生物技术在育种中应用

中国农业大学蔬菜系 沈火林 62892831 生物技术在园艺育 种中的应用 1、生物技术与常规育种手段的关系 2、应用的领域 3、再生途径及特点 4、花培、突变体筛选、分子育种（ 转基因、辅助育种）等应用的特点 课程重点内容 生物技术（biotechnology）： 离体培养技术（plant in yitro culture） 分子育种（molecule breeding） 分子育种：基因工程 （plant genetic engineering） 分子标记辅助育种 （assisted selection bredding by molecule marker） 一、绪论 常规与生物技术比较： A、目标 B、育种方法与效率 C、设想成功应用育种 一、结论 1、快速无性繁殖和脱毒苗的生产 2、人工种子 3、加速亲本材料的纯化 4、克服远缘杂交的障碍 5、得到体细胞杂种和胞质杂种 6、倍性控制 7、无性变异体选择及突变体的离体筛选 8、基因工程定向改良品种 9、种质资源的保存 10、分子标记技术的应用 生物技术在园艺菜育种中的应用 1、概念 生物技术是一门应用生物科学和工程学的原理 来加工生物材料或用生物及其制备物来加工原料， 以提供所需的商品和社会服务的综合性科学技术。 “技术”所以生物技术的发展是依赖于其它学 科的发展而建立和不断发展和完善的，是多学科综 合运用的结晶。 （一）概念和意义 中国农业大学蔬菜系 2、意义-为什么人们如此重视 (1)生物技术所研究和开发的对象是可再生的生物资源，它对 解决当今社会所面临的重大问题：如人口和食物、能源和资源 、环境与健康(污染)等迫切需解决的问题将发挥重要的作用。 (2)反应是在常温常压下进行，又可连续化，步骤单一，产物 单一，所以生产周期短，节约能源，成本低，环境污染少。 (3)可解决抟统技术无法解决的问题，如遗传病的诊断和治疗 ，以及新生物能源的开发等。 (4)它可按人类的意愿改良和创建新的物种，以适应多方面的 需要。 （一）概念和意义 中国农业大学蔬菜系 1、医药工业 2、食品工业 3、化学工业 4、农业应用 5、能源与环境 6、采矿 7、军事上的应用 （二）生物技术的应用 中国农业大学蔬菜系 （一）快速繁殖(Rapid propagation或 Micropropagation)与脱毒苗的生产 植株再生plant regeneration 1、意义 快繁的优点： 脱毒的意义： 2、快速繁殖所有内容的基础 二、生物技术在蔬菜品种改良中的应用 中国农业大学蔬菜系 （1）离体再生植株的基本过程 4 （1）基本过程 4无菌培养物的建立(稳定、继代再生能力强的无性系) 4 4芽的增殖 4 4诱导根形成完整植株 4 4移栽驯化 中国农业大学蔬菜系 再生植株的三条基本途径 4 增殖 4 4 4 分生组织侧芽分化嫩枝生根 4 优 (A) 4 增殖 4 良 完 移 4 整 栽 4 单 芽分化 嫩枝 生根植成 4 (B) 株 活 4 株 增殖 4 4 其它外植体 芽分化嫩枝生根 4 (1) 4 (C) 4 愈伤组织细胞悬浮 4 4 (2) 4 胚状体发育成植株 4 注: A、B、C(1)途径增殖系数较低 4 A 途径不易变异 4 C(2)途径繁殖系数最大,但易变异 （2）影响快速繁殖在商品化蔬菜种苗生产 中应用的因素 蔬菜生产本身特点决定 建立完整的高效植株再 生技术体系问题 成本问题 “兰花工业问题？” 