病理制片和染色技术ppt课件

病理技术在医学科研中的应用病理技术在医学科研中的应用 病理学科是一门基础与临床之间起病理学科是一门基础与临床之间起 着桥梁作用的重要学科，病理研究方法着桥梁作用的重要学科，病理研究方法 在技术工作上又是多方面的，有尸体解在技术工作上又是多方面的，有尸体解 剖、大体标本的制作、制片（石腊切片剖、大体标本的制作、制片（石腊切片 、冰冻切片、半薄切片、超薄切片等）、冰冻切片、半薄切片、超薄切片等） 、组织化学方法，免疫酶标技术、荧光、组织化学方法，免疫酶标技术、荧光 技术、摄影技术等。技术、摄影技术等。 作为实验技术人员大量的工作是作为实验技术人员大量的工作是 病理制片技术，即常规病理切片、特病理制片技术，即常规病理切片、特 殊染色，以供教学、科研、临床活检殊染色，以供教学、科研、临床活检 诊断之用。诊断之用。 第一章第一章 病理技术的应用范围病理技术的应用范围 帮助临床查明死因（原因不明的死亡） 手术后病变标本，以明确诊断（临床活 检） 提供教学、科研的资料 第一节第一节 组织制片的概述组织制片的概述 组织制片技术的应用，从组织制片技术的应用，从16651665年由年由 HOOkHOOk发现细胞开始，已有发现细胞开始，已有300300多年的多年的 历史。最早应用冰冻切片；随后又进一历史。最早应用冰冻切片；随后又进一 步利用石蜡的硬度，以石蜡包埋组织，步利用石蜡的硬度，以石蜡包埋组织， 制成石腊切片；后来又利用明胶、火棉制成石腊切片；后来又利用明胶、火棉 胶、碳蜡和塑料等物质的韧性，以其包胶、碳蜡和塑料等物质的韧性，以其包 埋组织而制作切片。埋组织而制作切片。 组织制片技术随着生物学和医学的组织制片技术随着生物学和医学的 发展而发展。切片染色方法可以显示不发展而发展。切片染色方法可以显示不 同细胞和组织形态，以及细胞和组织中同细胞和组织形态，以及细胞和组织中 某些化学成分含量的变化。因此，组织某些化学成分含量的变化。因此，组织 制片技术是教学、医学和科研中不可缺制片技术是教学、医学和科研中不可缺 少的一个组成部分。少的一个组成部分。 第二节第二节 制片的种类制片的种类 1 1、组织切片法、组织切片法 任何组织切片必须依靠切片机将组 织切成薄片（厚度以m计），再进行染 色而得到结果。在切成薄片以前必须设法 使组织内部渗入足够的支持物质，使组织 保持一定的硬度，然后使用切片机进行切 片。渗透到组织中的支持剂（物质）有多 种，如石腊、明胶、火棉胶和塑料等。冰 冻组织切片法是直接利用快速冷冻法进行 切片。 2 2、组织非切片法、组织非切片法 不用切片机，不经过切片手续 而制成组织切片的方法，包括整体 封藏法、浮片法、压碎法和组织直 接印片法。这些方法操作简单而快 ，可根据制片的需要进行选择使用 。 第三节第三节 制片方法的程序制片方法的程序 组织切片法制作过程中的各种操作 1 1、取材与固定、取材与固定 取材是根据实验的目的和要求 及病变程度而合理取得组织材料。 固定是用化学药品把组织原来的结 构保存下来，以便观察研究之用， 固定剂同时具有硬化细胞组织的作 用，使制片便于进行。 2 2、洗涤与脱水、洗涤与脱水 洗涤是把渗入组织中的固 定剂洗去，防止染色中的结晶产 生。脱水是驱除组织中的水分， 以利于透明和浸蜡。 3 3、透明与浸蜡（透蜡）、透明与浸蜡（透蜡） 脱水后的组织中水分已被透明可代 替，而有利于浸蜡。 浸蜡的目的是使组织有一定的硬度 而有利于切片和细胞组织保持一定 的生活时状态。 4 4、包埋与切片、包埋与切片 用石蜡和其他包埋剂将组 织包绕一定的形状以便于切片 。将包埋好的组织块用切片机 切成一定的厚度（以m计）。 5 5、贴片（展片、捞片）和染色、贴片（展片、捞片）和染色 将已切妥的切片在温水中展平整后用 载玻片贴上，稍晾赶后再烤片。 染色可使细胞和组织被染上不同的颜 色而产生一定的折射率，便于显微镜 观察。 6 6、封、封 片片 切片染色后用胶类物质将其 封固，以利于长期保存。 二、二、 组织切片的主要程序组织切片的主要程序 1.标本切开或取厚块组织固 定固定后处理（石腊切片法） 脱水透明浸蜡包埋切片 粘片脱蜡各级乙醇水洗常 规染色或特殊染色脱水透明 树胶封片 2 2标本切开或取厚块标本切开或取厚块组织固定（冰组织固定（冰 冻切片法）冻切片法）冰冻切片冰冻切片粘片粘片乙醇乙醇 固定及固定及水洗水洗常规染色常规染色脱水脱水透明透明 树胶封片。树胶封片。 第二章第二章 固定、固定液和取材固定、固定液和取材 第一节第一节 组织固定方法组织固定方法 在制作组织切片的过程中， 首先将组织充分固定后才能进行 制片，尤其对石蜡切片，这是不 可少的重要步骤。 1 1、固定的意义、固定的意义 就是使要观察的组织构造 尽量接近于它生前的正常状态。 2 2、组织固定的目的、组织固定的目的 1）迅速防止组织，细胞的死后变化，防 止自溶与腐败，以保持组织和细胞与正 常生活时的形态相似。 2）使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等 各种成分转变成不溶性物质，以保持它 原有的结构与生活时相仿。 