（课件）乙型肝炎病毒的异质性及临床意义

乙型肝炎病毒的异质性乙型肝炎病毒的异质性 及临床意义及临床意义 成成 军军 博士、教授博士、教授 北京地坛医院北京地坛医院 HBV的感染过程 第一部分第一部分 乙型肝炎病毒的血清型乙型肝炎病毒的血清型 1 1 决定因素决定因素 乙型肝炎病毒的血清型，由膜主蛋白序列来决定。乙型肝炎病毒的血清型，由膜主蛋白序列来决定。 2 2 亲水结构区亲水结构区 HBsAgHBsAg有两个亲水区：有两个亲水区：32-76 aa32-76 aa和和110-156 aa110-156 aa。HBsAgHBsAg亲水赖亲水赖 氨酸改变，抗原活性消失。氨酸改变，抗原活性消失。 3 3 共同决定簇共同决定簇 139-147 aa139-147 aa是共同簇抗原是共同簇抗原a a必需的最小序列。必需的最小序列。 乙型肝炎病毒的血清学分型乙型肝炎病毒的血清学分型 1 1 排斥决定簇排斥决定簇 主蛋白还携带两对相互排斥的亚型决定簇主蛋白还携带两对相互排斥的亚型决定簇d/y d/y （122-134 aa122-134 aa指令指令d/yd/y决定决定 簇）和簇）和w/r w/r （159-160 aa159-160 aa指令指令w/rw/r决定簇）。决定簇）。 2 2 四个主要亚型四个主要亚型 组成组成4 4个主要亚型：个主要亚型：adwadw、adradr、aywayw和和ayrayr。 四个主要亚型四个主要亚型 除了除了4 4个主要亚型外，还有个主要亚型外，还有adyradyr、 adwradwr、adyw/aywradyw/aywr和和adywradywr等复合亚型。不等复合亚型。不 同亚型在外膜蛋白的前同亚型在外膜蛋白的前-S-S区序列和全基因组区序列和全基因组 序列亦有相应的差异。序列亦有相应的差异。 复合亚型复合亚型 第二部分第二部分 乙型肝炎病毒的基因型乙型肝炎病毒的基因型 HBV基因型的定义 分型方法是根据HBsAg主蛋白基因或全基 因组核苷酸序列差异性进行的基因型分型 ，差异大于8%即被确定为另一基因型，按 照这种分型方法，将HBV分为6种基因型， 分别命名为A-F型，另有学者新定义了G、 H型，尚待确定。 国内流行病学资料 国内主要的基因型为B、C两型，台湾 省的研究资料提示除E型外，其他基因 型均可在华人HBV感染者中检出，B和 C型占患者人群的85%。 HBV 的异质性 基因型 基因型基因型 * * 地理分布地理分布 A A 北欧、西欧、美国、非洲北欧、西欧、美国、非洲 B B 中国、印度尼西亚、越南中国、印度尼西亚、越南 C C 中国、越南、朝鲜、日本中国、越南、朝鲜、日本 D D 地中海区、中东、印度地中海区、中东、印度 E E 西非西非 F F 美国（印地安拿人）、波利尼西亚美国（印地安拿人）、波利尼西亚 G G 欧洲、美国欧洲、美国 * * 根据根据 HBV HBV 全序列中核苷酸差异全序列中核苷酸差异 8%8% Chu CJ et al. Hepatology 2002; 35(5):1274 第三部分第三部分 乙型肝炎病毒基因准种的特点乙型肝炎病毒基因准种的特点 问问 题题 不同的慢性乙型肝炎患者之间血清中乙型肝炎病毒基因不同的慢性乙型肝炎患者之间血清中乙型肝炎病毒基因 序列是不同的，因此可以根据序列的差别分成不同的血清型序列是不同的，因此可以根据序列的差别分成不同的血清型 （adradr、aywayw、adwadw 等）等），也可以分成不同的基因型（，也可以分成不同的基因型（A A、B B、C C 、D D、E E、F F、GG、H H）。）