肾炎四味片对慢性肾脏病大鼠肾功能保护作用的实验研究课件

肾炎四味片对慢性肾脏病大鼠 肾功能保护作用的实验研究 河北医科大学第三医院 河北省肾脏病研究中心 林海英 概 述 肾炎四味片由细梗胡枝子、北京石韦、黄芪、 黄芩等药物组成，可活血化瘀，清热解毒，补肾益 气之功效。 概 述 胡枝子又名随军茶，其味微苦，性平，具强筋益肾，健 脾祛湿，润肺清热、利水通淋之功效，为肾炎四味片的君药 之一，含有槲皮素，三叶豆甙等成分，是湖北民间治疗慢性 肾炎的有效单方。从中提取的黄酮甙可增加尿素及氯离子的 排出，其茎及叶的醇提取物均 可作成注射剂而应用于慢性肾炎患者， 另外从本属植物中已分离鉴定的化学 成分有黄酮、生物碱、三萜、有机酸 及甾醇类，药理实验表明其具有抗炎、 镇痛、利尿和改善肾功能等作用。 概 述 石苇，味苦，甘，性微寒，有利水通淋 、清肺泄热、止血的功能，可用于淋痛，尿 血，尿路结石，肾炎浮肿，崩漏，痢疾，肺 热咳嗽等症。 黄芩系唇形科植物的干燥根，性寒，味苦 ，具有泻实火，除湿热，止血等作用。 概 述 黄芪，性微温，味甘，具补气固表，利尿托毒，排脓， 敛疮生肌之功效，用于气虚乏力，中气下陷，表虚自汗，气 虚水肿，血虚痿黄，内热消渴，慢性肾炎蛋白尿，糖尿病等 症。现代药理研究证实，黄 芪具有显著的抗氧化活性，并且可 通过提高血浆白蛋白水平、调节脂 质代谢、促进水钠排泄、改善高凝 状态、减轻肾损伤、保护肾功能等 作用来治疗肾病。 概 述 本研究应用肾炎四味片对多种慢性肾脏病动 物模型进行干预，了解肾炎四味片对肾脏的保护作 用及其机制 。 肾炎四味片对DM大鼠肾脏保护作用的实验研究 肾炎四味片对UUO大鼠肾脏肾脏纤维化的影响 肾炎四味片对5/6肾切除大鼠肾脏致纤维化因子的影响 动物模型的制备 第一部分 清洁级健康雄性SD大鼠45只（体重20020g，河北 医科大学实验动物中心提供），随机抽取30只腹腔注射链 脲佐菌素（streptozotocin，STZ），制备DM大鼠模型， 余15只注射相当体积的柠檬酸缓冲液做为正常对照组（A 组）。48小时后尾静脉采血测定血糖16.7mmol/L，试纸 法尿糖+确定为DM大鼠模型。 给药方法 30只DM大鼠随机分为DM对照组（B 组）15只、肾炎 四味片干预组（C组）15 只。C 组给予肾炎四味片(湖北亿 雄祥瑞药业有限公司提供)2.16g/kg/d（溶于2ml自来水中） 灌胃，每日一次，A、B组仅给予2ml自来水灌胃，连续8 12周。整个实验期间大鼠自由饮食，不使用胰岛素及其它 降糖药物。 第一部分 标本的留取及检测 实验开始后8、12周末每组随机取7只大鼠称重、收集24h 尿，断头取血，左肾称重后取肾脏上极皮质约 1mm3放入 4%戊二醛溶液中，取1/4肾组织置于4多聚甲醛中。 AU2700型自动生化分析仪检测：血糖、血肌酐、尿肌酐 、24小时尿蛋白定量，计算肌酐清除率，结果用体重校正 。 常规病理学检查：4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，行HE、 PAS和Masson染色；电镜标本采用戊二醛、锇酸双重固定 ，Epon812环氧树脂包埋，铀-铅双重染色。 免疫组织化学检查：采用ABC法。以HPIAS-1000高清晰 度彩色病理图文分析系统对TGF-1和-SMA表达进行半定 量分析，计算阳性面积比。 第一部分 统计学处理 第一部分 所有数据用均数标准差表示，齐性检验后组间差异 性比较采用单因素方差分析和t检验，应用SPSS14.0软件 包进行分析。 结果 第一部分 Comparison of blood glucose、urine volume、24-hours urinary protein、ratio of kidney to body weight and creatinine clearance rate in all groups p0.05)。 第二部分 结果 HE 染色 group A at day 14group C at day 14 group D at day 14 MASSON 染色 第二部分 结果 不同时间各组肾间质胶原相对面积 （均数标准差，n=5，%） 与B组比较p0.05，*与A组比较，p0.05，组内 比较，p0.05，*与C组比较p0.05。 