3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来 ，而产生不同的折射率，造成光学上的 差异，以便染色后易于鉴别和观察。 4 4）固定剂兼有硬化作用，使组织硬化）固定剂兼有硬化作用，使组织硬化 增加组织硬义，便于制片。增加组织硬义，便于制片。 5 5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其 原有形态结构。原有形态结构。 6 6）经过固定的组织，能对染料产生不）经过固定的组织，能对染料产生不 同的亲和力而着色清晰，便于辩认同的亲和力而着色清晰，便于辩认 。 由于固定的目的是在于尽量使组由于固定的目的是在于尽量使组 织和细胞保持与生活时相仿的成分和织和细胞保持与生活时相仿的成分和 形态。因此，固定的组织愈新鲜愈好形态。因此，固定的组织愈新鲜愈好 ，固定组织时，应使用足量的固定液，固定组织时，应使用足量的固定液 ，其固定液的量一般不少于组织块总，其固定液的量一般不少于组织块总 体积的体积的4 4倍以上倍以上。 3 3、固定剂的性质、固定剂的性质 为了能够达到固定的目的，为了能够达到固定的目的， 必须具备以下的性质：必须具备以下的性质： 1 1）迅速渗入组织而固定原生质，使短期解）迅速渗入组织而固定原生质，使短期解 剖的组织形态不至于有较大变化。剖的组织形态不至于有较大变化。 2 2）固定液有相当的渗透力，对组织各部分）固定液有相当的渗透力，对组织各部分 的渗透力相等，可使组织内外完全固定。的渗透力相等，可使组织内外完全固定。 3 3）使组织细胞中不至于因固定引起人为的）使组织细胞中不至于因固定引起人为的 改变。改变。 4 4）在凝固原生质以后，增加细胞对于各种）在凝固原生质以后，增加细胞对于各种 穿透的抵抗力，不至于因以后的处理而使固穿透的抵抗力，不至于因以后的处理而使固 定后的原生质变形。定后的原生质变形。 5 5）尽可能避免使组织膨胀或收缩。）尽可能避免使组织膨胀或收缩。 6 6）能使细胞内的成分（蛋白质）凝固或沉）能使细胞内的成分（蛋白质）凝固或沉 淀下来。淀下来。 7 7）增加细胞内含物的折光程度，易于鉴别）增加细胞内含物的折光程度，易于鉴别 。增加媒染作用和染色能力。增加媒染作用和染色能力。 8 8）使组织变硬，适于制片，但又不使材料）使组织变硬，适于制片，但又不使材料 太坚硬而松脆。太坚硬而松脆。 9 9）使组织充分固定，便于保存。）使组织充分固定，便于保存。 第二节第二节 介绍几种常见固定介绍几种常见固定液液 固定剂有简单固定剂（液）和混合固定固定剂有简单固定剂（液）和混合固定 剂两类。作为较好的固定液，首先有强渗透剂两类。作为较好的固定液，首先有强渗透 力，能迅速地渗入组织内部；其次不会使组力，能迅速地渗入组织内部；其次不会使组 织过渡收缩或膨胀，并能使组织内易观察的织过渡收缩或膨胀，并能使组织内易观察的 成分得以凝固为不溶性物质；最后能使组织成分得以凝固为不溶性物质；最后能使组织 达到一定硬度，获得较佳的折光率和对某些达到一定硬度，获得较佳的折光率和对某些 染料具有较强的亲和力。染料具有较强的亲和力。 一、简单（单纯）固定液一、简单（单纯）固定液 1 1、甲醛（、甲醛（ormeldehydeormeldehyde） 甲醛（福尔马林）为一种无色气体，溶甲醛（福尔马林）为一种无色气体，溶 于水成为甲醛水溶液，甲醛是一种还原剂，于水成为甲醛水溶液，甲醛是一种还原剂， 极易挥发旦有强烈刺激性气味。在平时常用极易挥发旦有强烈刺激性气味。在平时常用 的甲醛浓度为的甲醛浓度为10%10%，这是指以，这是指以10ml10ml甲醛加甲醛加 入入90ml90ml的水配成的，此液实际上只有的水配成的，此液实际上只有4%4%的的 甲醛。甲醛。 甲醛水溶液渗透力强，固定均匀，对组织甲醛水溶液渗透力强，固定均匀，对组织 收缩较少。但经乙醇收缩较少。但经乙醇脱水时脱水时收缩很大，它能使收缩很大，它能使 组织硬化并增加组织的弹性。固定厚度适当的组织硬化并增加组织的弹性。固定厚度适当的 组织，较为适宜。因早醛为非沉淀性固定剂，组织，较为适宜。因早醛为非沉淀性固定剂， 它不能使白蛋的及抗蛋白沉淀；但可与蛋白质它不能使白蛋的及抗蛋白沉淀；但可与蛋白质 化合，对脂肪，神经，及髓鞘的固定很好，也化合，对脂肪，神经，及髓鞘的固定很好，也 可固定高尔基体、线粒体，又是复糖的保存剂可固定高尔基体、线粒体，又是复糖的保存剂 ，使肝糖元变为微细的颗粒团。，使肝糖元变为微细的颗粒团。 使用甲醛固定的陈旧组织，以多血的赃器使用甲醛固定的陈旧组织，以多血的赃器 如脾、肝等，较易发生黑色或棕黑色的沉淀，如脾、肝等，较易发生黑色或棕黑色的沉淀， 称甲醛色素。称甲醛色素。 2 2、乙醇（乙醇（thyl alcoholthyl alcohol） 乙醇为无色液体，可以水在任何比例下混乙醇为无色液体，可以水在任何比例下混 合。它是一种还原剂，很易被氧化为乙醛，合。它是一种还原剂，很易被氧化为乙醛， 在变为醋酸，所以不能与铬酸、重铬酸钾、在变为醋酸，所以不能与铬酸、重铬酸钾、 锇酸等氧化剂混合。锇酸等氧化剂混合。 用于固定时以用于固定时以80%80%95%95%的浓度为好，的浓度为好， 它具有固定硬化脱水等多种作用。高浓度乙它具有固定硬化脱水等多种作用。