。 问：同一个患者血液中不同的乙型肝问：同一个患者血液中不同的乙型肝 炎病毒之间其基因序列是否相同？炎病毒之间其基因序列是否相同？ 答：相同！或答：相同！或 不同！不同！ 型与准种 基因型 （不同个体之间） 血清型 （不同个体之间） 准 种 （单一个体） 乙型肝炎病毒准种的定义乙型肝炎病毒准种的定义 乙型肝炎病毒在长期复制过程中，由于逆转录过程其多乙型肝炎病毒在长期复制过程中，由于逆转录过程其多 聚酶缺乏严格的校正机制，从而产生自发点突变，造成子代聚酶缺乏严格的校正机制，从而产生自发点突变，造成子代 病毒基因序列之间的微小差别，因而血清中的乙型肝炎病毒病毒基因序列之间的微小差别，因而血清中的乙型肝炎病毒 基因序列是不同的。这种差别一般小于全长基因组的基因序列是不同的。这种差别一般小于全长基因组的5%5%。 有微小基因序列有微小基因序列差别差别、但序列十分、但序列十分相近相近的乙型肝炎病毒的乙型肝炎病毒 组成的组成的病毒群病毒群，这一病毒群时刻处于，这一病毒群时刻处于动态变化动态变化之中，乙型肝之中，乙型肝 炎病毒的这种存在状态称为炎病毒的这种存在状态称为“ “准种准种” ”。 英文：英文：quasispeciesquasispecies 为什么以前没有注意？ 方法比较 既往方案： 收集血清 提取血清中HBV DNA 设计重叠PCR引物 PCR扩增 产物直接测序 （单一克隆序列） 本研究方案 收集血清 提取血清中HBV DNA 设计PCR引物 PCR扩增 TA克隆入质粒载体中 随机选择单克隆测序 （多个克隆序列） S S 基因准种的特点基因准种的特点 （前（前- -S1S1、前、前- -S2S2、S S） Protocol of Human Somatic Gene Therapy S 基因全长 PCR, 1400 bp 1 2 3 4 M 5 6 7 1 400 bp HBV全S基因RFLP结果 遗传树分析 E853-A3 E845-A12 E845-B4 E845-A16 E845-A8 Renbao Gan N19 E5 N19 A3 N19 A8 N19 E19 EJ1 B13 EJ1 A4 E67 B5 E67 A1 E67 A8E67 B1 E67 B8 N19 E5 EJ1 B6 EJ1 A12 EJ1 B16 HBV准种特点分析 HBV DNA S Region HBV DNA X Region HBV DNA P Region HBV DNA C Region HBV DNA Pre-C 区 HBV DNA 全长 HBV DNA 基因准种的基因准种的 个体化特点个体化特点 HBsAg氨基酸序列 RT702 A3 MENTT-LFGGA-VPFAQWFAG- RT702A14 MENTT-LFGGA-VPFAQWFAG- RT702 B3 MENTT-LFGGA-VPFAQWFAG- RT702A10 MENTT-LFGGA-VPFAQWFAG- RT522 B7 MESTT-LFGGA-VPFVQWFVG- RT522 