基层培训免疫学技术ppt课件

第五章 常用免疫学检验技术 临床免疫检验是运用免疫学基本的基本原 理和技术，检查临床标本中的微生物抗原 、肿瘤抗原以及相应的微生物抗体、自身 抗体，为感染性性疾病、肿瘤、自身免疫 病以及免疫缺陷提供诊断依据。 免疫检验分为两个部分，一部分为利用免疫检 测原理检测免疫活性细胞、抗原、抗体、补体 、细胞因子、细胞粘附分子等免疫相关物质， 另一部分是利用免疫检测原理检测体液中微量 物质如激素、酶、血浆微量蛋白、血液药物浓 度、微量元素等。这些检测结果为临床上确定 诊断、分析病情、调整治疗方案和判断预后等 提供了有效的实验依据。 第一节 免疫学检验原理、特点和方法 一、免疫学检验原理 （一）抗原抗体反应是抗原与相应抗体之间的特异性结 合反应。它既可发生在体内，也可发生在体外。在体内 发生的抗原抗体反应即为体液免疫应答的效应作用。体 外的抗原抗体结合反应，根据参与反应的抗原的物理性 状（可溶性或颗粒性）以及参与反应的条件（电解质、 补体等）不同，表现出不同的现象，如沉淀、凝集、细 胞溶解、补体结合和毒素中和等。一般将检查血清中病 原微生物抗原和抗体的试验称为血清学试验。 抗原抗体反应可分为两个阶段。第一阶段为特异 性结合阶段，此阶段仅需数秒至数分钟，但并不 出现可见的反应；第二阶段为可见反应阶段，这 一阶段抗原抗体复合物在适当的电解质、pH、 温度和补体等的影响下，进一步交联聚集，出现 凝集、沉淀、溶解和补体结合介导的生物现象等 肉眼可见的反应。第二阶段反应较慢，往往需要 数分钟至数小时。这两个阶段不能严格划分，所 需的时间也受多种因素的影响。 （二）抗原抗体反应的特点： 1、特异性 抗原抗体反应的特异性（specificity）是指抗原分子上 的抗原决定簇和抗体分子超变区结合的特异性，由这两 个分子之间空间结构的互补性决定的。形同钥匙与锁一 样，所以抗原抗体的结合是有高度特异性的。例如白喉 抗抗毒素只能与相应的外毒素结合，而不能与破伤风外 毒素结合。因此，在抗原抗体反应的免疫学实验中，可 以用已知的抗原或抗体来检测特定的相对应的抗体或抗 原。 2、比例性 比例性（proportionality）是指抗原与抗体特异 性结合反应时，生成肉眼可见结合物的量与反 应物浓度的关系，只有当二者浓度比例适当时 ，才出现可见反应。抗原抗体分子比例合适的 范围，称为抗原抗体反应的等价带。在此范围 抗原抗体结合充分，沉淀物形成得快而多。 在等价带的前后，由于抗体和抗原的过量，上 清液中可测出游离的抗体或抗原，形成的沉淀 物少。当抗体过量时，称为前带，抗原过量时 称为后带。因此，在抗原抗体反应的试验中， 如果没有产生肉眼可见的抗原抗体复合物出现 ，一方面要考虑是否有抗原与相应的抗体存在 ，另一方面还必须注意到两者反应的比例是否 适当。 3、可逆性 抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下 又可解离为游离抗原与抗体的特性称为抗原抗体 结合的可逆性（reversibility）。由于抗原抗体的 结合是分子表面的非共价键结合，故形成的复合 物是不牢固的，在一定的条件下可以解离，所以 说抗原抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一 动态平衡过程。 抗原抗体复合物解离取决于两方面的因素：一是抗体 对相应抗原的亲和力；二是环境因素对复合物的影响 。亲和力高的抗体与抗原表位在空间构型上非常适合 ，两者结合牢固，不容易解离，反之，亲和力低的抗 体与抗原形成的复合物较易解离。环境因素中的过高 或过低均可破坏离子间的静电引力，使抗原抗体的结 合力下降。增加离子强度，也可使静电引力消失，降 低抗原抗体的结合力，促使其解离。解离后的抗原和 抗体仍然保持游离抗原、抗体的生物活性。 （三）影响抗原抗体反应的因素 影响抗原抗体反应的因素较多，主要有 两方面：一是反应物自身的因素，另一方 面是反应环境的因素。 1、反应物自身因素 （1）抗原 抗原的理化性状、表面抗原决定簇的种类和数 目均可影响抗原抗体反应的结果。如颗粒性抗 原与相应抗体结合后产生凝集现象；可溶性抗 原与相应抗体结合后产生沉淀现象；单价抗原 与相应抗体结合后不出现沉淀现象。 （2）抗体 来源 来源于不同动物的免疫血清，其反应性 有差异。家兔等大多数动物的免疫血清，由于 具有较宽的等价带，与相应抗原结合易出现可 见的抗原抗体复合物。马、人的免疫血清等价 带窄，抗原不足或过剩，均易形成可溶性复合 物。单克隆抗体一般不适合用于凝集和沉淀反 应。 浓度 抗体的浓度往往是与抗原相对而言，二 者合适的浓度才易出现可见的反应结果。 特异性和亲和力 特异性与亲和力是影响抗原 抗体反应的关键因素，它们共同影响试验结果 的准确程度。诊断试剂应尽可能选高特异性、 高亲和力的抗体，才能提高试验的可靠性。 2、反应的环境条件 （1）电解质 抗原抗体结合后，由亲水性向疏水性转换过程中必须 要有电解质参与才能进一步使抗原抗体复合物表面失 去电荷，破坏水化层，使复合物相互靠拢聚集，形成 大块凝集、沉淀。若无电解质存在，则不出现可见反 应。在抗原抗体反应中，通常使用0.85%NaCl溶液或 各种缓冲液作抗原抗体的稀释液及反应液。 （2）酸碱度 抗原抗体反应必须在合适的pH环境中进行，pH 过低或过高都会影响抗原抗体的反应。抗原抗 体反应中一般以pH69为宜。有补体参与的反 应pH为7.27.4，超过这个范围会降低补体的酶 活性而影响反应。 （3）温度 抗原抗体反应需要合适的温度才有利于二者结合。一 般以1540为宜，最适温度为37。在此范围内， 温度越高，抗原抗体分子运动越快，碰撞接触机会越 多，两者结合反应速度越快。但是如果温度高于56 ，会导致抗原抗体复合物解离，甚至分子变性。温度 越低，反应速度越缓慢，但抗原抗体结合越牢固，易 于观察。 （4）振荡 在抗原抗体反应中，适当的振摇可促使 抗原抗体分子的接触，加速其反应。 （四）抗原抗体反应的类型 随着免疫学技术的飞速发展，在原有经典免疫 学实验方法基础上，新的免疫学测定方法不断 出现，使免疫学实验技术更特异、更敏感和更 稳定。目前根据抗原和抗体的性质不同，反应 出现的现象和结果的不同，以及反应时参与的 其他条件不同，将抗原抗体反应分为五种类型 。 （1）可溶性抗原与相应抗体结合产生的沉淀 反应；（2）颗粒抗原与相应抗体结合发生的 凝集反应；（3）抗原抗体结合后激活补体所 产生的溶细胞反应；（4）细菌外毒素或病毒 与相应抗体结合所致的中和反应；（5）标记 免疫的抗原抗体反应。每种反应类型都包括若 干实验技术。（见抗原抗体反列应表1） 表1 抗原抗体反应的类型和试验方法 - 反应类型 实验方法 结果判断 - 沉淀反应液相沉淀实验观察沉淀、检测浊度 琼脂凝胶扩散观察和测定扫描沉淀线或环 凝胶电泳技术观察和测定扫描沉淀峰弧等 凝集反应直接凝集实验用裸眼、放大镜或显微镜观察红 细胞或胶乳颗粒的凝集现象 间接凝集实验 同上 凝集抑制实验 同上 协同凝集实验 同上 抗球蛋白实验 同上 - - 补体参与反应补体溶血实验 以裸眼或光电比色仪观察 测定溶血现象 补体结合实验 同上 中和反应 病毒中和实验病毒感染性丧失 毒素中和实验外毒素毒性丢失 标记免疫 荧光免疫技术 检测荧光 放射免疫技术 检测放射性 酶标免疫 检测酶底物显色、发光、荧光 发光免疫技术 检测发光 金标免疫技术 观察金颗沉淀线 - 二、免疫学检验方法和应用 （一）凝集反应 颗粒性抗原或可溶性抗原（或抗体）与载体颗粒结合成致敏颗粒 后，与相应抗体（或抗原）发生特异性反应，在适当电解质存在 下，形成肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应。凝集试验应用广 而且敏感度高，方法简便，迄今已成为通用的免疫学技术之一， 广泛用于细菌的鉴定和分型、抗原分析、测定抗体和诊断疾病等 临床检验。在免疫检验技术中，根据参与反应的颗粒的不同，把 凝集反应分为直接凝集反应和间接凝集反应。而自身红细胞凝集 反应试验和抗球蛋白参与的凝集试验是两种特殊的凝集反应。 1、直接凝集反应： 细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原，在适当 电解质参与下可直接与相应抗体反应，当二者 比例适当时，出现凝集，称为直接凝集反应。 