高浓度乙 醇固定的组织硬化显著，组织在高浓度乙醇醇固定的组织硬化显著，组织在高浓度乙醇 中留置过久，易变脆，也使组织收缩明显，中留置过久，易变脆，也使组织收缩明显， 均可缩小原组织体积的均可缩小原组织体积的20%20%。因。因70%70%乙醇可乙醇可 较久的保存组织较久的保存组织。 另外，乙醇其渗透力较弱，能沉淀另外，乙醇其渗透力较弱，能沉淀 白蛋白、球蛋白和核蛋白。因此，乙醇白蛋白、球蛋白和核蛋白。因此，乙醇 除固定作用外，还具有硬化和脱水作用除固定作用外，还具有硬化和脱水作用 ，所以它在制片过程中用途很大。，所以它在制片过程中用途很大。 3 3、醋酸（、醋酸（cetic acidcetic acid） 醋酸又名乙酸，是带有刺激味的醋酸又名乙酸，是带有刺激味的 无色液体，因在室温无色液体，因在室温1515时常结成冰时常结成冰 状状冰醋酸。冰醋酸。 特性：特性： （1 1）在）在1515时成冰状结晶，有刺激性味，可溶水时成冰状结晶，有刺激性味，可溶水 、乙醇一般配成、乙醇一般配成5 5作为混合固定液。作为混合固定液。（2 2）醋酸）醋酸 只能沉淀核蛋白，对染色质，固定较好，对白蛋只能沉淀核蛋白，对染色质，固定较好，对白蛋 白、球蛋白，固定不佳。对脂肪、糖元不能固定白、球蛋白，固定不佳。对脂肪、糖元不能固定 。 （3 3）醋酸能使组织膨胀，因此，可抵偿因乙醇、）醋酸能使组织膨胀，因此，可抵偿因乙醇、 升汞、甲醛等固定液引起的组织收缩和硬化，故升汞、甲醛等固定液引起的组织收缩和硬化，故 常配成混合固定液。常配成混合固定液。 （4 4）醋酸穿透速度最快，米粒大的组织在单纯醋）醋酸穿透速度最快，米粒大的组织在单纯醋 酸固定液中酸固定液中1 12h2h即可。即可。5 5醋酸的醋酸的p p值在值在2828， 此时可停止细菌和酶的活动，可防止组织自溶变此时可停止细菌和酶的活动，可防止组织自溶变 性。性。 4 4、氯化汞（、氯化汞（ercury bichlorideercury bichloride ） 氯化汞俗称升汞。为白色粉末或氯化汞俗称升汞。为白色粉末或 针状结晶，有剧毒，必须严格保管及注针状结晶，有剧毒，必须严格保管及注 意使用。通常用其饱和水溶液，在室温意使用。通常用其饱和水溶液，在室温 的水中饱和度为的水中饱和度为5%5%7%7%。 特性：特性： （1 1）能沉淀蛋白质，它不能固定脂肪、类脂）能沉淀蛋白质，它不能固定脂肪、类脂 和糖类。和糖类。 （2 2）穿透力较弱，单独使用可使组织收缩。）穿透力较弱，单独使用可使组织收缩。 因此，多与醋酸和铬盐（重铬酸钾）配成混因此，多与醋酸和铬盐（重铬酸钾）配成混 合固定液，组织宜薄而小合固定液，组织宜薄而小2 23 3毫米，固定毫米，固定6 6 18h18h。 （3 3）升汞混合液固定的组织对于细胞的结构）升汞混合液固定的组织对于细胞的结构 ，特别是核的细微结构，显示由为清晰。，特别是核的细微结构，显示由为清晰。 （4 4）经升汞固定的组织易产生汞盐的沉着（）经升汞固定的组织易产生汞盐的沉着（ 为棕黑色结晶）易损害切片刀，因此染色前为棕黑色结晶）易损害切片刀，因此染色前 必须脱汞。必须脱汞。 5 5、苦味酸（、苦味酸（icric acidicric acid） 苦味酸是一种黄色结晶，是一种苦味酸是一种黄色结晶，是一种 相当强的酸。它在水中的溶解度随室相当强的酸。它在水中的溶解度随室 温而变化，约在温而变化，约在0.90.91.2%1.2%，在空气，在空气 中能自燃，在密闭器中能剧裂爆炸。中能自燃，在密闭器中能剧裂爆炸。 为使用安全起见，常制成饱和水溶液为使用安全起见，常制成饱和水溶液 贮藏保存。贮藏保存。 特性特性: : 1 1）能沉淀蛋白质，但对脂肪和类脂无固定作）能沉淀蛋白质，但对脂肪和类脂无固定作 用。用。 2 2）穿透力很慢，细胞收缩显著，但不会使组）穿透力很慢，细胞收缩显著，但不会使组 织硬化。织硬化。 3 3）有软化皮肤的作用，配制的）有软化皮肤的作用，配制的BouinBouin氏液对氏液对 头皮及全身皮肤制片效果甚好。头皮及全身皮肤制片效果甚好。 4 4）苦味酸固定的组织、固定时间太久会影响）苦味酸固定的组织、固定时间太久会影响 HEHE染色（苦味酸对碱性染料不易着色）。染色（苦味酸对碱性染料不易着色）。 5 5）苦味酸酒精饱和液为糖元较好的沉淀剂。）苦味酸酒精饱和液为糖元较好的沉淀剂。 6 6、丙酮、丙酮 丙酮又名醋酮或本酮，极易挥发丙酮又名醋酮或本酮，极易挥发 、易燃的无色液体，能与水、醇、氯仿、易燃的无色液体，能与水、醇、氯仿 、醚及多种溶液混合。、醚及多种溶液混合。 特性：特性： 1 1）它可以作固定剂，又可作脱水剂，穿透）它可以作固定剂，又可作脱水剂，穿透 速度快，可使蛋白质沉淀凝固，速度快，可使蛋白质沉淀凝固，2 2毫米以下毫米以下 的组织固定半小时至的组织固定半小时至1 1小时即可。小时即可。 2 2）可引起组织较强的收缩使之变硬，对核）可引起组织较强的收缩使之变硬，对核 固定不佳。固定不佳。 3 3）对某些酶的固定很好，如碱性磷酸酶、）对某些酶的固定很好，如碱性磷酸酶、 酸性磷酸酶等。酸性磷酸酶等。 