加入的物料的质 量和包封所消耗物料的质量。 2.3.3 制备叶黄素花青素脂质体单因素条件的确定 用已包封的叶黄素、花青素以及卵磷脂为原料，探讨超声温度、均质时间、 ph、膜材用量等单因素条件对叶黄素花青素脂质体包封率的影响。 2.3.3.1 超声温度对叶黄素花青素脂质体包封率的影响 将用复合食品包封剂包封好的叶黄素，花青素，膜材卵磷脂倒入附有间歇式 高剪切分散乳化机的烧杯中混合叶黄素花青素脂质体，用超声分散法制备脂质 体，超声功率 4khz，按照以下条件：ph 为 8，包封时间 40min，膜材用量 6%， 在超声温度分别为 30，40，50，60，70，80时计算包封率，确定最 佳的超声温度。 2.3.3.2 包封时间对叶黄素花青素脂质体包封率的影响 将用复合食品乳化剂包封好的叶黄素，花青素，卵磷脂倒入附有间歇式高剪 切分散乳化机的烧杯中混合叶黄素花青素脂质体，用超声分散法制备脂质体， 超声功率为 4khz，按照以下条件：ph 为 8，超声温度 60，膜材用量 6%，在包 封时间分别为 10min，20min，30min，40min，50min，60min 时计算包封率，确定 最佳的均质时间。 2.3.3.3 膜材用量对叶黄素花青素脂质体包封率的影响 将用复合食品乳化剂包封好的叶黄素，花青素，卵磷脂倒入附有间歇式高剪 切分散乳化机的烧杯中混合叶黄素花青素脂质体，用超声分散法制备脂质体， 超声功率为 4khz，按照以下条件：ph 为 8，超声温度 60，均质时间 40min， 在膜材用量分别为 2%，4%，6%，8%，10%时计算包封率，确定最佳的膜材用量。 2.3.3.4 ph 对叶黄素花青素脂质体包封率的影响 将用复合食品乳化剂包封好的叶黄素，花青素，卵磷脂倒入附有间歇式高剪 切分散乳化机的烧杯中混合叶黄素花青素脂质体，用超声分散法制备脂质体， 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 17 超声功率为 4khz，按照以下条件：超声温度 60，均质时间 40min，膜材用量为 6%，在 ph 分别为 4，5，6，7，8，9，10 时确定最佳的 ph。 2.3.4 响应面法优化叶黄素花青素脂质体工艺条件 在叶黄素花青素脂质体制备单因素实验研究的基础上，进行叶黄素花青 素脂质体响应面优化工艺实验，选取超声温度，均质时间，膜材用量，ph 等 4 个 主要因素为自变量，以包封率为响应值用 design expert 7.0 软件设计四因素三水平 响应面优化叶黄素花青素脂质体制备实验。分别将超声温度、乳化时间、膜材 用量、ph 编码为 x1、x2、x3、x4，设计四因素三水平二十九组叶黄素花青素 脂质体响应面试验。其中有二十四组析因实验，五组重复性中心实验，用以估计 实验的标准误差，叶黄素花青素脂质体实验因素与水平编码表见表 2-3。 表 2-3 叶黄素花青素脂质体因素水平表 table 2-3 the factor level table of xanthophyll-anthocyanin liposome 因素下水平(-1)零水平(0)上水平(+1) 超声温度（）306080 均质时间（min）204060 膜材用量(%)6810 ph6810 2.3.5 各因素对叶黄素花青素脂质体稳定性影响 将在最优条件下制备好的叶黄素花青素脂质体以 1:10 的比例溶于水中，用 公式 2-3 测定其在不同光照条件、温度以及 ph 条件下的保存率，以此评定叶黄素 花青素脂质体在不同条件下的保存率。 %100(%) 1 2 = w w s（2-3） 其中 s 为叶黄素花青素脂质体的保存率，w1为储存之前叶黄素花青素脂 质体的质量，w2为储存之后叶黄素花青素脂质体的质量。 2.3.5.1 光照对叶黄素花青素脂质体稳定性影响 取 ph 为 3.0 的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释的聚合体溶液 50ml 倒入 100ml 三角瓶中，分别置于室外自然光、室内自然光、室内暗处，每五天测一次保存率， 持续记录 30 天。 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 18 2.3.5.2 温度对叶黄素花青素脂质体稳定性影响 取 ph 3.0 的柠檬酸柠檬酸钠缓冲液稀释的聚合体溶液 50ml 倒入 100ml 三 角瓶中，分别置于 30，50，70的烘箱中保存，每五天测一次保存率，持续 30 天。 2.3.5.3 ph 对叶黄素花青素脂质体稳定性影响 用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调节叶黄素花青素脂质体的 ph， 将叶黄素花青 素脂质体的 ph 分别调节为 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，放置于 40的烘 箱中，每隔 5 天测一次保存率，历时 30 天看其保存率随时间的变化。 2.3.6 叶黄素花青素脂质体的体外抗氧化实验 2.3.6.1 清除 abts 自由基 参照 pellegrini72方法，以双蒸水配制 abts 自由基母液，在 4冰箱内暗光 恒温保存，临用时将暗光保藏的母液稀释至一定浓度作为工作液，工作液吸光度 值(0.700.02)。准确称体积为 0.1 ml 不同浓度的叶黄素花青素脂质体溶液，加 入到 10 ml 试管中，向盛有不同浓度叶黄素花青素脂质体样品的试管中分别加 入 1.4ml abts 工作液，所得样品浓度分别为 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 12.0 16.0 20.0 g/ml，于暗处放置 30 分钟，在 734nm 处测定其吸光度值 a1；同法操作，用等体积 双蒸水代替叶黄素花青素脂质体，测定溶液吸光度值 a0，作为空白对照的吸光 值；不加 abts 溶液，用等体积双蒸水代替 abts 溶液，加入不同浓度叶黄素 花青素脂质体，采用相同的方法操作测定 a2，用以扣除样品本身对吸光度值测定 的干扰。采用叶黄素和花青素作为对照，用以评价叶黄素-花青素的协同抗氧化能 力。 通过式 2-4 计算叶黄素、 花青素以及叶黄素花青素脂质体对 abts 自由基的 清除活性，以样品浓度为横坐标，清除率为纵坐标，制作样品浓度与 abts 自由 基清除率关系曲线。 %100 )( (%) 0 210 = a aaa d(2-4) 2.3.6.2 清除 dpph 自由基 参照 brandwilliams42等的方法，将三种样品的浓度分别配制为 20g/ml,40 g/ml,60g/ml,80g/ml,100g/ml,测定三种样品在不同浓度梯度下的清除 dpph 自由基的能力。25水浴 30min，在 517nm 下测定吸光度 a1。用等体积乙醇代替 样品，测定吸光值 a0，用作空白对照的吸光值；不加 dpph 溶液，用等体积乙醇 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 19 溶液代替 dpph，向试管中加入不同浓度叶黄素花青素脂质体溶液，采用相同的 方法操作测定 a2，用以扣除样品本身的干扰。以样品浓度为横坐标，清除率为纵 坐标， 制作样品浓度与 dpph 自由基清除率的曲线， 按照公式 2-5 分别计算叶黄素、 花青素和叶黄素花青素脂质体对 dpph 自由基的清除活性。采用叶黄素和花青 素作为参照，用以评价叶黄素-花青素的协同抗氧化能力。 %100 )( (%) 0 210 = a aaa d （2-5） 2.3.6.3 清除羟基自由基 清除羟基自由基反应混合物体系