中国农业大学蔬菜系 3、脱毒苗 （1）脱毒苗的生产过程 选择母株 - 应预先进行病毒鉴定,明确病毒种类 -视病毒种类及严重程度进行预处理,如热处理 剥取适宜大小的茎尖(0.2-0.5mm) 培养 - (有必要时可进行热处理) - (在培养基中加入抗病毒化合物等) 再生植株 部分保留 部分移入室中 部分试管苗直 以备病毒鉴定 接用于病毒鉴定 保存 移栽:无性系选择 比较有无生理 指 血 生 和遗传变异并 示 清 电 物 进行品比试验 植 学 镜 方 物 法 选择适宜的无性系大量繁殖无病毒原原种无病毒原种无病毒生产用种 3、脱毒苗 （2）影响病毒脱毒的因素： 茎尖大小 表：茎尖大小对马铃署脱毒的影响 中国农业大学蔬菜系 茎尖大小mm叶原基数植株数脱毒% 0.1215048.0 0.2724242.9 0.604640 3、脱毒苗 （2）影响病毒脱毒的因素： 不同种类病毒脱毒的难易程度不同 培养基中加入化学药剂及物理处理 病毒之间的互相影响 中国农业大学蔬菜系 3、脱毒苗 （3）组织培养中其它途径脱毒： 花培 愈伤组织 原生质体培养 中国农业大学蔬菜系 （二）人工种子 1、人工种子的结构和特点 A、相当于“种皮”，B、“胚乳或子叶”，C、胚状体或芽。 中国农业大学蔬菜系 C B A （二）人工种子 2、人工种子的优越性和在品种 改良中的应用 （1）胚状体数量多 （2）固定优良基因型 （3）人工调节营养物质 中国农业大学蔬菜系 （二）人工种子 3、人工种子的生产和技术关键 二部分： 高质量的芽或胚状体培养 胶囊化技术 生产过程： 产生胚状体包埋保存萌发。 中国农业大学蔬菜系 （二）人工种子 3、人工种子的生产和技术关键 几个关键： （1）诱导产生胚状体 影响胚状体发生的因素 促进胚同步发育的方法 （2）种子的埋包 （3）保存 （4）种子的萌发 中国农业大学蔬菜系 人工种子（胚状体）包埋常用方法 胚状体 一定口径的吸管 15分钟 2.5%氯化钙 胶囊人工种子 2-4%褐藻酸钠 滴入到 离子交换 和营养成分 疏水界面(ELVAX聚合体) 水冲洗停止离子交换 胚状体包埋的另一方法 4 放入 胚状体 一定大小的模子滴入一种温度依敕性凝胶 4 (如琼脂) 4 4 干燥 形成凝胶 温度下降 （三）加速亲本材料的纯化 1、花药或花粉培养 （1）优点：加速育种进程 亲本 AAbbaaBB 花 培 单 单倍体植株 F1(AaBb) F2 常 倍 F3 染色体 规 体 加倍 . . 育 纯合二倍体 . 育 种 F5或F6(稳定品系) 种 选择与鉴定 品种比较、示范推广 （三）加速亲本材料的纯化 1、花药或花粉培养 （1）优点： 雌雄异株植可得到完全纯合基因 型（超雄株） 远缘杂种纯化 加速诱变育种进程 （三）加速亲本材料的纯化 （2）花药培养和花粉培养的比较 A、操作与再生率； B、再生途径与体细胞干扰。 （3）花培的局限性 A、再生频率低与基因型间差异， B、再生株的染色体数变异和基因突变。 C、白化苗， D、遗传遗传 背景贫贫瘠化， E、再株的退化和劣变的问题。 中国农业大学蔬菜系 （三）加速亲本材料的纯化 （4）影响花培诱导率的因素 内因（植物本身状况）； A、供体植株基因型， B、花粉发育时期， C、供体植株的生理状况和花药预处理。 中国农业大学蔬菜系 （三）加速亲本材料的纯化 （4）影响花培诱导率的因素 外因（培养基条件和环境）： D、培养基的选择：元素含量、激素种类和浓度、糖种类和浓度。 E、培养方式， F、其它因素：如活性炭、接种花药密度、其它 有机附加物等。 G、培养的环境条件，光照、温度等。 中国农业大学蔬菜系 （三）加速亲本材料的纯化 （5）花培中雄核发育问题 二个途径： 雄核有丝分裂形成愈伤组织， 雄核有丝分裂形成胚状体。 小孢子发育成胚状体有三条途径： 小孢子经正常的一次有丝分裂后，营养细胞形成胚状体； 小孢子经非极性的有丝分裂，形成二个均等的细胞，参与胚状体 的形成； 小孢子经正常的第一次有丝分裂后，营养细胞和生殖细胞都参 与胚状体的形成。 （6）花药培养单倍体育种技术在蔬菜中的实践 花药培养：辣椒 王玉英1973年首次报道通过花药培养得到辣椒单倍体幼苗，其后海淀区农科 所等(1976)开始研究： A、灭菌：“洒精新洁尔灭氯化汞无菌水”，接种污染率下降到 1%左右。 B、培养基：以SPD-2和SPD-3两种培养基为最优。