反应中的抗原称为凝集原，参与反应的抗体称 为凝集素。常用的凝集试验有玻片法、试管法 和微量血凝反应板法。 （1）玻片凝集试验：多用于定性。用以知抗体诊断血 清与受检菌液在玻片上混匀，放置数分钟后如抗体与 相应抗原反应即出现肉眼可见的凝集反应。如沙门菌 玻片凝集试验。 （2）试管凝集试验：多用于半定量和定量试验，常用 已知一定量的抗原（细菌、细胞等）与一系列稀释的 病人血清混合，在保温放置后观察结果，判定受检血 清有无相应抗体以及效价，如肥达反应。 2、间接凝集反应：将可溶性抗原（或抗体）先吸附 或偶联与免疫无关大小适当的颗粒表面，使之成为致 敏载体颗粒，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适 宜的电解质存在条件下，出现特异性的凝集现象，称 为间接凝集反应。其敏感度比直接凝集反应高28倍 ，亦明显高于沉淀反应。在临床上广泛用于各种抗体 和可溶性抗原的检测。间接凝集反应试验可分为： （1）间接凝集试验：用抗原致敏载体以检测标 本中的相应抗体。将可溶性抗原与载体颗粒结 合，再与样品中的抗体反应，形成肉眼可见的 凝集颗粒或凝集块者为阳性。 （2）反向间接凝集试验：用已知特异性抗 体致敏载体以检测标本中的相应抗原。临床 上用于检测HbsAg、AFP等。 （3）间接抑制试验：试剂为已知抗原致敏的颗 粒载体和相应的抗体，用于检测标本中与致敏 抗原相同的抗原。检测方法是将标本与抗体试 剂混合反应，然后加入致敏载体，若出现凝集 ，说明标本中不存在相应抗原，抗体试剂未被 结合，仍与载体上的抗原反应；如未出现凝集 ，则说明标本中含有相应抗原，凝集反应被抑 制。 （4）协同凝集试验：其原理同反向间接凝集试 验，但所用的载体是金黄色葡萄球菌，其细胞 壁中有A蛋白（SPA），SPA具有能与特异性抗 体IgG的Fc段结合的特性。当这种葡萄球菌与 IgG抗体连接时，就成为抗体致敏的颗粒载体， 若与相应抗原接触，就会出现反向间接凝集反 应，常用于细菌、病毒、毒素及可溶性抗原的 快速检测。 间接血凝试验：是以红细胞作为载体的间接凝集试 验。可根据红细胞凝集的程度判断阳性反应的强弱。 在临床检测中应用广泛，是经典的抗原抗体反应之一 。 胶乳凝集试验：是以聚苯乙烯胶乳微粒为载体的间 接凝集试验。 明胶凝集试验：即以明胶颗粒为载体的间接凝集试 验。常用于血清中抗病毒抗体的检测。 间接凝集试验的应用 间接凝集试验具有敏感、快速、操作简便和 不需要特殊仪器等优点，既可以检测抗原， 又可以检测抗体。已广泛应用于医学检验。 特别是对某些疾病的诊断治疗和效果的观察 有着重要的参考价值。 （1）抗体的检测 用于检测微生物、寄生虫等感染所 产生的抗体及自身抗体和药物抗体。如检测沙门菌抗 体和类风湿因子等。 （2）抗原的检测 用于在临床上用反向间接凝集试验 检测甲胎蛋白抗原和乙型肝炎病毒流行病学调查。在 妇产科常用胶乳凝集试验检测孕妇尿中的绒毛膜促性 腺激素（HCG）抗原。以诊断早期妊娠。 （二）沉淀反应 沉淀反应是可溶性抗原与相应抗体在适当的条件下发生特异性结 合而产生沉淀的现象。沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖等可 溶性物质。抗原与相应抗体再介质中或固相表面发生特异性结合 ，可分为两个阶段，第一阶段为抗原抗体特异性结合反应，在几 秒或几十秒内就可完成，出现可溶性小附和物，十分快速，但肉 眼不可见。在免疫比浊法中可以测定免疫复合物形成的速率，称 为速率比浊法。第二阶段则形成大的可见的免疫复合物，需要几 十分钟到数小时才能完成。如沉淀线或沉淀环。沉淀反应的常用 试验方法有： 1、液体内沉淀试验 （1）絮状沉淀试验：将抗原和抗体溶液混合在 一起，在电解质存在下，抗原与抗体结合形成絮 状沉淀物。 （2）免疫浊度测定：是将光学测量仪器与分析 检测系统相结合应用于沉淀反应，对各种液体介 质中的微量抗原、抗体和药物及其它小分子半抗 原物质进行定量测定的方法。 其原理是：当可溶性抗原与相应抗体在适当比 例结合时，在特殊缓冲液中快速形成一定大小 的抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。