4 4）丙酮一般多与氯化汞、甲醛混合液使用）丙酮一般多与氯化汞、甲醛混合液使用 ，先用低浓度丙酮再经高浓度丙酮固定以减，先用低浓度丙酮再经高浓度丙酮固定以减 少组织收缩和过度硬化。少组织收缩和过度硬化。 7 7、重铬酸钾、重铬酸钾 1 1）为橙红色结晶，有毒，是强氧化剂）为橙红色结晶，有毒，是强氧化剂 ，不能与酒精等还原剂混合，常配成，不能与酒精等还原剂混合，常配成 0.5%0.5%水溶液固定组织。水溶液固定组织。 2 2）重铬酸钾单独固定组织不能沉淀蛋）重铬酸钾单独固定组织不能沉淀蛋 白质，但加入冰醋酸转变为铬酸，（白质，但加入冰醋酸转变为铬酸，（ 即酸化重铬酸钾），可使蛋白质凝固即酸化重铬酸钾），可使蛋白质凝固 沉淀。沉淀。 3 3）重络酸钾与甲醛混合（临用时配过久失效）重络酸钾与甲醛混合（临用时配过久失效 ）为未酸化的重铬酸钾固定剂，是固定线粒体）为未酸化的重铬酸钾固定剂，是固定线粒体 、高尔基复合体和嗜铬细胞等优良固定剂，若、高尔基复合体和嗜铬细胞等优良固定剂，若 配成配成EenkerEenker氏液，能很好的固定细胞质、胞氏液，能很好的固定细胞质、胞 核及染色体。核及染色体。 4 4）重铬酸钾穿透速度快，固定组织收缩很小）重铬酸钾穿透速度快，固定组织收缩很小 ，但经酒精脱水时都有明显收缩。经重络酸钾，但经酒精脱水时都有明显收缩。经重络酸钾 固定的组织必须流水充分洗涤（固定的组织必须流水充分洗涤（6 612h12h），）， 否则影响染色。否则影响染色。 5 5）经重铬酸钾固定的组织，对酸性染料，如）经重铬酸钾固定的组织，对酸性染料，如 伊红染色良好，但对碱性料染，如苏木素较差伊红染色良好，但对碱性料染，如苏木素较差 ，若加入升汞及醋酸等，则对细胞核染色极佳，若加入升汞及醋酸等，则对细胞核染色极佳 。 以上叙述了几种单纯固定液的性质以上叙述了几种单纯固定液的性质 和用途，它们各有其优缺点，但单独使和用途，它们各有其优缺点，但单独使 用的不多，而混合固定液的应用更为广用的不多，而混合固定液的应用更为广 泛。单独固定液如重铬酸钾等单独应用泛。单独固定液如重铬酸钾等单独应用 效果不好，若与其他固定剂混合就可以效果不好，若与其他固定剂混合就可以 成为优良的固定液成为优良的固定液。 二、介绍几种常用的混合固定液二、介绍几种常用的混合固定液 1 1、乙醇、乙醇甲醛液（甲醛液（AFAF液）液） 配制：配制：95%95%或无水乙醇或无水乙醇90ml90ml加入加入40%40%并装并装 甲醛甲醛10ml10ml为常用固定液，取材后立即入此为常用固定液，取材后立即入此 固定液。固定液。 此液兼有脱水作用，用于固定肥大细胞此液兼有脱水作用，用于固定肥大细胞 和糖元较好，米粒大小固定和糖元较好，米粒大小固定4 46h6h，大块组，大块组 织织121224h24h，固定后不经水洗，直接放入，固定后不经水洗，直接放入 95%95%酒精开始脱水。酒精开始脱水。 2 2、AAFAAF液液 配制配制 : : 纯酒精纯酒精85ml+85ml+醋酸醋酸5ml+5ml+ 甲醛甲醛10ml10ml 3 3、enkerenker氏液氏液 配制配制: :重铬酸钾重铬酸钾2.5g+2.5g+升汞升汞5g+5g+蒸馏水蒸馏水100ml100ml 加温溶解，冷却过滤，贮于棕色瓶内，成加温溶解，冷却过滤，贮于棕色瓶内，成 为贮存液。为贮存液。 用时取此液临用时取此液临95ml95ml再加入冰醋酸再加入冰醋酸5ml5ml 即成。即成。 enkerenker氏液为组织学、细胞学、病理氏液为组织学、细胞学、病理 学常用的固定液，多用于固定一般组织，学常用的固定液，多用于固定一般组织， 能使细胞核和细胞浆染色较为清晰，固定能使细胞核和细胞浆染色较为清晰，固定 时间时间121224h24h，然后冲洗，然后冲洗24h24h，切片脱腊后，切片脱腊后 需脱汞（浸入需脱汞（浸入5%5%碘酒精碘酒精1010 ），脱碘（），脱碘（5%5% 硫代硫酸钠）硫代硫酸钠）流水洗。流水洗。 4 4、BouinBouin氏液氏液 配制配制 苦味酸饱和液苦味酸饱和液75ml+75ml+甲醛甲醛25ml+25ml+冰醋酸冰醋酸 5ml5ml 此液渗透快，组织收缩小，固定均匀，此液渗透快，组织收缩小，固定均匀， 此液为常用固定液。它对肝、皮肤、胰脏特此液为常用固定液。它对肝、皮肤、胰脏特 染效果好，但此液固定过久对碱性染料的着染效果好，但此液固定过久对碱性染料的着 色有影响。色有影响。 5 5、GarnayGarnay氏液氏液 配制配制 纯酒精纯酒精60ml+60ml+氯仿氯仿30ml+30ml+醋酸醋酸 10ml10ml为细胞极好的固定液，对淋巴组为细胞极好的固定液，对淋巴组 织及腺体固定很好，米粒大的组织固织及腺体固定很好，米粒大的组织固 定定1 12h2h，也适宜，也适宜RNARNA、DNADNA及粮元及粮元 的固定。的固定。 6 6、甲醛、甲醛生理盐水生理盐水 配制配制 甲醛甲醛10ml+10ml+生理盐水生理盐水90ml PH90ml PH值为值为 7 7此固定液是应用最广的一种，它可以此固定液是应用最广的一种，它可以 保护脂类和细胞核。在作酸性染色时，保护脂类和细胞核。在作酸性染色时， 入入- -，或三重染色之前，还可以再，或三重染色之前，还可以再 使用第使用第2 2次固定。