梅毒检测技术规范介绍2013课件

梅毒实验室检测技术 中国疾病预防控制中心性病控制中心 中国医学科学院皮肤病研究所 尹跃平 研究员 2013年06月27日 海南海口 n问题及概述 n实验室检测注意事项及临床意义 n梅毒实验室检测策略探讨 主要内容 问题-1 下列哪些说法是错的？ 一旦感染梅毒，TPPA常终身阳性 TPPA可用于疗效判断 梅毒孕妇所生婴儿RPR和TPPA检测结果阳性可诊断 为胎传梅毒 RPR只能用于梅毒初筛 3 问题-1（续） 下列哪些说法是错的？ ELISA法不能用于初筛 诊断隐性梅毒，RPR滴度应在1：8以上 核酸检测方法可以用于梅毒的血液标本检测 二期梅毒时，TPPA和RPR两种血清学试验敏感性均 可达100 4 开展RPR/TRUST试验时应采用下面哪种 仪器或方法进行抗原抗体凝集反应： 水平旋转仪 振荡器 手工水平摇动 混悬器 问题-2 问题-3 下列描述正确吗？ “TRUST法对早期、晚期梅毒检测的敏感性 低及治疗后梅毒不敏感，如本组272例抗-TP确 认阳性样本，而其只检测到105例，敏感性为 38.2%” ”。 6 梅毒概述 7 梅毒起源于美洲，然后从美洲到西班牙，从欧洲到亚洲印 度，1505年从印度传入广东岭南（“广东疮”），后传到全 国各地。 少数民族地区居民梅毒感染率 = 10% 牧区人群梅毒感染率 = 48% 部分城市地区人群梅毒感染率 = 5% 部分农村地区人群梅毒感染率 = 2-3% （此幻灯片内容源自中国疾病预防控制中心性病控制中心陈祥生教授） 我国梅毒流行的历史-经济繁荣的附带品 通过三大措施，梅毒在我国实 现基本消灭 n健康教育和宣传运动 n免费梅毒筛查（梅毒血清制动试验 、荧光抗体试验） n治疗 我国梅毒基本消灭(1950-1964年) 作为重大防治成就、学术成就， 赢得国际上的广泛认可。 n1978年获得全国科学大会奖 n发表论文我国对梅毒的控制和 消灭、梅毒的传播及在中国 的消灭 （此幻灯片内容源自中国疾病预防控制中心性病控制中心陈祥生教授） 年代名称、归属和地点 皮肤 病 性病麻风 1954中央皮肤性病研究所（卫生部，北京）* 1957中国医学科学院皮肤病研究所（医科院，北京）* 1970中国医学科学院皮肤病研究所（医科院，泰州）* 1984中国医学科学院皮肤病研究所（医科院，南京）* 1987 中国医学科学院皮肤病医院/研究所 全国性病防治研究中心（卫生部，南京） * 2005- 中国医学科学院皮肤病医院/研究所 中国CDC性病控制中心/麻风病控制中心 * 性病控制中心 11 中国梅毒报告发病趋势 梅毒报告病例数448 620例，居甲乙类传染病第3位 梅毒报病较2011年增长4.41%，隐性梅毒增长的贡献率99.6% （此幻灯片内容源自中国疾病预防控制中心性病控制中心龚向东教授） 研 究 点 首次 调查 人数 梅毒感染 梅毒感染者 中HIV 人数率%人数率% 14136215.01016.1 249516533.32817.0 353315228.51912.5 4310206.555/20 合 计 175139922.86215.5 我国梅毒流行现状-高危人群感染率 分类梅毒感染 调查人 数 % A类场所21793.4 B类场所28085.6 C类场所129512.8 合 计62826.3 A类场所：卡拉OK酒吧、舞厅、茶吧、星级 宾馆 B类场所：发廊、按摩房、美容房、洗头房 、足疗房、路边酒店等 C类场所：站街女、出租屋、工棚女 失足妇女 MSM人群 （此幻灯片内容源自中国疾病预防控制中心性病控制中心陈祥生教授） 梅毒是一个可以临床治愈的传染病 病例诊断依据 病史 