自噬相关蛋白p62及lc3在大鼠急性高眼压模型视网膜中的表达及意义硕士研究生（眼科学）开题报告课件

学院：第二临床医学院 自噬相关蛋白p62及LC3在大鼠急性高眼压 模型视网膜中的表达及意义 研究生：郑冰茹 导师：吴瑜瑜教授 立项依据 目录 研究目的、意义 主要内容及创新点 1 2 3 4 5 8 预期结果及可能的问题 实验进展安排 6 预实验结果 立项依据 青光眼是一组以视网膜神经节细胞（ retinal ganglion cells，RGCs)及其轴突数目 进行性丢失、视盘凹陷扩大、视野缺失为特 征，伴眼压升高的致盲性眼病。 立项依据 青光眼视神经病变的发病机制 立项依据 青光眼视神经病变的发病机制 l 氧化应激反应 l 神经营养因子剥夺 l 谷氨酸兴奋毒性反应 l 胶质细胞的激活 l 免疫调控紊乱 视神经轴突的保护视神经轴突的保护 视盘重塑 RGCsRGCs的保护的保护 立项依据 免疫调控 自噬在青光眼视神经病变发病机制中的作用 自噬 Autophagy 立项依据 自噬（ Autophagy ）即真核生物通过溶 酶体机制降解细胞内组分的过程。细胞通过自 噬降解胞内细胞器、微生物、可溶性蛋白及 RNA以维持胞内稳态，并提供营养物质及代谢 原料。 立项依据 自噬的过程 立项依据 自噬体标记蛋白LC3 l 定义：微管相关蛋白1 轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3/Atg8)是自噬体膜上的标记蛋白。 l 分类：LC3-I蛋白：散在分布在胞浆内 LC3-II蛋白：定位于自噬体的内膜和外膜 l 检测意义：LC3-II的水平在某种程度上反映了自噬体的数量 自噬时表现为LC3-I的减少和LC3-II的增加，通过LC3- II/LC3-I或者LC3-II/(LC3-I+LC3-II)即可反映自噬水平 立项依据 自噬过程的调控 1 Mnika L, Pter L, The role of the selective adaptor p62 and Ubiquitin-Like proteins in Autophagy 立项依据 自噬相关蛋白p62 l 功能：在自噬降解泛素化蛋白、错误折叠及异常积累的蛋白和功能失调的 细胞器的过程中起调控作用 l作用机制：通过LC3相互作用区（LC3 interacting region，LIR）与自噬体 膜的Atg8/LC3结合，从而介导自噬途径对异常积累蛋白及细胞器的识别及降 解。 l 检测意义：自噬流发生时p62水平下降 自噬体形成过多，或自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶 体的过程发生障碍时则p62水平增高 立项依据 p62在凋亡、细胞存活中的作用 立项依据 Kjtaoka Y 3等人研究发现眼压稳定升高时，视神经中p62及LC3-II水平 增高，提示自噬流的聚集参与其中；另外，该研究发现烟酰胺单核苷酸磷 酸转移酶3(nicotinamide mononucleotide adenvlYltransferase，NMNAT)表 达升高，Nmnat能维持轴突蛋白的稳定性和调制轴突内囊泡运输，对轴突发 挥保护作用。抑制细胞内p62水平，促进LC3-II表达，诱导自噬并保护轴突 。 Paul S 4等人发现自噬调节蛋白p62可降解BCLl0，调控NFKBl一 RELA通路，抑制T细胞分化。 3 Kjtaoka Y, Munemasa Y, Kojima K, et a1Axonal protection by Nmnat3 overexpression with involvement of autophagy in optic nerve degenerationJ Cell Death Dis，2013，4：e860. 4 Paul S，Schaefer BCSelective autophagy regulates T cell activationJ. Autophagy，2012，8(1 1) ：16901692 p62在青光眼视神经病变中的作用 立项依据 p62在青光眼视神经病变中的作用 研究目的及意义 研究目的 l 检测大鼠急性高眼压模型中RGCs凋亡率并观察其 形态变化 l 检测p62、LC3蛋白在大鼠急性高眼压模型视网 膜中的表达情况 l 探讨p62在大鼠急性高眼压模型视网膜中的作用 及机制 l 探讨自噬过程与大鼠急性高眼压模型视网膜神经 节细胞存活的联系 研究目的及意义 研究意义 l利用自噬清除细胞内受损细胞器、降解大分子蛋白质 及维持细胞稳态的功能，提高视网膜神经节细胞的耐受 力 l 通过研究自噬调节过程，探讨其可能作用机制，为青 光眼视神经保护提供新的思路 研究主要内容 研究主要内容 大鼠 110cm(约 88mmHg) 0.9%生理盐水 l以瓶内的液体不再向眼内滴注、虹 膜苍白和视网膜苍白水肿等作为动物 眼达到外界给定压强的判断依据，维 持高眼压状态60min l优点：操作简单，研究时程短，结 果具有较好的可重复性。 成年雌性SD大鼠55只 正常对照组急性高眼压组 建模 24h48h12h1h0h 免疫组化 Western- blot 细胞免疫 荧光 HE染色TUNEL法 p62、LC3蛋白在视网膜的 定性及定位情况 计算RGCs的数量； 检测RGCs的凋亡率 p62、LC3蛋 白在视网膜的 定量检测 技术路线图 主要创新点 l 思路创新：以往关于青光眼视神经病变的研究主要集中在视 网膜神经节细胞凋亡的信号通路，而本实验从新的角度自 噬探讨其在大鼠急性高眼压模型视网膜神经节细胞的作用 l 实验设计：自噬是一个随时间不断变化的动态过程。因此 ，实验设计根据五个不同时间点对实验动物进行分组；并分 别从形态学，蛋白质水平出发，更全面分析自噬过程与视网 膜神经节细胞之间的关联 预期结果 l HE染色：正常对照组可见视网膜各层分布整齐结构清晰，高眼 压组初期视网膜呈水肿状态，随着时间延长，各层呈萎缩状态； lTUNEL法：高眼压组凋亡率随时间延长而增加； l免疫组化：高眼压组p62、LC3蛋白在视网膜多层中均有表达； lWesternblot：高眼压组p62蛋白的表达随着时间先减少，随后 增加；LC3蛋白的表达随时间延长先增加，随后减少 问题及解决方案 实验过程问题解决方案 造模过程麻醉不足，动物提前苏 醒；麻醉过深，动物致 死 严格按量麻醉，正确腹 腔注射，缩短操作时间 取材过程眼球标本的保存提前准备液氮用以冰冻 保存，4%多聚甲醛固定 检测过程检测机器误差 人为造成误差 尽可能在同一台仪器测 量，并多次重复测量 预实验结果 正 常0h1h48h12h 24h LC3-I LC3-II -actin 实验