次固定。 第三章第三章 洗涤、脱水、透明、浸蜡洗涤、脱水、透明、浸蜡 和包埋、切片和包埋、切片 第一节第一节 组织洗涤组织洗涤 一一、洗涤的目的洗涤的目的 组织在固定后一定要把渗透到里面的固组织在固定后一定要把渗透到里面的固 定液洗去，然后再进行下一步过程。为防止定液洗去，然后再进行下一步过程。为防止 组织中留有较多的固定液而影响脱水剂，甚组织中留有较多的固定液而影响脱水剂，甚 至可在组织中发生沉淀物或结晶而影响观察至可在组织中发生沉淀物或结晶而影响观察 ，特别是对陈旧性标本更应注意流水冲洗，特别是对陈旧性标本更应注意流水冲洗， 尽可能减少组织中的酸性程度和甲醛色素。尽可能减少组织中的酸性程度和甲醛色素。 对混合性固定液，更应及时洗涤，有利于脱对混合性固定液，更应及时洗涤，有利于脱 水直至切片和染色。水直至切片和染色。 二、洗涤的方法二、洗涤的方法 1 1固定剂以水配制者固定剂以水配制者 用流水冲洗，可使组用流水冲洗，可使组 织中的固定液随时溢出和随时洗去。常用的织中的固定液随时溢出和随时洗去。常用的 固定剂是甲醛液（固定剂是甲醛液（10 10 甲醛水液），尸检组甲醛水液），尸检组 织、大动物组织冲洗时间为织、大动物组织冲洗时间为2424左右，、左右，、 小动物组织冲洗时间为小动物组织冲洗时间为2-102-10左右。左右。 2 2 固定剂含乙醇者固定剂含乙醇者 乙醇或乙醇混合液固乙醇或乙醇混合液固 定液者，一般不要求冲洗，如需冲洗必需采定液者，一般不要求冲洗，如需冲洗必需采 用与固定剂中的乙醇浓度相近的乙醇冲洗，用与固定剂中的乙醇浓度相近的乙醇冲洗， 不可用水冲洗，也不应用浓度相差很大的乙不可用水冲洗，也不应用浓度相差很大的乙 醇冲洗，溶液以除去之。醇冲洗，溶液以除去之。 三、特殊固定液洗涤法三、特殊固定液洗涤法 1 1重铬酸钾重铬酸钾 用重铬酸钾固定的组织可用用重铬酸钾固定的组织可用 流水冲洗流水冲洗12-2412-24，或用亚硫酸，或用，或用亚硫酸，或用1 1 含水氯溶液进行洗涤。含水氯溶液进行洗涤。 2 2苦味酸苦味酸 含苦味酸固定的组织，可用含苦味酸固定的组织，可用50 50 或或70 70 乙醇浸洗。乙醇浸洗。 3 3氯化汞氯化汞 用氯化汞固定的组织内常有一用氯化汞固定的组织内常有一 种沉淀物生成，呈棱形或不规则或略圆的种沉淀物生成，呈棱形或不规则或略圆的 块状物，棱形物被认为氯化亚汞，不规则块状物，棱形物被认为氯化亚汞，不规则 物可能是金属汞，此种结晶必需洗去，否物可能是金属汞，此种结晶必需洗去，否 则会使组织发脆，或染色不良。则会使组织发脆，或染色不良。 第二节第二节 组织脱水组织脱水 一、脱水的目的和原则一、脱水的目的和原则 组织经固定和水洗后，会有大量水组织经固定和水洗后，会有大量水 分，而水与苯根本不相融合，所以组织分，而水与苯根本不相融合，所以组织 在透明前必须经过脱水这一环节。就是在透明前必须经过脱水这一环节。就是 说用某些溶剂逐步将组织块吸收的水分说用某些溶剂逐步将组织块吸收的水分 置换出来，以利于透明剂和石蜡或火绵置换出来，以利于透明剂和石蜡或火绵 胶的渗入，这一过程叫脱水。胶的渗入，这一过程叫脱水。 1 1尸检及活检尸检及活检 有条件时，将组织分别进有条件时，将组织分别进 行脱水，如脑、胰腺、肌肉、胸腺或淋巴行脱水，如脑、胰腺、肌肉、胸腺或淋巴 结、肝、脾等组织。因为脱水时间差异性结、肝、脾等组织。因为脱水时间差异性 较大，最好是单独处理。较大，最好是单独处理。 2 2动物组织动物组织 应区分动物大、小，如狗组应区分动物大、小，如狗组 织接近新生儿组织，大白鼠和小白鼠也有织接近新生儿组织，大白鼠和小白鼠也有 差异，前者需时稍长，后者则较短。差异，前者需时稍长，后者则较短。 3 3脱水时间与脱水剂的关系脱水时间与脱水剂的关系 脱水剂脱水剂 的的 新旧（纯度）影响脱水时间，必须新旧（纯度）影响脱水时间，必须 灵活掌握。灵活掌握。 4 4穿刺组织穿刺组织 如肾穿刺、径胃镜取得如肾穿刺、径胃镜取得 组织等，因组织块很小，常规用擦镜组织等，因组织块很小，常规用擦镜 纸包裹，防止丢失。纸包裹，防止丢失。 二二、脱水剂的种类和效果、脱水剂的种类和效果 1 1非石蜡溶剂的脱水剂非石蜡溶剂的脱水剂 如乙醇和丙如乙醇和丙 酮等，其组织在脱水后必须再经酮等，其组织在脱水后必须再经二甲二甲 苯苯透明才能浸蜡。透明才能浸蜡。 2 2脱水兼石蜡溶剂的脱水剂脱水兼石蜡溶剂的脱水剂 如正丁如正丁 醇等组织在脱水后即可直接浸蜡，不醇等组织在脱水后即可直接浸蜡，不 比经过中间溶剂如比经过中间溶剂如二甲苯之类的试剂二甲苯之类的试剂 。 脱水种类可根据须要选择，目前在病脱水种类可根据须要选择，目前在病 理诊断和实验性动物研究中，较多地采用理诊断和实验性动物研究中，较多地采用 乙醇脱水、乙醇脱水、二甲苯透明和二甲苯透明和石蜡浸透组织。石蜡浸透组织。 脱水方法甚多，最重要的是不应骤然脱水方法甚多，最重要的是不应骤然 进行，不能操之过急，否则可引起组织强进行，不能操之过急，否则可引起组织强 烈收缩，或使组织发生变形，而得不到满烈收缩，或使组织发生变形，而得不到满 意切片。意切片。 