采用 透射比浊或散射比浊的方法，根据所测的吸光 度值可推算出待测抗原的量。免疫浊度测定又 可分为速率比浊法和终点比浊法。其优点是可 以准确定量，校正曲线比较稳定，简便快捷， 无污染，易于自动化，也适合于大批量标本的 检测，在临床检验中得到了广泛应用。 2、凝胶内沉淀试验：利用可溶性抗原与相应抗 体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体 浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或 沉淀环。根据抗原抗体反应的方式和特性，发 展为以下几种实验技术： （1）单向扩散试验：在琼脂凝胶中混入一定量 的抗体，使待测抗原溶液从局部向琼脂内自由 扩散，在一定区域内形成可见的沉淀环。 （2）双向扩散试验：在琼脂内抗原和抗体各自 向对方扩散，在最适当的比例处形成抗原抗体 沉淀线，观察沉淀线的位置、形状及对比关系 ，可作抗原和抗体的定性分析。 （3）免疫电泳技术：是将琼脂内电泳与免疫扩 散相结合的一种常用的一种免疫学实验方法。 有对流免疫电泳、火箭电泳、交叉免疫电泳、 免疫电泳、固相免疫电泳等实验技术。 （三）补体结合试验： 是经典途径的抗原抗体反应之一，应用绵羊红 细胞和溶血剂作指示剂，建立了检测抗原抗体 与补体结合的方法，如检测梅毒的华氏试验（ 现已被淘汰）。凡是能激活补体的IgG、IgM类 抗体与相应抗原结合的反应都可以用本法检测 。目前主要用于病毒性传染病诊断、流行病学 调查以及一些自身抗体、肿瘤相关抗原等的检 测。 （四）免疫标记技术 免疫标记技术是将多种可以微量或超微量检测的示踪物（ 如荧光素、放射性核素、酶、化学或生物发光剂）对抗原 或抗体进行标记，制成标记物，加入抗原抗体反应体系中 与相应未标记抗体或抗原进行反应，使免疫反应结果可被 灵敏地进行分析测定。可以不测定免疫复合物本身，仅对 其中的标记物进行测定就可确定待测物质的含量。因此， 免疫标记技术具有高度特异性和高度敏感性，由于它具有 重复性好、准确性高、操作简便、易于商品化和自动化的 特点，现已发展成为生物活性物质分析重要的方法之一。 1、放射免疫技术 放射免疫技术是利用放射性核素的灵敏性和精确性与 抗原抗体反应的特异性相结合而创建的一类免疫测定 技术。常用的放射性核素有 125I和 131I等，主要有两种 基本类型：（1）放射免疫分析：是最经典的模式， 是以放射性核素标记的抗原与反应系统中未标记的抗 原竞争特异性抗体为基本原理来测定抗原含量的分析 方法。（2）免疫放射分析：是用放射性核素标记的 过量抗体方法。抗体与待测抗原直接结合，采用固相 免疫吸附载体分离结合与游离标记抗体的非竞争放射 免疫分析。 放射免疫技术由于其测定的灵敏度高，特异性 强、精密度好，而且可对抗原和半抗原进行测 定，对仪器设备条件要求不高，所以广泛应用 于医学检验。常用于各种激素、微量蛋白质、 肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。其缺点 是：放射性污染和危害；常用核素半衰期短， 试剂盒稳定期短、不易快速及自动化检验等， 已逐步被其它标记免疫分析方法所取代。 2、荧光免疫技术 荧光免疫技术是将免疫学反应的特异性与荧光技术的 敏感性结合起来的一种方法，是最早发展的一种免疫 标记技术。其原理是利用荧光素标记抗体，使之在涂 片上或组织切片上与标本的待测抗原特异性地结合， 采用高发光效率的点光源，透过滤光板发出一定波长 的光，使结合在标本上的荧光素被激发而产生荧光， 然后借助荧光显微镜观察底物片上的荧光染色形态， 判断待测抗原或抗体。 荧光免疫技术在临床检验上常用作细菌、病毒 和寄生虫的检验以及自身抗体的检测。免疫荧 光间接染色法可用于测定血清中的抗体，如免 疫荧光用于梅毒螺旋体抗体的检测是梅毒特异 性诊断方法之一。间接免疫荧光试验是当前公 认的最有效的检测疟疾抗体的方法。 3、酶免疫技术 酶免疫技术是经典标记免疫技术之一，是以酶标记抗 体或抗原为主要试剂的一种标记免疫分析技术。