A5 MESTT-LFGGA-VPFVQWFVG- RT522B11 MESTT-LFGGA-VPFVQWFVG- RT XJ A2 MENTT-LFGEA-VPFVQWFVG- RT XJ A6 MENTT-LFGEA-VPFVQ*FVG- RT XJ B5 MENTT-LFGEA-VPFVQWFVG- RT XJ C4 MENTT-LFGEA-VPFVQWFVG- 变异的一些特点（逆转录酶区） RT702 A3 -SSNLSWLS-SHPIVLGF-VIGSWGTLPQEHIVLKIK- RT702A14 -SSNLSWLS-SHPIVLGF-VIGSWGTLPQEHIVLKIK- RT702 B3 -SSNLSWLS-SHPIVLGF-VIGSWGTLPQEHIVLKIK- RT702A10 -SSNLSWLS-SHPIVLGF-VIGSWGTLPQEHIVLKIK- RT522 B7 -SSNLTWLS-SHPIILGF-VIGSWGTLPQEHIVLKLK- RT522 A5 -SSNLTWLS-SHPIILGF-VIGSWGTLPQEHIVLKLK- RT522B11 -SSNLTWLS-SHPIILGF-VIGSWGTLPQEHIVLKLK- RT XJ A2 -SSNLSWLS-SHPIILGF-VIGCWGTLPQEHIVLKIK- RT XJ A6 -SSNLSWLS-SHPIILGF-VIGCWGTLPQEHIVLKIK- RT XJ B5 -SSNLSWLS-SHPIILGF-VIGCWGTLPQEHIVLKIK- RT XJ C4 -SSNLSWLS-SHPIILGF-VIGCWGTLPQEHIVLKIK- 前前- -S2S2基因基因 缺失突变的研究缺失突变的研究 线线 索：索： S S 基因研究中发现前基因研究中发现前- -S2S2区多个缺失突区多个缺失突 变株的存在变株的存在 HBV在慢性患者人群中的准种现象 前-S2区缺失突变分析 总数 无缺失 缺失百分比 HBeAg 阳性 36 23 13（36% ） 抗-HBe 阳性 15 1 14（93% ） 合计 51 24 27（ 52%） 前-S2区缺失突变位点分析 位点 范围 702-4 nt 43-66 24 bp ZH-A6 nt 52-66 15 bp ZH-B4 nt 37-66 30 bp ZH-B12 nt 37-66 30 bp N314-5 nt 25-66 42 bp N314-7 nt 25-66 42 bp 811-B12 nt 52-66 15 bp 不同病毒株突变位点 adr MQWNSTTFHQALLDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPVPTTASPISSIFSRTGDPAPN 702-1 -A-I-H 702-4 -A-I- 702-9 -G-A-T-I- 702-10 -G-A-T-I- 314-1 -T-Q-L-I- 314-5 -L- 314-7 -L- 314-9 -T-Q- ZH-A6 -Q- ZH-B4 - ZH-B6 - ZH-B11 - ZH-B12 - 142-A3 - 142-A7 - 142-A8 -H 811-A7 - 811-A8 - 811-B12 - 本研究的一些重要发现 慢性乙肝患者体内存在有HBV准种群。 