症状 实验室检查 实验室检查结果对梅毒诊断及判愈有决定性意义 我国政府梅毒控制相关政策 l卫生部于2010年6月3日下发了关于 中国预防与控制梅毒规划（2010- 2020年） l卫生部2011年2月12日下发预防艾 滋病、梅毒和乙肝母婴传播工作实施方 案 l国务院2012年1月13日中国预防控 制艾滋病五年行动计划（21011-2015 年） l2013年1月实施性病防治管理 办法 梅毒控制主要措施： 提高梅毒实验室检测质量 加强梅毒筛查力度 n问题及概述 n实验室检测注意事项及临床意义 n梅毒实验室检测策略探讨 主要内容 常用梅毒实验室检测方法 n病原学检测 n血清学检测 病原学检查 n原理：一期、二期梅毒时，取硬下疳、扁平湿 疣、黏膜斑等皮损部位组织液或淋巴结穿刺术得 到的组织液，在暗视野显微镜下，光线从聚光器 的边缘斜射到涂片上的梅毒螺旋体而发出亮光， 从而可根据其特殊形态和运动方式进行检测。 n方法：（1）暗视显微镜检查 （2）镀银染色法 （3）核酸检测（血液标本？） 注：梅毒螺旋体目前体外人工培养还没有获得成功 ，仅能通过接种兔睾丸等部位进行有限增殖。 病原学检查 n不同标本核酸检测研究初步结果： 皮损部位标本：阳性率 血浆标本阳性率： 全血标本： 一期梅毒阳性率 二期梅毒阳性率 隐性梅毒阳性率 ： 病原学检查的临床意义 n螺旋体检查是诊断早期梅毒 的最佳方法，对于患者的早 期诊断、及时治疗、预后和 尽早切断传染源都有十分重 要的意义。 n如未见到梅毒螺旋体，并不 能排除患梅毒的可能性。 梅毒血清学检测方法 (1) 非梅毒螺旋体抗原血清学试验 （非特异性梅毒抗体） (2) 梅毒螺旋体抗原血清学试验 （特异性梅毒抗体）两类方法。 问题：问题： 为什么梅毒诊断需要上述两类血清学检测方法为什么梅毒诊断需要上述两类血清学检测方法 ？ 非梅毒螺旋体抗原血清学试验原理 n梅毒螺旋体一旦感染人体，宿主可对螺旋体表面的脂质作 出免疫应答，产生抗类脂抗原的抗体（非特异性抗体）。 n未经治疗的病人，其血清内的非特异性抗体可长期存在。 经正规治疗后，非特异性抗体可以逐渐减少滴度至转为阴 性。 问题：问题： 临床上非梅毒螺旋体抗原血清学试验为什么需临床上非梅毒螺旋体抗原血清学试验为什么需 要做定性和定量两种检测方法？要做定性和定量两种检测方法？ 非梅毒螺旋体抗原血清学原理 n方法包括： （1）快速血浆反应素环状卡片试验 (RPR) （2）甲苯胺红不加热血清试验（TRUST） （3）性病研究实验室试验 (VDRL)等。 n基本成分是心磷脂 卵磷脂和胆固醇 n抗原抗体结合形成复合物，凝集成网状沉淀颗粒被肉 眼所见 n上述方法的敏感性和特异性都基本相似 非梅毒螺旋体抗原血清学试验原理示意图 非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点 1、仪器：水平旋转仪，转速？转幅？ 2、定性试验 n加样：吸取0.05mL血清(浆)放在卡片圈中， 并均匀地涂布在整个圈内 n加抗原：将抗原轻轻摇匀，用9号针头加1滴抗原 n反应：水平旋转仪旋转8分钟(23 -29 ） ， 亮光下观察结果 ？滴/mL，1滴=？ul 非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点 1、仪器：水平旋转仪，转速、转幅 2、定性试验 n加样：吸取0.05mL血清(浆)放在卡片圈中， 并均匀地涂布在整个圈内 n加抗原：将抗原轻轻摇匀，用9号针头加1滴抗原 n反应：水平旋转仪旋转8分钟(23 -29 ） ， 亮光下观察结果 60滴/mL，1滴=17ul 100r/min 约18mm 非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点 3、定量试验 n稀释夜准备：在反应纸板圈内加入50uL生理盐水（根据需要确定圈数),勿将盐水涂开 n加样：吸取50uL血清（浆）与各圈中盐水作系列稀释，并涂布整个圈内。 