酶免 疫技术是利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高 特异性抗原-抗体免疫学反应检测敏感性的一种标记免 疫技术。临床常用的酶免疫技术是酶联免疫吸附试验 （见第三章第3节） 酶免疫测定除具有高度的敏感性和特异性，酶标记试剂 比较稳定，而且易与其他相关技术偶联，因此发展迅速 。市场上各种符合质量要求的商品试剂盒（提供有包被 好的的固相载体、酶标记物及其底物和洗涤液等全套试 剂成分）和自动或半自动检测仪上不断研究发明问世， 极大地促进了酶免疫测定技术的普及。特别是固相载体 酶免疫技术与胶体金技术等的结合，使市场上出现了一 大批适用于家庭及床旁检测的快速试剂盒，大大方便了 人群的自我保健和临床的快速诊断。ELISA则应用更为 广泛，几乎所有的可溶性抗原抗体系统均可用以检测。 该技术的检测灵敏度高、特异性强、准确性好，酶标记 试剂能够较长时间保持稳定，检测方法简便安全易行， 而且容易与其他技术偶联衍生出适用范围更广的新方法 等。因此，酶免疫技术在方法学上的研究重点除与其他 标记免疫技术一样需制备高纯度抗原和高亲和力的特异 性抗体外，还包括：选择高活性的纯化标记用酶；试验 有效的交联试剂和交联反应，制备高质量的酶标记物； 选用适宜的酶作用底物系统；确定有效的分离结合/游 离反应物的方法；筛选操作步骤以及研究自动化测定技 术等。 4、金标免疫技术 是以胶体金为标记物的 免疫标记技术。（见第三章第4节） 第二节 免疫胶乳试验及应用 一、胶乳凝集试验原理及方法 （一）原理：胶乳凝集试验是以聚苯乙烯胶乳 颗粒为载体的间接凝集试验。使用抗原或抗体 致敏胶乳颗粒，再用此致敏胶乳检测相应的抗 体或抗原。胶乳凝集试验所用的胶乳颗粒是人 工合成的载体，均一性较好，性能比红细胞稳 定，但与蛋白质的结合能力及凝集性能不如红 细胞，因此胶乳凝集试验敏感性不如血凝试验 。 （二） 试验方法： 1、胶乳凝集试验：在反应板的一格中，先加受检标 本一滴，再加致敏胶乳一滴，连续摇动23min观察 结果。胶乳凝集者为阳性。不凝集者为阴性。同时作 阴、阳性对照。 2、胶乳凝集抑制试验：先加受检标本一滴，再加一 滴相应抗血清混匀，再加一滴致敏胶乳抗原，连续摇 动23min观察结果。胶乳凝集者为阴性，不凝集者 为阳性。 （三） 注意事项： 1、受检标本和试剂的加入顺序应遵照规定的步骤，否 则无法判定结果。 2、试剂一般保存在46较为适宜，胶乳试剂不能冷 冻，试验前取出待接近室温时的温度再使用。 3、此试验一般作定性检测，严格的操作也能达到半定 量的要求。滴加标本和试剂时，液滴大小应均匀一致 ，每滴约50l。 二、抗链球菌溶血素“O”的测定 （一）试验原理：在受检者血清标本中，加入 适量的溶血素“O”。如标本中含有高单位抗体， 中和后则有多余的抗体存在，与溶血素“O”致敏 的胶乳试剂反应，可出现清晰而均匀的凝集颗 粒。 （二） 试验步骤： 1、将溶血素“O”贮存液用生理盐水稀释到每ml含5和2.5结合单 位的两种了应用液。 2、血清标本5630min灭活后用生理盐水作1：50稀释。 3、在胶乳试验反应板上滴入稀释血清标本1滴，再滴加2.5结合 单位应用液1滴，轻轻摇动3min，使其均匀。 4、滴加ASO胶乳1滴，轻轻摇动8min，有清晰凝集者为阳性。 5、将阳性血清用5结合单位应用液重复试验，有清晰凝集者为 强阳性。 （三） 临床意义 1、阴性者250u，阳性者ASO在330500 u，强阳性者 ASO在625 u以上。 2、正常健康人ASO水平随地区、年龄、气候、季节、 环境条件不同而异，通常成人在250 u以内，3岁以下儿 童在100 u以内者均属正常。 3、A群溶血性链球菌感染后，80%85%的患者ASO 升高。35周达最高值，两个月后开始下降，612个 月恢复到正常水平。用于诊断急性风湿热和慢性风湿性 关节炎。 （四）注意事项： 1、患者标本应新鲜，如被细菌污染或严重溶血 者，可影响结果，引起假阳性。 2、高血脂标本，试管或试剂被胆固醇污染均可 出现假阳性。 3、所用器具应清洁，取量要准确。 4、溶血素“O”单位标定不准，常可影响结果。每次 试验应取一个已知的ASO单位的标本为对照，如出现 偏高或偏低的结果，应重新测定溶血素“O”的结合量 。 