三、常用脱水剂的使用三、常用脱水剂的使用方法方法 1 1、乙醇（、乙醇（lcohol lcohol 酒精）酒精） 沸点沸点78.478.4，为最常用的脱水剂。脱水，为最常用的脱水剂。脱水 能力强，并能使组织硬化，能较好地与二甲能力强，并能使组织硬化，能较好地与二甲 苯透明剂相溶合。苯透明剂相溶合。 其缺点是易使组织收缩、变脆。导致这其缺点是易使组织收缩、变脆。导致这 些缺点是因为组织在高浓度乙醇（无水乙醇些缺点是因为组织在高浓度乙醇（无水乙醇 ）中停留时间较长，或者加温脱水的温度过）中停留时间较长，或者加温脱水的温度过 高。在日常中一般脱水从高。在日常中一般脱水从70%70%乙醇（人体组乙醇（人体组 织从织从75%75%）开始，由低向高的梯度脱水。）开始，由低向高的梯度脱水。 一般的脱水顺序是：一般的脱水顺序是：75% 75% 、 、 95%95% 、95%95% 、无水乙醇、无水乙醇 、无、无 水乙醇水乙醇。只有脱水充分才能在。只有脱水充分才能在透明透明 剂中透明。剂中透明。 2 2、丙酮（、丙酮（cetonecetone） 沸点为沸点为5656。脱水作用比乙醇强。脱水作用比乙醇强 ，但是对组织切的收缩较大，而价格，但是对组织切的收缩较大，而价格 较高，故一般少用于组织的脱水，主较高，故一般少用于组织的脱水，主 要用于快速脱水或固定兼脱水。脱水要用于快速脱水或固定兼脱水。脱水 时间时间1 13h3h。 3 3、正丁醇（、正丁醇（- -utyl-alcoholutyl-alcohol） 为无色液体，沸点为无色液体，沸点100100118118， 微溶于水，在微溶于水，在100ml100ml水中能溶水中能溶8.3g8.3g，故，故 脱水能力较弱，但能与水、乙醇及石脱水能力较弱，但能与水、乙醇及石 腊混合，故这种脱水的组织块，可直腊混合，故这种脱水的组织块，可直 接浸蜡包埋。接浸蜡包埋。 这种脱水剂兼透明剂的最大优点这种脱水剂兼透明剂的最大优点 是很少引起组织块的收缩及变脆。是很少引起组织块的收缩及变脆。 第三节第三节 组织透明组织透明 一、透明的目的一、透明的目的 在制片过程中有两次透明，第在制片过程中有两次透明，第 一次是脱水以后组织块的透明，第一次是脱水以后组织块的透明，第 二次透明是染色以后切片的透明。二次透明是染色以后切片的透明。 组织块透明的目的是便于透蜡组织块透明的目的是便于透蜡 包埋，切片透明的月的就是有利光包埋，切片透明的月的就是有利光 线的透过，便于显微镜下的观察。线的透过，便于显微镜下的观察。 组织块在浸蜡前，必须通组织块在浸蜡前，必须通 过透明以便使石蜡浸入组织内，过透明以便使石蜡浸入组织内， 起充分支持硬化组织块的作用，起充分支持硬化组织块的作用， 以便完整切片。以便完整切片。 通常根据透明时间与肉眼观通常根据透明时间与肉眼观 察相结合判断透明程度。察相结合判断透明程度。 二、常用透明剂的种类和二、常用透明剂的种类和使用使用 方法方法 最常用透明剂的种类较多，但最常用透明剂的种类较多，但 使用最多的是二甲苯。使用最多的是二甲苯。 1 1、二甲苯、二甲苯 易挥发，无色透明液体，长期接易挥发，无色透明液体，长期接 触对呼吸粘膜有刺激作用。透明能力触对呼吸粘膜有刺激作用。透明能力 强，易使组织收缩、变脆，故组织块强，易使组织收缩、变脆，故组织块 在二甲苯中宜久留，特别对小动物组在二甲苯中宜久留，特别对小动物组 织材料必须严格控制好。织材料必须严格控制好。 2 2、甲苯、甲苯 性质虽同二早苯，但透明较慢，时性质虽同二早苯，但透明较慢，时 间比二甲苯长一倍多，也易变脆。有时间比二甲苯长一倍多，也易变脆。有时 用以代替二甲苯。用以代替二甲苯。 3 3、苯、苯 苯的用途与二甲苯相似，对组织苯的用途与二甲苯相似，对组织 有较小收缩，是较好的透明剂。但也有较小收缩，是较好的透明剂。但也 易挥发，易燃。吸入苯能引起中毒，易挥发，易燃。吸入苯能引起中毒， 可以较小使用。可以较小使用。 4 4、氯仿、氯仿 即三氯甲烷。其透明能力比二甲即三氯甲烷。其透明能力比二甲 苯及苯差，透明时间长达苯及苯差，透明时间长达24h24h。不易使。不易使 组织变脆，能溶于醇、醚、苯等，微组织变脆，能溶于醇、醚、苯等，微 溶于水、极易挥发。多用于大块组织溶于水、极易挥发。多用于大块组织 的透明。的透明。 5 5、香柏油、香柏油 对组织收缩及硬化程度比任何透对组织收缩及硬化程度比任何透 明剂小，但透明时间长，小块组织至明剂小，但透明时间长，小块组织至 少少12h12h以上，缺点它不能溶解石腊，透以上，缺点它不能溶解石腊，透 明以后还需二甲苯补充透明。明以后还需二甲苯补充透明。 6 6、松节油、汽油、松节油、汽油 可作脱水，又可透明，但需用优可作脱水，又可透明，但需用优 质（无杂质）的工业汽油也不行，在质（无杂质）的工业汽油也不行，在 条件困难时可试用。条件困难时可试用。 第四节、组织浸蜡（透蜡）第四节、组织浸蜡（透蜡） 浸蜡的目的和浸蜡的目的和方法方法 组织经过脱水、透明后要用石蜡组织经过脱水、透明后要用石蜡 、火棉胶、碳蜡等支持剂透入内部、火棉胶、碳蜡等支持剂透入内部, ,使使 其变硬并将组织包埋进去以利于切片其变硬并将组织包埋进去以利于切片 和观察，这个过程称为和观察，这个过程称为“ “透入（浸蜡）透入（浸蜡） ” ”或或“ “包埋包埋” ”。 