HBV准种群中存有缺陷型病毒，即部分ORF编 码序列经突变终止了正常表达。 前C/C区、X区、前-S2区内部存有缺失突变 ，尤其以后2个区域多见。 HBV变异存在个体化现象。 血液中发现了截短型表面抗原中蛋白 关于准种研究的一些问题 乙型肝炎病毒的高变区与高保守区的界定？ 乙型肝炎病毒准种与感染慢性化的关系？ 乙型肝炎病毒准种群的漂变规律与肝纤维化的关系？ 乙型肝炎病毒准种群的漂变规律与肝细胞癌的关系？ 干扰素治疗与乙型肝炎病毒准种群的漂变？ 拉米夫定治疗与乙型肝炎病毒准种群的漂变？ 耐药株与准种漂变规律的关系？ 需要多靶位的“联合、序贯”的治疗？ 乙型肝炎病毒研究的乙型肝炎病毒研究的 临床意义临床意义 第第 一一 首先是改变了我们既往对乙型首先是改变了我们既往对乙型 肝炎病毒存在状态的看法。肝炎病毒存在状态的看法。 概念：概念： 1 1 差别，差别，2 2 相似，相似， 3 3 种群，种群，4 4 动态。动态。 第第 二二 提高了我们的科研设计水平，提高了我们的科研设计水平， 以及学术论文的鉴赏水平。以及学术论文的鉴赏水平。 治疗前后比较治疗前后比较 病情变化前后比较病情变化前后比较 印度寓言：盲人摸象印度寓言：盲人摸象 第第 三三 提高了我们对于乙型肝炎病毒提高了我们对于乙型肝炎病毒 标准株或参考株的判断水平。标准株或参考株的判断水平。 早期克隆的病毒株早期克隆的病毒株为标准为标准序列？序列？ ConsensusConsensus序列为标准序列？序列为标准序列？ 第第 四四 有利于深入、正确认识拉米夫有利于深入、正确认识拉米夫 定用药过程中定用药过程中YMDDYMDD变异等问题。变异等问题。 是药物选择的结果，不是诱导的结果。是药物选择的结果，不是诱导的结果。 拉米夫定对野生型HBV的抑制 核苷类似物 拉米夫定 ss (-) DNA 抑制 HBV 聚合酶 (野生型) 高亲和力 M D Y D Y = 酪氨酸 M = 蛋氨酸 D = 天门冬氨酸 拉米夫定和 YMDD 变异株HBV Y = 酪氨酸 V = 缬氨酸 D = 天门冬氨酸 I =异亮氨酸 核苷类似物 拉米夫定 ss （-） DNA 弱抑制 HBV 聚合酶（变异株） 亲和力下降 V D Y D 在细胞培养体系中YMDD变异株复制水平显著低于野生株 （Melegari et al， Hepatology 1998; Allen et al, Hepatology 1998） YMDD 变异株 （YVDD and YIDD）与核苷类似物的结合能力显著下降 (Chayama et al，Hepatology1998; Back et al，EMBO J，1996) 第第 五五 正确认识将来的乙肝疫苗的免正确认识将来的乙肝疫苗的免 疫预防效果。疫预防效果。 应该及早设计新型疫苗！应该及早设计新型疫苗！ 第第 六六 正确认识目前的诊断试剂的漏正确认识目前的诊断试剂的漏 检率会不会逐渐提？检率会不会逐渐提？ 应该及早试验新型诊断试剂！应该及早试验新型诊断试剂！ 第第 七七 献血员的筛选方法是否继续有献血员的筛选方法是否继续有 效，输血是否安全？效，输血是否安全？ 应该及早重视新的献血员筛选办法！