缺血性心脏病的基因治疗课件

缺血性心脏病的基因治疗 袁 洪 中南大学湘雅三医院 湖南省高血压研究中心 定义 早期是指用正常的基因整合入细胞 基因组，以校正和置换致病基因的一种 治疗方法。 目前广义上来讲是指将某种遗传物 质转移到患者细胞内，使其在体内发挥 作用，以达到治疗疾病目的的方法。 基因治疗的概念 q 基因矫正 (gene correction) q 基因置换 (gene replacement) q 基因增补 (gene augmentation) q 基因失活 (gene inactivation) 基因治疗的基本方法 基因治疗的两种形式 体细胞基因治疗 种系基因治疗 v只限于某一体细胞的 基因的改变 v只限于某个体的当代 v对缺陷的生殖细胞进 行矫正 v当代及子代 导入的方式 l体外导入（ex vivo） 体外将基因导入细胞内 再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内 使这种带外源基因的细胞在体内表达 达到治疗或预防的目的 l体内导入（in vivo） 外源基因直接导入体内有关的组织细胞 使其进入相应的细胞 并表达 基因治疗的两种途径 载体 目的基因 in vivo ex vivo靶细胞 v策略：直接基因治疗和间接基因治疗 直接基因治疗：纠正突变基因在原位修 复缺陷的基因，以达到治疗目的。 为较理想的基因治疗策略（未实现） 基因治疗策略 q 间接疗法： 以正常的基因替代致病基因。 导入外源正常基因，代替有缺陷的基因。而 对 靶细胞而言，没有去除或修复有缺陷的基因。 用DNA重组技术设法修复患者细胞中有缺陷的 基因，使细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的 目的。 基因治疗的基本程序 治疗性基因的选择 基因载体的选择 靶细胞的选择 基因转移 外源基因表达的筛选 利用在体中的标记基因 回输体内 病毒载体 非病毒载体 体细胞 生殖细胞 间接体内疗法 直接体内疗法 q 1995年Isner应用血管内皮生长因子基因治 疗 梗塞性血管病 q 目前已近1000个临床基因治疗方案， 心血 管 病只占5-8%左右 q 成功率却是最高的，主要为促血管生成因 子 的基因 心脑血管病的基因治疗基本的条件 基因的选择-发病的分子生物学机制 基因运载系统-目前主要的限速因素 基因在体内的表达与调控-最薄弱的环节 基因治疗与血管新生 冠脉多支血管病变 弥漫性病变或小血管病变 支架内再狭窄及慢性完全闭塞 侧 枝 循 环 的 建 立 治疗性血管生长潜能的因子 v生长因子:VEGF，VEGF-B，VEGF-C， VEGF-D ，VEGF-E，PLGF FGF-1，FGF-2，FGF-4， FGF-5 ,Angiopoietin-1， Angiopoietin-2 HGF， PDGF-BB,GM-CSF,neurotrophin,IGF-1，IGF-2 v趋化因子:MCP-1 v转录因子:HIF-1， Prox-1 v其他: EGR-1，Tissue kallikrein,Cyr61， PR39,Secreted frizzied-related protein,eNOS， iNOS, Del-1 v大多数学者选择血管内皮生长因子( VEGF) 、成纤维细胞生长因子( FGF)、肝细胞生长 因子( HGF )、血管生成素(ANG)和血小板源 生长因子（PDGF)等多肽的基因 v近年来也有学者选择内皮细胞NO合酶的基 因 p 1995年Isner证明给兔肌肉内注射裸VEGF质 粒，可以在肌肉局部表达，并可促进血管新生 和侧枝循环的建立 p 1997年FDA批准6例严重下肢缺血的患者，肌 肉注射2-4mgVEGF质粒DNA，每四周重复一 次，共二次，在6个病人7条患肢均观察到明显 的效果 p 2000年北医所研究的基因缝线是一种裸 DNA(VEGF)直接至体内的转移并表达出相 应的蛋白质 p 北医近年用AV脂质体携带LDLR基因，直 接从门静脉注入，可以在肝细胞中高度表 达，降低血中LDL水平，但一次注射作用只 可持续2-3周 p已经开展的大量I期临床试验证明了基因治疗 的安全性及有效性 p众多研究者报告对不能进行手术治疗的心绞痛 为 III一IV级的患者进行VEGF165基因治疗， 侧支循环改善率高达90%以上 pII期临床试验的结果不够理想，并没有改善 患者的心功能 对于多基因疾病的靶向性问题 v疾病的机制包括内皮损伤、血小板激活 、平滑肌细胞的迁移和增殖、细胞外基 质增加等 v基因治疗针对的靶点为发生病理生理过 程中局部因素或单一环节 v新的更有效和靶向性更强的基因 v活体内导入转移心脏的途径有:心肌内直 接注射、冠状动脉内注射法、心包注射 法、静脉注射法等 v将载体运送到靶组织有多种方法。