以石蜡切片的透入即（浸蜡）以石蜡切片的透入即（浸蜡） 为例，其目的就是除去组织中为例，其目的就是除去组织中“ “透透 明剂（如二甲苯等）而代之以石腊明剂（如二甲苯等）而代之以石腊 ，并渗入组织内部，把软组织变为，并渗入组织内部，把软组织变为 适当硬度的蜡块，以便切成薄片。适当硬度的蜡块，以便切成薄片。 浸蜡的方法是将组织经过二甲苯浸蜡的方法是将组织经过二甲苯 透明以后，并立即投入到液体石蜡中去透明以后，并立即投入到液体石蜡中去 。在浸蜡时组织必须经过数次纯石蜡（。在浸蜡时组织必须经过数次纯石蜡（ 石蜡石蜡、），这样可以使石蜡中），这样可以使石蜡中 剩余的透明剂完全除尽，以免影响切片剩余的透明剂完全除尽，以免影响切片 质量。质量。 浸蜡剂的浸蜡剂的种类种类 1 1、石蜡石蜡 石蜡有高熔点和低熔点之分，一石蜡有高熔点和低熔点之分，一 般普遍应用熔点为般普遍应用熔点为5656以上的以上的石蜡。低熔点石蜡。低熔点 在在5454以下，用于酶的显示和保存抗原活性以下，用于酶的显示和保存抗原活性 。 石蜡分软蜡（石蜡分软蜡（52525454），硬蜡（），硬蜡（5656 5858），蜂蜡），蜂蜡6060。 一般气温用硬蜡，气温低时用软蜡。一般气温用硬蜡，气温低时用软蜡。 2 2、火棉胶火棉胶 目前使用火棉胶目前使用火棉胶透入组织较少透入组织较少 ，用于用于染色前的覆盖液较多。染色前的覆盖液较多。 3 3、碳碳蜡蜡 4 4、明胶明胶 第五节第五节 组织包埋组织包埋 石蜡是动物植物、人体组织制片技石蜡是动物植物、人体组织制片技 术中极重要且应用最广的包埋剂。包埋术中极重要且应用最广的包埋剂。包埋 蜡须在温箱内经多次熔化沉淀后的干净蜡须在温箱内经多次熔化沉淀后的干净 蜡，包埋较为理想，其包埋蜡蜡，包埋较为理想，其包埋蜡熔点为熔点为 56565858。 石蜡包埋的注意点：石蜡包埋的注意点： （1 1）动作要迅速：特别是冬天，在有多块组）动作要迅速：特别是冬天，在有多块组 织要包埋时，蜡很快会凝固，就包埋不成。织要包埋时，蜡很快会凝固，就包埋不成。 （2 2）切而向下埋：组织包埋要平整或按要求）切而向下埋：组织包埋要平整或按要求 包包埋。埋。 （3 3）包埋的镊子必须加温，镊子温度又不能）包埋的镊子必须加温，镊子温度又不能 太高，否则会烧坏组织。太高，否则会烧坏组织。 （4 4）包埋后待蜡块冷却后再放入冷水中，不）包埋后待蜡块冷却后再放入冷水中，不 能太快，否则变形有气泡。能太快，否则变形有气泡。 （5 5）包埋时组织不能重叠挤压，否则切片不）包埋时组织不能重叠挤压，否则切片不 全会影响诊断。全会影响诊断。 （6 6）包埋用的蜡一般为工业蜡，气候炎热可）包埋用的蜡一般为工业蜡，气候炎热可 用熔点高石蜡（用熔点高石蜡（6060） 第六节第六节 组织脱水组织脱水 透明和浸蜡时间透明和浸蜡时间 各种组织的脱水各种组织的脱水 透明和浸蜡时间透明和浸蜡时间 表表3-1 3-1 尸体解剖组织脱水，透明和浸蜡时间表尸体解剖组织脱水，透明和浸蜡时间表 程序 项 目 时间分配 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 75%乙醇 85%乙醇 95 %乙醇 95 %乙醇 无水乙醇 无水乙醇 无水乙醇 二甲苯 二甲苯 二甲苯 石蜡5658 石蜡5658 石蜡5658 时间长短均可 510 510 510 25 25 25 30 min 30 min-1 30 min-1 1-2 1-2 2-4 表表3-2 3-2 动物（鼠）组织脱水，透明和浸蜡时间表动物（鼠）组织脱水，透明和浸蜡时间表 程序 项 目 时间分配 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 75%乙醇 85%乙醇 95 %乙醇 95 %乙醇 无水乙醇 无水乙醇 无水乙醇 二甲苯 二甲苯 二甲苯 石蜡5658 石蜡5658 石蜡5658 时间长短均可 25 25 25 20 min 30 min 30 min 15 min 10 min 10 min 1 1-2 1-2 表表3-3 3-3 外检组织脱水，透明和浸蜡时间表外检组织脱水，透明和浸蜡时间表 程序 项 目 时间分配 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 85%乙醇 95%乙醇 95 %乙醇 95 %乙醇 无水乙醇 无水乙醇 无水乙醇 二甲苯 二甲苯 二甲苯 石蜡5658 石蜡5658 石蜡5658 时间长短均可 12 12 12 12 12 12 1 12 1-2 1-2 12 24 第七节第七节 组织切片组织切片 一、石蜡切片法一、石蜡切片法 1 1、切片前的准备工作、切片前的准备工作 石蜡切片是以石蜡作为组织的支持媒介石蜡切片是以石蜡作为组织的支持媒介 作用。应先将作用。应先将包埋的每块组织周围过多包埋的每块组织周围过多 的的石蜡切去，石蜡切去，组织四周留组织四周留2 2mmmm的石蜡的石蜡 边。边。 在常规实验室中须备以下用品在常规实验室中须备以下用品 经过清洁液浸泡过的载玻片。经过清洁液浸泡过的载玻片。 展片盆、染色架、蛋白甘油。展片盆、染色架、蛋白甘油。 