n 下同定性试验。 ？ 1:21:41:81:16 1:321:641:2561:1281:512 定量试验结果判断 血清稀释度 结果 ？1:21:41:81:16 +- ？ +- ？ +- ？ 问题：定量试验原倍血清滴度是多少？问题：定量试验原倍血清滴度是多少？ 问题：定量试验血清稀释需要使用试管吗？问题：定量试验血清稀释需要使用试管吗？ 非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点 3、定量试验 n稀释夜准备：在反应纸板圈内加入50uL生理盐水（根据需要确定圈数),勿将盐水涂开 n加样：吸取50uL血清（浆）与各圈中盐水作系列稀释，并涂布整个圈内。 n 下同定性试验。 1:1 1:21:41:81:16 1:321:641:2561:1281:512 定量试验结果判断 血清稀释度 结果 1:11:21:41:81:16 +- 1:1 +- 1:2 +- 1:8 TRUST 1:16 非梅毒螺旋体抗原血清学试验结果判断 RPR 1:256 1:11:21:41:81:16 1:11:21:41:81:16 1:321:641:1281:2561:512 1:321:641:1281:2561:512 非梅毒螺旋体抗原血清学试验临床意义 早期梅毒（一期、二期）经足量规则抗梅毒治疗后 n 一期梅毒1年后转为阴性 n 二期梅毒2年后转为阴性。 n 晚期梅毒 治疗后血清滴度下降缓慢，2年后约 50%病人血清反应仍为阳性。 非梅毒螺旋体抗原血清试验临床意义 n非梅毒螺旋体抗原血清试验方法简单、快 速、敏感性和特异性较好。适用于大量人 群的筛查。 n因治疗后血清滴度可下降并阴性，故可作 为疗效观察、判愈、复发或再感染的指征 。 nVDRL试验用于神经梅毒脑脊液检测特异 性高，检测阳性可以作为神经梅毒确诊依 据，但敏感性较低，即检测阴性不能排除 神经梅毒。 梅毒 病期 敏感性 (%) 特异性 (%) 一期 86（77-99） - 二期100 隐性98(95-100) （一般滴度1:8， 但不排除1:8） 晚期73 非梅 毒 -98(93- 99) 非梅毒螺旋体抗原血清学试验特点 假阳性反应 n技术性假阳性反应一般是由于操作错误引起的 假阳性反应，经过重复试验即可排除。 n生物学假阳性反应(一般滴度小于1:8），应采 用梅毒螺旋体抗原血清学试验如TPPA等进行排 除。 梅毒螺旋体抗原血清学试验原理 n抗原为梅毒螺旋体特异蛋白（包括螺旋体重 组特异抗原），检测梅毒患者血中特异性抗 梅毒螺旋体抗原的抗体。 n感染梅毒螺旋体后，一旦梅毒螺旋体抗体试 验呈阳性，则患者终身阳性。 问题：梅毒螺旋体抗原血清学试验的定量试验问题：梅毒螺旋体抗原血清学试验的定量试验 在梅毒诊疗中有意义吗？在梅毒诊疗中有意义吗？ 梅毒螺旋体抗原血清学试验方法 n梅毒螺旋体颗粒凝集试验 (TPPA) n 梅毒螺旋体血球凝集试验 (TPHA) n 梅毒酶联免疫吸附试验（ELISA） n 化学发光免疫分析法（CLIA） n 梅毒免疫层析法-梅毒快速检测 (RT) n 荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS） n梅毒螺旋体蛋白印迹试验（WB） TPPA nTPPA试验用梅毒螺旋体致敏明胶颗粒人血清中的抗梅 毒螺旋体抗体结合，产生可见的凝集反应，具有较高 的敏感性和特异性。 