5、链球菌溶血素“O”在pH 6.5时活性最强，偏酸或偏 碱均可影响结果。 6、胶乳试剂不可冰冻，放置4冰箱可保存一年。不 同胶乳商品试剂有不同要求，操作前应仔细阅读说明 书。 三、类风湿因子RF的检测 类风湿性关节炎（RA）是由自身抗体-免疫复合物引起的自身 免疫性疾病。多发于青壮年，女性多于男性。患者由于感染、 炎症等原因产生了变性IgG。变性IgG成为自身抗原，刺激免疫 系统产生了各种抗变性IgG抗体，即类风湿因子RF。变性IgG 与类风湿因子结合，形成中等大小的免疫复合物，沉积于关节 等部位，激活补体，引起慢性渐进性免疫炎症性损害，严重时 可累及心、肺和血管等，免疫学检查血清和关节滑膜液中出现 类风湿因子。 （一）试验原理：胶乳凝集法，将热凝聚IgG包被于 聚苯乙烯胶乳颗粒表面，如待测血清中含有RF，与相 应抗原结合，产生肉眼可见的凝集反应。 （二）试验步骤：按试剂盒说明书操作，待测血清预 先5630min灭活，再用0.1mol/L，pH8.2甘氨酸缓冲 液作1：201：80稀释，取各稀释度血清一滴，加于 反应板上，滴加RF胶乳试剂一滴，充分混匀并轻轻摇 动反应板，3min内出现明显凝集者为阳性， （三）临床意义 正常人用本法检测常为阴性。阳性主要见于类风湿性 关节炎患者。另外，干燥综合征、冷球蛋白血症、亚 急性细菌性心内膜炎、肝硬化、慢性肝炎等疾病也可 阳性。因此RF对类风湿性关节炎患者并不具有严格的 特异性，RF阳性不能作为诊断类风湿性关节炎的惟一 标准。尽管在多种疾病RF可阳性，但是滴度均较低， 随RF滴度增加。对类风湿性关节炎的诊断特异性也增 高。多种疾病RF测定阳性率如表2。 表2 多种疾病RF测定阳性率 - 疾病 RF测定阳性率 - 类风湿性关节炎 79.6% 系统性红斑狼疮 30% 干燥综合征 95% 皮肌炎 80% 硬皮病 80% 混合性结缔组织病 25% - 注意事项： 本法检测出阳性主要为IgM类RF，阳性 血清可连续双倍稀释测效价。每次试验 均应设阴、阳性对照。其它见胶乳凝集 法注意事项。 第三节 酶联免疫技术及应用 一、酶免疫分析技术 酶免疫分析技术是以酶标记的抗体或抗原为主 要试剂的方法，是标记免疫技术中使用最广泛 的一种方法，具有灵敏度高、特异性强、酶标 记物有效期长等优点，现已被广泛应用于医学 检验和生物学的各个领域。 （一）原理和分类 酶是催化化学反应的蛋白质，它具有高效性和专一性 的特点。酶免疫分析技术是将酶的催化放大作用和抗 原抗体反应相结合的一种微量分析技术。酶标记抗原 或抗体后，既不影响抗原或抗体免疫反应的特异性， 也不改变酶本身的活性。免疫反应进行以后，酶还能 催化相应的底物显色，最后利用酶标仪检测颜色的深 浅来进行定性或定量分析。显色反应显示酶的存在， 表示结合或游离的酶标抗原或抗体的量的变化。 根据反应过程中是否将结合的酶标记物和游离的 酶标记物分离，把酶免疫分析技术分为两类：非 均相酶免疫测定和均相酶免疫测定。非均相酶免 疫测定抗原抗体反应平衡后，将游离的酶标记物 和与抗原抗体结合的酶标记物分离开，再通过底 物显色进行测定。其代表技术是酶联免疫吸附试 验（ELISA）。而均相酶免疫测定由于免疫反应 后酶活性的改变，不需将游离的和结合的酶标记 物分开。主要用于小分子物质的测定。 （三）常用的标记酶和底物 （1）辣根过氧化物酶（HRP） 其分子量较小，溶解性好，易于提取，来源广 泛；酶和酶标记物性质稳定，耐热、耐有机溶 剂作用，易于保存，价格低廉；易于标记，标 记后活性损失很小。因此HRP是ELISA中应用 最广的标记用酶。 HRP底物种类很多，主要有邻苯二胺（OPD ）和四甲基联苯胺（TMB），前者由于显色不 稳定，对机体有一定致癌性，已逐渐被TMB所 替代。 （2）碱性磷酸酶（ALP）和酶底物 （3）-半乳糖苷酶（-Gal）和酶底物，常 用于均相免疫测定。 （四）固相载体 除均相酶免疫测定外，各种酶免疫测定最后 都需要分离结合的酶标记物和游离的酶标记物 。固相抗体（抗原）是最有效和简便的分离方 法，因此抗体（抗原）固相载体是固相酶免疫 测定必不可少的组成成分。 （1）塑料制品： 抗体或蛋白质抗原可通过非共价或 物理吸附机制结合到塑料制品表面，材料经济、方法 简便，目前，聚苯乙烯微量反应板是ELISA常用的固 相载体。 （2）免疫微球 ： 由聚苯乙烯材料制成的塑料微球或 颗粒，其直径常为微米或毫米，塑料微球与抗原或抗 体偶联后，结合容量大，可以均匀地分散到整个溶液 中，极大地增加了反应面积，因此反应速度快，洗涤 、分离也方便。 （3）微孔滤膜载体： 是一种多孔性薄 膜过滤材料，如醋酸纤维素膜、玻璃纤 维素膜和尼龙膜等。广泛应用于定性或 半定量斑点ELISA、免疫金标渗滤试验 等。 （五）免疫吸附剂 是指于固相载体结合的抗原或抗体。将抗 原或抗体固相化的过程称为包被。目前广 泛使用的聚苯乙烯固相载体多采用吸附方 式包被抗原或抗体。 二、酶联免疫吸附试验 （一）原理和类型 酶联免疫吸附试验（ELISA）就是以酶作为标 记物、以免疫反应为基础的固相吸附测定方法 。ELISA测定试剂主要包括固相包被的抗原或 抗体、酶标记的抗原或抗体和酶反应的底物等 。结合在固相载体表面的抗原或抗体保持其免 疫学活性，抗原或抗体的酶结合物既保留其免 疫学活性，有保留酶的活性。 在测定过程中，抗原抗体结合反应在固相支持 物上进行，用洗涤的方法使固相载体形成的抗 原抗体复合物与其它物质分离，反应结果是以 酶与底物作用后显色来判断的。显色的深浅与 临床标本中待测物的浓度成正比或反比关系。 所以可以根据显色的深浅进行定性或定量分析 。由于酶的催化效率很高，可极大地放大反应 结果，从而使检测方法达到很高的敏感度。用 于临床检验的ELISA主要有以下几种类型： 1、双抗体夹心法 是检测抗原最常用的方法，操 作步骤如下： （1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相 抗体。洗涤除去未结合抗体及杂质。 （2）加待测标本，与固相抗体接触反应一段时 间，标本让中的抗原与固相抗体结合（孵育）， 形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其它未结合 物质。 （3）加酶标抗体。固相免疫复合物上的抗原与 酶标抗体结合（孵育）。形成固相抗体-抗原-酶 标抗体免疫复合物。彻底洗涤未结合的酶标抗 体。此时，固相载体上带有的酶量与标本中待 测抗原的量相关。 （4）加底物显色。复合物上的酶催化底物生成 有色产物根据显色的深浅可进行该抗原的定性 或定量（酶标仪比色或比浊）。 在临床检验中，双抗体夹心法适用于检测各种 蛋白质等大分子抗原，例如乙型肝炎病毒表面 抗原（HbsAg）、甲胎蛋白（AFP）、绒毛膜 促性腺激素（HCG）等。不能用于半抗原等小 分子的测定。 2、间接法测抗体 间接法是检测抗体常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体（ 即酶标二抗）检测已与固相抗原结合受检抗体，故称为间接法。 操作步骤如下： （1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未 结合抗原及杂质 （2）加稀释的受检血清。血清中的特异性抗体与固相抗原结合（ 孵育），形成固相抗原抗体复合物，经洗涤后，固相载体上只留 下抗原抗体复合物。其它免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与 固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。 （3）加酶标记的抗免疫球蛋白（酶标抗抗体） 。它与固相复合物中的抗体结合（孵育），形 成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，从而使 该抗体间接标记上酶。清洗后，固相载体上的 酶量与标本中待测特异性抗体的量相关。 （4）加底物显色。显色的深浅与标本中待测特 异性抗体的量相关（比色或比浊）。 此法主要用于对病原体抗体的检测来进 行传染病的诊断。 主要缺点是待测标本需要经过稀释后才 能进行测定，否则血清中高浓度的非特 异性IgG和其它干扰物质回引起阴性本底 过高，造成假阳性。 