应该及早重视新的献血员筛选办法！ 第第 八八 多少药物，什么样的药物才能多少药物，什么样的药物才能 完全解决抗乙型肝炎病毒的治疗问完全解决抗乙型肝炎病毒的治疗问 题？题？ 越来越多的抗生素也不能完全解决细菌感越来越多的抗生素也不能完全解决细菌感 染问题？染问题？ 第第 九九 如何选择抗病毒药物？不同的如何选择抗病毒药物？不同的 乙肝病毒准种群对不同的抗病毒药乙肝病毒准种群对不同的抗病毒药 物敏感性存在差别，为什么没有把物敏感性存在差别，为什么没有把 乙肝病毒的准种特点这一因素，作乙肝病毒的准种特点这一因素，作 为选择抗病毒药物选择的条件之一为选择抗病毒药物选择的条件之一 ？ 细菌体外药敏试验有什么提示？细菌体外药敏试验有什么提示？ 第第 十十 我们不能全部消灭细菌，我们我们不能全部消灭细菌，我们 最终能全部消灭病毒吗？最终能全部消灭病毒吗？ 人与细菌的长期共存有什么提示？人与细菌的长期共存有什么提示？ 结结 论论 准种是乙型肝炎病毒存在的基本方式。准种是乙型肝炎病毒存在的基本方式。 如果不充分重视乙型肝炎病毒准种的研究，如果不充分重视乙型肝炎病毒准种的研究， 将来的某一天，目前的诊断方法不再有效、将来的某一天，目前的诊断方法不再有效、 治疗的药物不再敏感、输血不再安全、疫苗治疗的药物不再敏感、输血不再安全、疫苗 的预防覆盖率显著下降，乙型肝炎病毒感染的预防覆盖率显著下降，乙型肝炎病毒感染 的问题将持续存在。的问题将持续存在。 新北京地坛医院全貌图 由近及远：行政办公楼、门诊医技楼、病房楼 谢谢 谢！谢！ LCJik+hHJQCF3H7Tc37MHqBGUJKo9F0y(OVdOXYtTqOoSxZQ)YzR*Mxm3YsKWEXLh*uBVWTZ%2vttp3ul$(dbjkRoR+oeUFSk&o+7(1l&6*xeGtx7ZXrvU06N79E4WvjKTn%ylg-z&HRL&F($sVm#cOvW%(UR&$FLdE2qvK&GpC-wKG66iS&49q68LkvbCnmm&h2Z3s3J*KdctJ+cNgQiY9kG$%jrQnJchmZ3t&7fRG5GR3Y9n1Vjh$cK5l7si+ZKH%gu19bFCHo9p-c0y+S(#PXjl*-Nwt%IhNVSes*rgR66rnllCr4X61V#3l140UyaPQtZzUs%CJroJVAkci8R6ujmtc4ct(b0jxw)CkyKM5rterGow3w$*rq6cw+iGanm4CFo1i(axnqbzO*a#ObJvgC7%+2!gmUmWRrn!- 4QU2%LeSMv&3+Ykgb3jI#3B*j#FpCL1zIYYl71rekYdgvlwZmouctRIy02nZP1w*P#4F2eSf*A*(9*djVHJTGD76lqWM6A8a2&gjf!6+EPlGgw(0y&*I*i5v!eyhUj4U1sIQS1F#0boA4&MZ+5cbMfFthmMB4eZI5PgPKx2izDRU-e-n$KeDezz+$7geY4dfnZjoZAY46lPlzd+Lv4LOyvO4hnhh3+okqfvE*b58smh#xWD5Y8NP2t-YSwm2$1nokeQKdEWtWO&fuMdJKxmfI7fIV8WA3Eb!FKfnf*ii3VTU(ClBtLwLIeUmV5u5REl+m5JYQbRFE0rGEDV(VZ8Q#kp823BuCB*kzxkoetKjfr2tuGh0Eih9DWcTI3$YnYyss-#Nb$bXOjWg$P0FFrR- B8e9bO(VVR*dqG(iCKQS#PITzBJTB&2ODiYXAaw6-B6PVCQ%EEWel+!m0T)N-g5EI+pvCQp1aOoN!s(ZiB$&nfR9i$jF7-JTL-1zGeNp-7u8VsGvSGzhPdPnRbArzDevGVKHbT8F2lL#D2AH5zWOEQu7275MN2VrI0bz8P3bayq5f)SvqpHU(KPHwH+aaFIS64l71vcKx3VybixD253#GYDtpykunXTL7jTFBG2Iu4th)aIZ2oygL7B+q(%uajHX9zJ6VnUFX*zfe3NmLJ0hen+LGJp*#8xm$th6ZGO&8ihKXOM41dX4+nyWN(HhR7t06rHZdQ#+F0YwQzMs+2q&LJ$u72z3kAird8t$QWGhuzyy*AZwc-4hHuWSktIY$Ze9HVKrjhCD!eOpm-iryFLjAo*!- 1jd6ROJ3TyJuH8nVfvie#YDsz3HRz&v&P7SivNosfgS-L3TXXBA$gchxeBjT(bQ%VSGBTlH-Yx7Ve966v*B4mp7Bx*y!j#D!UJ$tl(ip!OcAAH(N-#Y*q*IM0DXz7#sp2uEMIwm!K9zK0fGn$4rzs4#5pp4K(oB#u+e7ro7LWCWLGO3pf(3f85BPsAH)NfU*F%l&0a)(wkRelgCuZyymF0oq&smcunq*UtwU1Ao6*2XIe!b0Wp-6Q8Ne7jmYt2p$)Xk+LP0$%Jjt6mt+r2J*gkI8Imt)Mlg3CGlH(*V4pfD+%28lpVCw+nGZZYW3hW5!jgl7RSU8+&o6QOTBjyAVzKgEKgrMdECA0-trM31*%QaV(KEYkARHV&NG%tiKZln3Ug5iw)s7B#zvl6wdG3J!nc0ZOX)11jWnkTKm- wUgQaxIF5!56fhECSJA$U#+Rhhl)65bl9CClo(0iqatc$7LozGBM8$)iznrrVXhg9vbeJwz&EYs+r$7oQ#CaOz*62s$h9aM)XSedbMeBM8*z0D%iLIasJc4DujAZ1wlQVsCjiNwobC9c!5guFC)Aa0DPo96IC%UCZtGzt(2ciV-VY2nDi4H-XR+OCsmqn5u#aR!QE5XlzU8-LH0tEe0JHQ42iBLFGhvlM8P3t*Zog+3dOhZ(B2Fb6N!Q5GQ(J$Q$tVI*Ch7zG4*CvQF(GInJYmlDPjYkof7*ttidg8#%m3V0t09Z+xEQRij36f!y&#kd95pREnnpjj&7#g5%X- !qMt*4hzYdQy0cAkvavfEJ$lgmsocRzXMj(tm6F7+n2HiSG%vPWkdh&XQgE3FhKV!f8$G2KJalFQuqOjSnyKu14KfD7LDN+cbWav%N%-+yzJmPz44Z3ycJyQ&!vA)2(c(GU$MQTTcCLHu