n TPPA是目前WHO公认的梅毒抗原血清学试验的“ 金标准”，常用于新方法、新试剂的参照标准。 + 明胶颗颗粒梅毒抗原 + 抗原致敏颗颗粒 抗原致敏颗颗粒血液中抗体 抗原抗体凝集 TPPA试验原理示意图 36 4+： 粒子光滑覆盖整个孔底，有时边缘有折叠 3+： 粒子光滑覆盖大部分底 2+：粒子光滑聚集覆盖孔底，周围有一细胞环 1+： 粒子光滑集聚覆概孔底，周围有一明显细胞环 ： 粒子沉集孔底，中央形成一小点 ： 粒子紧密沉积孔底中央 TPPA试验结果判读 敏感性 特异性 病期一 期 二 期 隐 性 临床试验a100100100 美国CDC8810010095 a:均为RPR阳性标本 ELISA/ CLIA nELISA试验是用重组梅毒螺旋体抗原包被固相 板条，加上梅毒血清和单克隆抗体酶标记物， 形成抗原抗体复合物与酶标记物结合，用酶联 检测仪判定试验阳性反应。 n本法可用于大样本血清检测。 化学发光法的临床应用意义基本同ELISA 化学发光法的敏感性？ 梅毒免疫层析快速检测方法（全血法） 38 梅毒免疫层析快速检测方法（血清、血浆法） 梅毒螺旋体抗原血清试验临床意义 n作为非梅毒螺旋体抗原血清试验(如RPR等)初筛 阳性标本的确证试验，排除RPR 假阳性。 n不能区分既往感染和现症感染，应结合非梅毒螺 旋体抗原血清试验结果进行诊断。 nTPPA等梅毒螺旋体抗原血清试验不能作为疗效 观察的指标。 非梅毒螺旋体抗原血清试验结果解释示意图 早期晚期 一期 二期 早期潜伏 晚期潜伏 三期 治疗前 治疗后 阳性 阴性 梅毒螺旋体抗原血清试验结果解释示意图 早期 一期 二期 早期潜伏 晚期 晚期潜伏 三期 治疗前 治疗后 阳性阴性 梅毒血清学试验结果解释（梅毒临床诊断参考依据） 43 试验结果参考结果解释* 梅毒螺旋体抗原 血清试验 非梅毒螺旋体抗原 血清试验 阳性阳性可能为现症梅毒 阴性阳性非梅毒螺旋体血清试验假阳性 阳性阴性临床治愈的早期梅毒（既往感染 者） 或极早期梅毒 阴性阴性排除梅毒感染 或极早期梅毒 问题问题 ：此结结果解释释适用于先天（胎传传）梅毒吗吗？ 先天（胎传）梅毒的实验室诊断依据 n查到螺旋体 n其抗心磷脂抗体滴度持续上升 n其抗心磷脂抗体滴度高于其母亲四倍（2个稀释滴度） n检测抗梅毒的IgM特异性抗体阳性 n随访18个月观察抗体的变化（哪一类抗体？） 预防艾滋病、梅毒和乙肝母婴传播工作实施方案 问题问题 ：IgG抗体和IgM抗体有什么区别别？ 梅毒IgM抗体（TP-IgM） IgM抗体的产生是感染后的早期体液免疫应答反 应。IgM分子比IgG较大，所以IgM抗体不能通过胎盘 屏障。而母亲的IgG抗体可以通过胎盘屏障传给胎儿。 因此若在新生儿血中检测到IgG抗体不能作为先天梅毒 的诊断依据，而IgM抗体可为先天梅毒的诊断依据。 IgM抗体检测其特异性较高，但敏感性较低。因 此，IgM抗体检测阴性，不能排除先天梅毒感染。 45 先天（胎传）梅毒的实验室诊断依据 n查到螺旋体 n其抗心磷脂抗体滴度持续上升 n其抗心磷脂抗体滴度高于其母亲四倍（2个稀释滴度） n检测抗梅毒的IgM特异性抗体阳性 n随访18个月观察抗体的变化（特异性抗体） n问题及概述 n实验室检测注意事项及临床意义 n梅毒实验室检测策略探讨 主要内容 梅毒实验室检测策略思考 48 非梅毒螺旋体抗原血清学试验 梅毒螺旋体抗原血清学试验 n排除试验假阳性 n确证梅毒螺旋体现症感染 n排除治愈的既往感染者 n确证梅毒螺旋体现症感染 ？