3、双抗原夹心法测抗体 反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性 抗原包被固相载体和制备酶结合物，以检 测相应的抗体。此法待测标本不需稀释， 可直接用于测定，故其敏感度高于间接法 。临床检验中，抗-HBs的检测常用此法。 4、竞争法测抗体 其原理为待测标本中的抗体和一定量的酶 标抗体竞争与固相抗原结合。标本中的抗 体含量越多，结合在固相上的酶标抗体越 少，因此，阳性结果显色程度要浅于阴性 结果。如抗-HBc的检测常用此法。 5、捕获法 捕获法（亦称反向间接法）ELISA，主要用于血清中某 种抗体亚型成分（如IgM）的测定。竞争法测抗体一般 仅适用于检测IgG型抗体，IgM型抗体的检测用于传染 病的早期诊断，如果用竞争法，即酶标记的抗人IgM作 为酶标二抗进行间接ELISA测定，这样标本中同时存在 的不同浓度的IgG型抗体将与IgM抗体竞争，使结合在 固相抗原上的IgM抗体相应减少。另外，标本中如含有 类风湿因子，也会产生干扰。 因此一般间接法测定IgM抗体不能得到准确的 结果。而捕获法是用抗人IgM抗体包被固相载 体，以捕获待测血清中的IgM，然后加入抗原 ，此抗原只于特异性的IgM结合，继续加入酶 标记的特异性抗体，最后与底物作用，显色深 浅与标本中特异性的IgM成正比。捕获法常用 于病毒性感染的早期诊断，如甲型肝炎病毒（ HAV）IgM抗体的检测。 6、其他ELISA 如应用生物素-亲和素放大系统的ELISA，利用 酶催化底物发荧光的酶联免疫荧光测定（ELFIA ），以及酶联免疫化学发光测定（ELICLA）等 。新方法不仅进一步提高了测定灵敏度、特异性 ，而且使ELISA技术在提高自动化程度的同时， 也便于单份样本测定，尤其适用于急诊、社区诊 所及家庭化验。 第四节 金标记免疫分析技术 金标记免疫分析技术是一种以胶体金作为示踪物， 用于抗原抗体反应的一种新型标记免疫测定技术， 在20世纪70年代初期始创。由于胶体金能与多种生 物大分子结合，已成为继荧光素、放射性核素和酶 之后在免疫标记技术中常用的一种非放射性核素示 踪物。由于它使用简便、快速，所以已广泛应用于 临床检验工作中。胶体金与免疫活性物质（抗原或 抗体）的结合物，又称胶体金标记物。 一、胶体金的结构 胶体金是氯金酸在还原剂作用下，聚合成一定大小的金颗粒， 并形成带负电的疏水溶液，由于静电作用而形成稳定的胶体状 态，故称胶体金。 二、胶体金的性状 （一）胶体金的稳定性 胶体金颗粒大小多在1100nm，微小金颗粒均匀地、稳定地、 呈单一分散状态悬浮在液体中，成为胶体金溶液，因而具有胶 体的多种特性，特别是对电解质的敏感性。 （二）胶体金呈色性 不同大小的胶体金呈色有一定的差别。最小的胶体金（25nm ）是橙黄色的；中等大小的胶体金（1020nm）是酒红色的； 较大颗粒的胶体金（3080nm）则是紫红色的。根据这一特点 ，用肉眼观察胶体金的颜色可粗略估计金颗粒的大小。 （三） 光吸收性 胶体金在可见光范围内有一单一光吸收峰，这个吸收峰的波长 （max）在510550 nm范围内，随胶体金颗粒大小而变化。 三、胶体金免疫测定技术 （一）斑点金免疫渗滤试验 1、原理 斑点金免疫渗滤试验（DIGFA）是以硝酸纤维素薄膜（ NC膜）为固相载体，将抗体（或抗原）点加固定在上面 ，当待测标本滴加在膜上时，标本中所含的抗原被膜上 抗体捕获，其后加入胶体金标记的抗体，它与已结合在 膜上的抗原发生反应，形成固相抗体-抗原-胶体金标记抗 体复合物，因胶体金本身呈红色，阳性反应即在膜中央 显示红色斑点。 2、双抗体夹心法操作和反应步骤 （1）将标记有抗体滤膜片的扁平塑料小盒打开，平放于实验台 面上，在塑料小孔内滴加含待测抗原在标本12滴，待完全渗 入盒内。 （2）在小孔内滴加胶体金标记抗体试剂12滴，待完全渗入盒 内。 （3） 在小孔内滴加洗涤液23滴，待完全渗入盒内。 （4）在膜中央显示有清晰的淡红色或红色斑点者判为阳性反应 ，反之则为阴性反应。斑点呈色的深浅可提示阳性的程度。全 部试验可有5min内完成。 3、间接法操作和反应步骤 （1）用特异性抗原包被在微孔滤膜上，滴加待测抗体 后，加23滴洗涤液洗涤。 （2）再滴加金标记抗体试剂12滴，待完全渗入盒内 ，加23滴洗