最理 想的运载方式是直接将载体移植到组织 中 基因转移 v部分临床试验发现，冠脉内注射基因移 植对治疗冠心病心绞痛患者无效，认为 与载体需要通过病变区屏障有关 v心包腔内注射法基因移植临床应用有一 定限制，效果难以确定 v直接心肌内注射是目前最有效的基因移 植方法 病毒载体 q主要有逆转录病毒（RV）、腺病毒（AV）和 腺相关病毒（AAV）等 q病毒性载体均可以诱导机体产生某种程度的免 疫反应存在着插入突变等致瘤、致毒的风险， 载体容量有限 q转染效率高是其主要优势，目前仍然大部分研 究是应用病毒载体，但是主要为肿瘤的治疗方 案 非病毒载体 v病毒脂质体、水凝胶导管、基因缝线、 基因球囊、基因支架、微粒子、人源载 体、氧化铁磁性纳米颗粒等 v病毒脂质体既克服了 AV病毒副作用又提 高了脂质体的转染效率，转染平滑肌细 胞，其转染效率30%40% 靶细胞的选择 靶细胞是指接受外源Gene的体细胞 选择靶细胞的原则是： 1）必须较坚固，便于体外培养和进行遗传技术操作 ； 2）易于由人体分离又便于输回体内; 3）具有增殖优势，生命周期长（能存活几月至几年 ， 或整个生命周期）; 4）易于受外源遗传物质转化 体细胞基因治疗 正常基因转移到体细胞心肌 细胞 有可能成为的靶细胞 q 内皮细胞( ECs) q 内皮祖细胞(EPCs ) q 心脏干细胞( CSCs ) q干细胞能够替代病毒，作为基因治疗 的载体工具 q通过转染基因修饰干细胞特性，以自 体干细胞为载体移植到心肌缺血区域 可以起到良好的血管、心肌细胞再生 作用 措 施： 1.正常基因转移至体外培养的体细胞，有效 表达后，再回输到体内。 2.正常基因导入靶细胞，定位整合到染色体上， 准确的替换异常基因，是理想的措施。 3.随机整合，非特定座位，只要有效的表达即可 达到治疗的目的。 4. 体细胞基因治疗理论上不必矫正所有的体细 。 存在的问题 v 对特定座位基因转移，目前还存在 较大困难； v 随机插入可能引起后代的基因突变。 具备下列条件 v选择适当的疾病，清楚疾病的发病机理 ，Gene的结构和功能 v被纠正的基因已克隆，并清楚Gene表达 与调控机制与条件 v选择适当的受体细胞并在体外有效表达 v安全有效的基因转移方法，以及供利用 的动物模型 细胞治疗 q 血管生成的过程需要多种类型的细胞参与 ，特别是内皮细胞及内皮祖细胞。它们是 新生血管的结构基础 q同时也调控VEGF,bFGF及HGF等多种蛋白 的促血管生成作用 q 2002 年，德国 首先报道10 例经冠状动 脉注入自体骨髓单核细胞改善心肌梗塞 后的心脏功能和心肌灌注 q 随后巴西、以色列、中国和日本等国家 的医学科学家相继报告了骨髓干细胞移 植治疗心肌梗塞的成功 q陈绍良等 于年报道了例病人的随机 对照临床试验，随访 个月发现，移植明 显改善了左室功能，未见与移植 相关的不 良反应 q年M等 发表了 试验 个月，两组左室功能的改善不再存在显著差 异。研究者认为，尽管干细胞移植组的恢复速度 更快，但与安慰剂相比，其对患者左室收缩功能 的长期改善并不明显 q的长期疗效如何仍有待于大样本、随机双 盲对照研究结果而定 细胞治疗的困境 v 治疗对象多为老年人，机体内的干细胞数 量相对减少且细胞功能受损、血管生成的 反应性下降，因此较难获取足够数量的活 性移植细胞 v即使获取足量细胞后，由于细胞治疗涉及 多个环节，而目前对于各个环节的调控机 制并不十分清楚，所以目前对细胞治疗的 效果尚难定论 v 对于移植EPCs是否能够在病变区域生成血 管及改善血供，至今没有统一结论 vMurasawa等报道EPCs不仅可以使病变区域 生成血管，而且还具有分化为心肌细胞的 能力 vVasa等和Hill等的研究提示冠心病患者体内 EPCs的生血管能力受到损坏 v外源性动员EPC 治疗冠心病 虽然已证实EPC 具有较强的促血管新生的作用，但一般来说， 人脐血及外周血中的EPC 数量仍非常少。 v研究表明，在促血管生因子、应激等内外因素 刺激下，EPC 可以被动员到外周血循环，故对 EPC 的动员成为治疗冠心病的另外一个理想途 径。 v迄今研究发现的外源性EPC动员剂有:雌激素、 运动锻炼、干细胞因子(SCF)、粒系集落刺激因 子(G-CSF)、粒系巨噬系集落刺激因子(GM一 CSF) v 冠心病大多数研究仍停留于动物实验阶 段，要将 EPC应用于临床仍有许多问题 需要解决 v 基因治疗的靶向性和安全性EPC的细胞 表面标志仍未完全阐明、内皮细胞生长 因子动员剂的应用是否有致瘤性等 vASC应用存在体外分离、扩增、诱导及移植 后增殖调控等技术问题 v干细胞移植的时机、移植的最佳方法和所 需的细胞量，有待更深人的探讨 v另外，研究发现SC在体外长期传代后， 会发生表型的改变 蛋白治疗 q 上世纪80年代中期VEGF,bFGF及HGF多 种促血管生成因子被分离纯化后，应用 这些因子在多种缺血性疾病动物模型中 开展研究 q希望通过VEGF导人缺血心肌、冠状动脉 或心包内，发挥VEGF的促进血管增生的 生物学作用 qI期临床实验的结果支持蛋白治疗的有效 性 q近年来的II 期临床实验对应用蛋白治疗 的 效果提出了质疑 qSimons等采用重组bFGF对337例病人进行 双盲安慰剂对照II期临床实验，结果显示 治疗组与对照组无显著性差异 评 价 q尽管蛋白治疗可以精确控制药物剂量，但 VEGF在体内的半衰期短，因此必须长期 反复给药 q非自体的重组蛋白可能导致的诸多不良反 应 q单一因子治疗的局