RPR：初筛试验 TPPA：确证试验 梅毒实验室检测策略思考 方法选择依据 n敏感性、特异性（试剂评估） n操作流程（可及性） n试剂的价格、结果时间（可接收性） 49 ？初筛目的和方法选择 规范化梅毒实验室检测要求 n根据目的选择检测方法及检测策略。 n可采用任何一类梅毒血清学检测方法作 为筛查试验。 51 52 阳性 梅毒螺旋体血清试验 （ELISA） 阴性 报告： ELISA 阴性 阳性 RPR 定性/定量试验 阴性 推荐 TPPA 复检 阳性 报告： ELISA 阳性 RPR 阳性及滴度 果 阴性 报告： ELISA 阳性 TPPA 阳性 RPR 阴性 报告： ELISA 阳性 TPPA 阴性 RPR 阴性 报告： ELISA 阳性 RPR 阴性 果 规范化梅毒实验室检测基本要求 一、人员 检测技术人员需经过上岗培训。接受上岗培训内容应包括：梅 毒检测相关基础知识、梅毒实验室检测技术基本实验操作要求、结 果解读及临床意义、质量保证与生物安全等。 二、试剂 常规血清学检测应采用经国家食品药品监督管理局注册批准的 试剂。因不同厂家生产的同一种试剂的敏感性和特异性存在一定的 差异，建议选择临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。所有试剂 须严格按要求妥善保存，并控制在有效期内使用。 53 54 非梅毒螺旋体抗原血清试验 快速血浆反应素环状卡片试验 (RPR) 甲苯胺红不加热血清试验（TRUST） 性病研究实验室试验 (VDRL) 梅毒螺旋体抗原血清试验 梅毒螺旋体颗粒凝集试验 (TPPA) 梅毒螺旋体血球凝集试验 (TPHA) 梅毒酶联免疫吸附试验（ELISA） 梅毒免疫层析法-梅毒快速检测 (RT) 荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS） 化学发光免疫分析法（CLIA） 梅毒IgM抗体检测（IgM） 梅毒螺旋体蛋白印迹试验（WB） 血清学检测试剂的种类 2012年全国梅毒诊断试剂临床质量评估情况介绍 (评估结果：非梅毒螺旋体抗原血清学试验) 试剂简称 敏感性(%) 特异性(%) 功效率(%) Kappa值 n科华RPR 96.6 96.3 94.4 0.914 n英科TRUST 96.6 95.9 96.1 0.907 n金豪TRUST 95.5 92.6 93.5 0.848 n荣盛TRUST 91.0 98.6 96.4 0.911 n万泰TRUST 71.9 100.0 91.8 0.784 2012年全国梅毒诊断试剂临床质量评估情况介绍 (评估结果：梅毒螺旋体抗原血清学试验) 方法 试剂简称 敏感性(%) 特异性(%) 功效率(%) Kappa值 化学发光法 科美发光 96.4 100.0 98.7 0.971 酶免法 万泰ELISA 96.4 100.0 98.3 0.971 现代ELISA 96.4 100.0 98.3 0.971 英科ELISA 95.5 100.0 98.3 0.964 丽珠ELISA 95.5 100.0 98.3 0.964 科卫ELISA 95.5 100.0 98.3 0.964 金豪ELISA 95.5 100.0 98.3 0.964 华大ELISA 95.5 99.0 97.7 0.950 三维 ELISA 94.6 100.0 98.0 0.957 科华ELISA 94.6 100.0 98.0 0.957 免疫层析法 艾博RT 95.5 98.4 97.4 0.943 万泰RT 94.6 99.5 97.7 0.950 日本Deter