第二部分 结果 肾间质TGF- 1 表达的半定量分析(%) 与B组比较p0.05，*与A组比较，p0.05，组内间 比较，p0.05，*与C组比较p0.05，*与A组比较，p0.05，组内间 比较，p0.05，*与C组比较p0.05 第二部分 结论 梗阻大鼠肾间质TGF-1的表达随着梗阻时间的延长明显增 多，与同时间点梗阻组相比，治疗组TGF-1表达减少，差 异具有统计学意义，但治疗组的TGF-1表达仍明显高于假 手术组，表明TGF-1的高水平表达加速间质纤维化的进程 ，肾炎四味片可有效抑制TGF-1的表达，延缓肾间质纤维 化的进展。 梗阻大鼠肾间质NF-B 的表达随着梗阻时间的延长明显增 多，与同时间点梗阻组相比，治疗组NF-B 表达减少，差 异有统计学意义，表明NF-B 的高水平表达加速间质纤维 化的进程，肾炎四味片可有效抑制NF-B 的表达。 肾炎四味片对DM大鼠肾脏保护作用的实验研究 肾炎四味片对UUO大鼠肾脏肾脏纤维化的影响 肾炎四味片对5/6肾切除大鼠肾脏致纤维化因子的影响 第三部分 动物模型的制备及给药 清洁级健康雄性Wistar大鼠72只，体重20010克，随机分 为假手术组(A组)、模型组(B组)、干预组(C组)、空白对照组(D 组) 。10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉，右侧卧位固定 大鼠，左肋脊角入口，游离肾脏，游离肾上腺及肾上腺动脉， 将左侧肾脏上、下极各切除约1/3大小的肾脏，凝胶海绵压迫 止血，缝合包膜，将肾脏送回腹腔，7d后行右侧肾脏切除术， 假手术组也行两次手术，仅开腹游离肾脏后即关腹，空白对照 组不行手术。A、B两组予生理盐水2ml灌胃，1/日，C、D两组 予肾炎四味片2.16g/kg/d加入上述同等剂量生理盐水中灌胃， 1/日，4组均于术后3天给药，于术后第30、60、90天分三批 处死，每批每组各6只。 第三部分 标本的采集、检测 及统计学分析 血、尿液标本：术后第30、60、90天留取24小时尿液，记 录尿量，取2ml检测尿肌酐排泄量及24小时尿蛋白定量；留 尿后断头取血3ml，静置后离心，取血清检测血肌酐。 肾组织病理检查：取残肾组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包 埋，用于HE、Masson、PAS染色，观察肾小球及肾间质纤维 化程度，肾组织炎细胞浸润数目。 免疫组织化学检测ACTA、TGF-1、-SMA ：采用ABC法检 测。应用HPIAS-1000进行半定量分析，计算阳性面积比。 统计学分析：计量资料用均数标准差表示，组间比较采 用单因素方差分析,组内比较采用t检验，在SPSS 10.0统计 软件上进行分析，以P0.05为有统计学意义。 第三部分 结果 各组大鼠生化指标的变化 与D组比较p0.05，与A组比较p0.05，*与B组比较，在 术后第30天及第60天无显著差异p0.05，至90天时p0.05。 第三部分 结果 PAS staining200 in all group 90 A D B C 第三部分 结果 MASSON staining200 in all group 90 D B C A 第三部分 结果 Immunohistochemical for TGF-1 in all of group 90 200 D B C A 第三部分 结果 Immunohistochemical for ACTIN-A in all of group 90 200 D B C A 第三部分 结果 Immunohistochemical for SMA in all of group 90 200 D B C A 第三部分 结论 5/6肾切除大鼠血肌酐进行性升高，Ccr进行性下降，病变早期 可见肾小球代偿性肥大，系膜细胞及基质轻度增生，随梗阻时间 延长病变逐渐加重，至90天时可见局灶节段硬化，部分肾小球发 展至球性硬化，肾小管灶状萎缩部分代偿扩张，间质灶状纤维化 ，可见淋巴及单核细胞浸润。肾炎四味片组在90天时纤维化程度 较同期模型组减轻，提示肾炎四味片可减轻肾纤维化程度。 术后30天即出现肾炎四味片组ACTA、TGF-1、-SMA较假手术 组及肾炎四味片空白对照组表达明显增多、较模型组表达减少， 且随梗阻时间延长变化更明显，提示肾炎四味片减轻肾纤维化的 作用可能是通过