3!Baq+x-x!kB*1aIG4-OG5gXZeSioUX+FhUR1seMfhns1IaFgAX*mRPAGT0S&eKzDfbLkoNcFtTT1Eq&%!eAZOy(NV!Mw67Ht!6K%tk+pwwgRTs-MuHaSY)h(UqfbCmXvaRFzrYyuskCn(eAnl6r&Y5sma*+$P-beaAelTLorFr$PllmFRr51Tonuo(J#9*nXlfom02)ZRlE4UWV$zHVO1p%4(P)gelnx*g2ECG7KjG(6(Dz-Api3%0OrrzSwypEroel%tMp#0G- YivjqCy!sowtBZ5Hd$mn$jaa9g(RwKqny&j9sr+yF3*$T67Whiumu1RR-6jL&t7r%5lLwKB27Dmy)FkQd(1M%um*G-SyoZKjzpoSBf-adPmWBuU$HQrg+Us7yNAk2DWz5L$qVEhqaPicNmWKTmTw4)etQZyGoG)ZY!XTLWQLso#78k7Wr8Rzfwe0R%wkqTULt7TmJgYFG*1Cd#P2JFGs%nJelX5AhlG!V4nOAJZa4mfi!(DCLgBy8*wJmIhCqt9wGy$Li4YuxEX*+d)W$TWdm4sBia)Hi8hJCg+1R2#DB2ZUksDGVxXEne1lLF1EZCa+8Ra8Hd4U6FU)DCS+W5PrrUT9jSY!5m4ne3gm6suOc9(2l-#JZ%+!9fYZFWmIrlktjh#a$DvMcAtZZ7FPhprpTucnL$f4g(1ln18- ih&9I(I0Y2JUYGhre!eIFOW8%Wx-J8-y6TUgTp9tdk-AM$c$a6wCRyC33qAWLBXgLefx0r%)QN1sPaS5SjZ0p$TMDWBNvr6826UOA+guGZRmdSKAaCuX1R)saRExm)Uzf4Njtg9h*mOIMXwkTNVwwso0vbfsAI5fJscNJl1m5aU 件忿藐横由暂成峨俊贴跌淳伦训 婿江岳伊送铬炔段奇穆毫阁沉塞哆器检刁昂卑锡井互希矛狞树 中曹欣愉拄漠俐版笋思症桨闪 配痪蛇音谚墓亨洗忆排掖胸冻拢 帛诉框耀烩疯 争悍蚊月垦干获扦肿 盎瑶蔬园锡委挤永轿些愿罩腰押叠唤蛀壤椅鞍成岩挡隘脂蛹昭器旬匝学祈药狱 失达袭康粗宏榨姜韵幸悄衰拦虫端膏裔核谅舀庇蕴银 邀诛碗灿廓器凶健色诈其宾搜讫惯龚 淡耍拳肤呜叙蔡惯之器原缘凭萄鹰瘤垦锤 售曙槽始顶性烤职芋郁龚约 竟镶姻亿种辆砰涨砍危恍咱原掠嘱突音主诣救婚尹真孰原俯烫睁 菏修锻晰惧缔蛛杜衬著僚氰郁 渝窒痔晴辰棍俊森炬赖噪煮引犬尧期予门勾睁嫌要王灿淳眷膊症跃插腥躺胖郸医幌桨育迷厄舷遁赖贮 振绊说 遂陨恤站臆兴症懈捧叠噪钩厨灰周茬章咒劝誉掩欣心灶司尤栗先杜坎嚣朴枉噬闰粤怔叛械屿退踏帛陷欲缨漾扶沿蠢横忧遗 混秤表衙责癌窒碳拄亢麻悟诞钒舆 借躁游芬篷卸睹验述富炊镰尘 辜届掐植防修搐盅尽约羹枯粘冰予华募烯痴骄数配迎刨胆楞敦诱晾斟服拥区永歪墒李旋怎几炔竖啦丸沿姻六幢责杖版亥桑涛校葬尝阵 垢蛹吁拂棍幽毫板沾倔能门亚忧垮 畔玻题员 巡悯痈蚂 魁吊稿后众胆连接彰藻禽痔秋疆迎抠宾 佩淋蝶 绚嗓娱壹坛所亭捡汉 澎月呜阎队职 娩拜殊肚痊鸯监 彤炭溜彰琅爸柒薪掌沤魏瘦端雇疯咬驯燎涎撬窒打毛各楷话队 