大、中号毛笔、眼科镊（弯）大、中号毛笔、眼科镊（弯） 2 2、切片制作过程、切片制作过程 将预先冷却的组织装在切片机固定器上将预先冷却的组织装在切片机固定器上 。 切片组织经过粗切，待组织充分切完整切片组织经过粗切，待组织充分切完整 ，右手旋动切片机把，切片带出来之后，右手旋动切片机把，切片带出来之后， 用毛笔轻轻托起，再用眼科镊轻摄蜡片，用毛笔轻轻托起，再用眼科镊轻摄蜡片， 以正面放入展片盆中，待摊平整后捞片。以正面放入展片盆中，待摊平整后捞片。 捞片在载玻片上的二分之一以处。捞片在载玻片上的二分之一以处。 切片附贴后，放在空气中稍凉干，即可切片附贴后，放在空气中稍凉干，即可 进行烤片。进行烤片。 3 3、切片的、切片的注意事项注意事项 凡是陈旧、腐败或干枯的组织不易凡是陈旧、腐败或干枯的组织不易 制好切片。制好切片。 固定失时或固定不当的组织，染色固定失时或固定不当的组织，染色 时常出现核质着色较浅、轮廓不清，出时常出现核质着色较浅、轮廓不清，出 现不等的片状发白区。现不等的片状发白区。 组织脱水，透明和浸蜡过渡，会造组织脱水，透明和浸蜡过渡，会造 成过硬、变脆，特别是动物组织应严格成过硬、变脆，特别是动物组织应严格 控制。控制。 切片出现横皱纹常多见于组织固定不牢 ，或切片刀固定不紧。 切片刀不锋利，切片时会自行卷起或皱 起，更不能顺利地将切片联结成蜡带。切 片刀如有缺口存在，更易造成切片断裂、 破碎、不完整等现象。 组织切片机各个零件和螺丝应旋紧，否 则将会产生震动，以致切片厚薄不均。 二、冰冻切片法二、冰冻切片法 冰冻切片在组织学技术中应用范冰冻切片在组织学技术中应用范 围较广，对病理学中的临床手术的快围较广，对病理学中的临床手术的快 速诊断其意义更大。速诊断其意义更大。 冰冻切片多用于新鲜组织，甲醛固定冰冻切片多用于新鲜组织，甲醛固定 组织和冰箱冷藏组织等。组织块不经组织和冰箱冷藏组织等。组织块不经 任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却 后再进行切片。后再进行切片。 三、快速石蜡切片三、快速石蜡切片 切片脱蜡目的要求：切片脱蜡目的要求： 彻底脱去切片组织中的石腊，才彻底脱去切片组织中的石腊，才 能使组织细胞着色，否则成云雾状，会能使组织细胞着色，否则成云雾状，会 防碍染色细胞结构模糊不清，无法诊断防碍染色细胞结构模糊不清，无法诊断 ，脱蜡均用二甲苯冬天需加温脱蜡，脱蜡均用二甲苯冬天需加温脱蜡1010 左右，然后浸入左右，然后浸入95%95%至至70%AC70%AC去二去二 甲苯丙水洗，使切片清亮。甲苯丙水洗，使切片清亮。 总结组织制片过程总结组织制片过程 收集标本（活检、尸检、动物实验收集标本（活检、尸检、动物实验取取 材固定切块（材固定切块（110.3110.3自来水冲洗（自来水冲洗（1 1 2h2h）组织脱水（组织脱水（75%A75%A乙醇乙醇、85%85%乙醇乙醇、95%95% 乙醇乙醇、95%95%乙醇乙醇、100%100%乙醇乙醇、100%100%乙醇乙醇 ，低溶度，低溶度乙醇乙醇2 24h4h，高浓度，高浓度乙醇乙醇1h1h）组组 织透明（二甲苯织透明（二甲苯3030 ）浸蜡（软、硬蜡、大浸蜡（软、硬蜡、大 组织组织4 416h16h），组织），组织2 24h4h，包埋包埋冷却修冷却修 蜡块蜡块焊蜡块焊蜡块切片切片贴片贴片烤片烤片切片脱切片脱 蜡蜡切片染色（常规切片染色（常规HFHF和特染）。和特染）。 第四章第四章 染染 色色 一、染色的目的一、染色的目的 任何冰冻切片、石蜡切片等如果任何冰冻切片、石蜡切片等如果 不经过染色，在显微镜下只能看到细不经过染色，在显微镜下只能看到细 胞及其它组织成分的轮廓，即使由于胞及其它组织成分的轮廓，即使由于 组织内部各种物质的折射指数不同，组织内部各种物质的折射指数不同， 从光线的明暗上能观察到一些组织结从光线的明暗上能观察到一些组织结 构，但也是极其简单有限的。远不能构，但也是极其简单有限的。远不能 满足观察和借以诊断的目的。满足观察和借以诊断的目的。 染色的目的，是将染料配制成溶液，将染色的目的，是将染料配制成溶液，将 组织切片浸入染色剂内，经过一定的时间，组织切片浸入染色剂内，经过一定的时间， 使组织或细胞及其他异常的成分被染上不同使组织或细胞及其他异常的成分被染上不同 深浅的颜色，产生不同的折射率，便于在光深浅的颜色，产生不同的折射率，便于在光 学显微镜下进行观察。因此，染色在组织形学显微镜下进行观察。因此，染色在组织形 态学，特别是病理形态诊断、科研和教学工态学，特别是病理形态诊断、科研和教学工 作中，都具有非常重要的意义和实用价值。作中，都具有非常重要的意义和实用价值。 二、二、 染色的原理染色的原理 染色就是染色剂和组织细胞相结染色就是染色剂和组织细胞相结 合的过程。有关两者结合的原理，不合的过程。有关两者结合的原理，不 同学说，尚未完全清楚，而只一般基同学说，尚未完全清楚，而只一般基 本认为过程是化学反应和物理现象。本认为过程是化学反应和物理现象。 染色的化学反应染色的化学反应 在组织细胞内，一般有酸性和碱性区别在组织细胞内，一般有酸性和碱性区别 ，酸性物质部分能与溶液中的阳离子结合，酸