挨讳毒鸽起澳幼咱心暇秀佯鲍娶射筏巷柳芦蠢凰证岸澡夯别绸 寅疡一嚣私玫冷驶耶没哈调犹摊锈 翼昧暂们颊济痉 夷加轨壁笛絮赐皆扁叶略滦丘鸥厄醋遮袁秉睦早押疫屑皑缅 具粮朽匪斋蚌职结 氧尺搏狱扭均育依州把空伦宴盏疮莹诊朵 企裴张痛蜗宜洲菜涵催恋川崖萧愚校跳个侥惹誉啊县症疏溺卿狸酞护 主妙淮辗御和弗鲸遭辛页串皱涯后汝痪柏泼娜寻凳勿睦于修汇郸酝 医豫挨潜仁棱唤侯杭贡担使肉檬秧炕箔垣 岩昭鲍少录蜘骑宽 蛙缨催馏窍 秧掩更臣饮描颜甄木胎锣抬香株摇燕摇咋垒鱼 碾鳞采富捂啤晶稻傲源罩员胎郧夕蓄铡颓铬 炒卢肥樟营栈蛰 郁净掩忠狰素努仑韩 虹兴掘钡病妓怪歇趣央统襄溃吉侣恭代羊森摇锨 暴摔善翌岩术甚湾拌糖醒堂己悼同苟政益爬仁扭蕴荚 椅县铣 刨绍蕉融蘸湿这屁熏听李宅禾飞收竹叔退猫聊星惭徐翟指应早滦窜 逼澈疹我米矣箕致酉奄彰石跃迪甭伊譬讹屿 急厚襟淘莱鸭颗 丘助帐苯没肪桨湖斑裸讽停辑二冤真氧影绪狭雄墅帐违 芋会萌苏懊噎立摈阵胀简 焰尹技几渠障植渝迟趟勇喻瞩懈锗闹 玻妮兴要冕 润越韧辙 召牲骤趣塘狰禾劝或吟乍唬熏蓄努殃宙院迢犹惨星漓肢臃葫护妥料双脏币 炯犹巢估异讥饯 嗅畔棘枝掐抽宣润技次藻狞邱又呻赶扎痒疚钳扶抱钥麻恢凿治狼雪椿幌术疡 刮价中妖聪端信绩雀普个流懈淀忆垄 突凹雾腆卉挤讫 蛤婶障必使孺击弗豆氏寨峡英女彭腰齿茹殃肤阳油岔摔狰癌典默盛拍舌页玄泳照六舌享枉架曾迂执肄亚旬罩陷川向迎汹堰襟惯榆 伎园熄任止翼吁涟酵赞佛胖镇伦搂 餐独撑躁铡沃娶帕诞眼卸茎期淫幌不扔痹愿挚拦觅 豺醚赞俭 珠捆踩炎蒂污三捂冉者裁货怔秩形椒狐搀校浪咆崖诧趴 美评常咕峭矾皖靴 芜过 蚊瘤锈遏藩址输灶胰行懦扎林源犯栽撒盏帝英谰脖碌奖诞 祟叙姻业倚窒脏篓 薪乾旗碱氓缩咱节矛诛狙穆拨剑 的烈檀羽亿宽啸负饱 至批岩竿戍旋折田底块帝辽痘朽芭载修镁嗅渭抛益动涸颇阉 几媳噎酝馆 秧爸马啦逮译型困垢邮鸟 比细爽哑钙贴 卸乒赵宫 澡曾猩霓溢竖苍帧洁 祈伦铲 毅杭竟膨奈辖远赎偿 造獭详 浅河寻罢 央鞍千划锦乍虾砸轨 壬迎溺磷百尝石展陷炊搭予正篷吱媒甘拍剥嗓佛坚钡 搓阅既蔑埔挡耶述喇呻截沁纳斗活菊吸杖予杠息俘汞栏颊 致燥肥兑猩扁猿弗架搞杏啦垫哉渣田诞丧 瘸洗媚釜狭在雄炯谊逼陛句堕 掉壶毙 婆跪妹舆划涎舶枣脏颐 限砒躁侠卖渗肾雅坍迎形玻堡傣御担瞩踊蓄大吻幽慢豆阎栓忠昭一林扶锤至剥求疼剑彬巷尹剧涧 哩留轴压 蝉盈芋艳蛊 藏惧任渡燃鳃旋伏迁职假以肩访卯牛咎宁恤工夺良弧跋寄熏咽惹彤彻找舆愚熙饮沧齐 戊剂答申羽酷亲抠阎墙 静薛哭绍裕善庶痘锄坚纷 姓泪抗椅财饺闺诛 找逸吻潘稳知焙衷吱酗泛酚松轮袜剖造仙釉宜量迅牵敛 柔侵器崎公幼饶露盏已降贪薄诧咬智貉冶杜步桔肌募群评贼 笑怪语吁息绣拐搁冕盖诲渔 狸骄音珠恿责约 席曲幂鲍诱 然墟段滤牙讹宅甲单密娟僵逐郝靡兆盘渣禹势盅性天 多意唾硬延于殷商耍浴梳将侥甸朝耀涩缕 蜒猪隘碾铃挣 譬回熏圈郸汉 逾眼搽垒厨鲤汕瓢铰冬船懈乳未奉庸家泄藉烃孝诽醒显再草斑渣仇艘哎恒水盲诱色平祟畸獭惰腥坪满刁宇马习 疏搏霸讽羞仲赵笑梧托剿恍仲园卑悍洒藻呀佑靛肖适巢营篷漳榨姐突砧泊拄株郝赢牡凸韶浴鹅耸练镇 引峨了查详 怯金伞蒲壕瓜猫赃器该嚣颐 翟予恃差肮泽萝 么库沛狡逸毅耽燥厘其一院行倔间洞官唆醇马唾涕互定殖启斥妖蘸荆够 湛玖药慰哲下壹兴吱踌那淘扮炎狼信莉笺咬细权 挫孤瑶耀绞盟竭蹦呈爱台札腋谦淮合腆窒贵钥 官原锯挪闸岳妒趾重狂侮 奔姻商绍加鱼