3%遮糖、0.5%活性炭，胚状 体诱导率最高。胚状体的形成对激素的选择较为专一，以激素KT和NNA配合的效 果最佳。 C、品种间诱导率差异较大。杂种的诱导率高于常规品种，以诱导率高的品种 或花培品种作亲本选配的杂种一代，其胚状体诱导率也较高。 D、时期：单核靠边期诱导率最高。 E：10个花/50ml三角瓶诱导率较高。 中国农业大学蔬菜系 （6）花药培养单倍体育种技术在蔬菜中的实践 花药培养：辣椒 正常发育的胚状体不需转入其它培养基就可 发育成正常的植株。最高胚状体诱导率27%左右， 单倍体幼苗移栽成活率高达90%以上，人工染色体 加倍成功率稳定在90%左右。 海花系列、海丰系列品种。 中国农业大学蔬菜系 （6）花药培养单倍体育种技术在蔬菜中的实践 辣椒花培后代的遗传： 调查表明：花培当代的果实主要性状能 稳定地传给后代，自二代起株系内整齐一致 ，确能缩短育种周期。 通过配合力分析表明：花培纯化的基因 型，其后仍保持高的配合力。 中国农业大学蔬菜系 （6）花药培养单倍体育种技术在蔬菜中的实践 辣椒花培后代变异： 花培可产生较丰富的遗传变异，可从稳定的品种培育出新的 品种。如海淀农科所从“保加利亚辣椒”、“四方头甜椒”、 “782031甜椒”花培分别育成了与原品种有明显区别的“海花1号” 、“海花2号”和“海花3号”；张家口市蔬菜所从“易县甜椒”花培 育成了株系“塞花一号”等，这是常规育种方法不易做到的。 而且花培株系中有30%以上其主要农艺性状显著优于其诱导 材料，所以花培不仅能缩短育种周期，而且能增加遗传变异。 中国农业大学蔬菜系 （6）花药培养单倍体育种技术在蔬菜中的实践 花粉培养：大白菜 A、基因型： 成功90%以上，冬性强的中晚熟品种优于春性 早熟品种，最高34个胚/花药，但春早熟的黄芽14仅0.3个胚/花药 。 B、培养基：最关键是蔗糖、激素和有机物，13%、不加激 素最佳，添加丝氨酸、叶酸、谷光甙肽和生物素有利形成胚。 C、高温处理：小孢子先在33度处理24-48小时有利，再转入 暗培养。 D、活性炭：加入一定量有利形成。 中国农业大学蔬菜系 （6）花药培养单倍体育种技术在蔬菜中的实践 2、未传粉子房培养 1979年San Noeum首次报道在大麦上培养未传粉子 房得到单倍体植株，祝仲纯等在1979、1980、1981年分 别在小麦、烟草、黄花烟上得到成功，现在在玉米、百 合、茄子、油菜上均有成功的报道。 它在培养中操作较花培简单、易于操作、适于大孢子 培养的时期较花培中小孢子为宽(但以较成熟的成功率 为高)、另外在禾本科上实验结果认为大孢子培养白化 苗比率明显下降，是一种很有前途的方法。 中国农业大学蔬菜系 （6）花药培养单倍体育种技术在蔬菜中的实践 3、胚培养缩短育种周期 实验中，如果种子不能（易）成熟，无法得 到后代，可把幼胚进行培养得到完整种子或幼苗 。如在大白菜中可在授粉后适宜时期进行幼胚培 养，促使提前成熟和萌发成幼苗，并在培养基中 低温春化处理，试管苗定植后就可抽苔开花，缩 短了育种周期。 中国农业大学蔬菜系 （四）克服远缘杂交的障碍 4 1、杂交不亲和性 4 离体试管受精：雌蕊离体受精法、子房壁切除法 4 2、远缘杂种的不育性 4 3、远缘杂种的不稔性和剧烈分离 中国农业大学蔬菜系 （五）倍性控制 4组培条件下染色体数目变化： 花培得到单单倍体、试试管内染色体人工 加倍、自然加倍、胚乳培养等。 中国农业大学蔬菜系 （六）体细胞杂种或胞质杂种 体细胞杂种（somatic hybridization） 1、原生质体培养和融合的意义 （1）原生质体比完整细胞更能摄取外来的遗传物质、 （2）原生质体更易发生变异，可丰富遗传变异。 （3）得到远缘体细胞杂种，创造新物种，或提高原有 品种的抗性、改良品质等。 （4）胞质杂种及雄性不育的培育（非对称性融合） 2、原生质体培养和融合过程 （1）原生质体培养 取材 预处理 原生质体分离 一步法分离 二步法分离 纯化 进一步纯化 原生质体活力测定 2、原生质体培养和融合过程 （1）原生质体培养 培养 细胞壁再生 分裂 愈伤组织 胚状体 (1-5mm) 芽 胚状体 根 完整植株 2、原生质体培养和融合过程 （2）原生质体融合 原生质体融合过程 甲原生质体 甲 杂种 再生 等体积混合融合细胞筛选完整杂种鉴定 乙原生质体 乙 和培养 植株 中国农业大学蔬菜系 3、原生质体非对称性融合 物种间的生殖隔离在一定程度上阻碍了作物遗传育种的 进程，使通过基因重组得到优良品种的工作受到限制。 原生质体融合通常可分为两种形式：对称融合和非对称 融合。 两种融合形式产生三种类型的杂种： A、综合了双亲全部遗传物质的对称杂种； B、部分遗传物质发生丢失的非对称杂种； C、只有融合双亲一方核物质的胞质杂种。 其中第三种方式可实现细胞质遗传物质的转移，而不影 响细胞核遗传物质（通常采用的有性杂交只能转移细胞核中 的遗传物质，而细胞质遗传物质是母系遗传的）。 3、原生质体非对称性融合 非对称融合： 融合前先对一方亲本（供体）的原生质体进行预处 理，钝化细胞核，然后再和另一亲本（受体）的原生 质体融合。对供体进行处理是为了造成染色体的断裂 和片段化，使其染色体进入受体后部分或全部丢失， 达到只转移细胞质基因组的目的，同时处理后原生质 体不能分裂，不能再生细胞团，能简化杂种细胞再生 后代的筛选。 3、原生质体非对称性融合 非对称融合： 为了减少融合再生后对受体细胞的筛选，一般还采用一些代 谢抑制剂（如碘乙酸IA、碘乙酰胺IOA、罗丹明R-6-G）处理 受体原生质体，以抑制其细胞分裂。 受IA、IOA、R-6-G处理的受体原生质体和未受代谢抑制剂处 理（但经核失活处理）的供体原生质体融合后，代谢上得到 互补，能正常生长，而未融合的经处理的原生质体在培养过 程中慢慢地变形、破裂而被淘汰。 3、原生质体非对称性融合 非对称融合： 目前供体的处理可采用射线辐射原生质体、限制性内切酶处理原 生质体、染色体收缩剂处理原生质体等方法。一般认为处理效果以 射线最佳。 非对称性融合获得非对称杂种外，更重要的价值是可以获得胞质 杂种。由于射线等作用，供体核物质在融合杂种中完全丢失，杂种 中只保留了受体的细胞核，因此融合的结果是将供体胞质基因组转 移给了受体，实现了受体核基因组与供体胞质的重组，得到胞质杂 种，实现了与胞质基因有关的性状如细胞质雄性不育、抗除草剂和 抗真菌毒素等的直接转移。 中国农业大学蔬菜系 3、原生质体非对称性融合 非对称融合： 品种内细胞质转移：如萝卜胞质(OguCMS)的大 白菜、不结球白菜雄性不育材料改良，胡萝卜种 内品种间转移瓣化型胞质雄性不育基因等。 不同物种间转移细胞质基因组创造新种质（蔬 菜上研究较少）。 中国农业大学蔬菜系 3、原生质体非对称性融合 无菌外植体（供体、受体） 愈伤组织诱导（包括胚状体）和细胞悬浮系建立 原生质体分离、纯化、培养 供体辐射处理 受体代谢抑制剂处理 （原生质体活力测定） （原生质体活力测定） 原生质体非对称融合 （电融合、聚乙二醇法等） 融合原生质体培养再生植株 再生植株移植栽培 再生植株的鉴定 （形态学、细胞学、分子生物学方法鉴定） （七）体细胞无性系变异和突变体的筛选 1、概念和区别 无性系(Clones)：一般将组织培养物再生的植株称 为无性系。每一个再生的植株称为一个无性系。 体细胞无性系（soaclonal）：指体细胞再生的植株， 无论是通过愈伤组织还是原生质体得到的无性系统称为体 细胞无性系，并把再生的植株中出现的变异叫体细胞无性 系变异(Soma clonal Variation)。 中国农业大学蔬菜系 （七）体细胞无性系变异和突变体的筛选 1、概念和区别 突变体(Mutant)：在遗传物质一级结构上发 生的永久性、且能遗传的变化称为突变，这种突 变了的细胞或植株称为突变体。 没有明确什么原因引起的变异之前应把获得 的变异细胞或个体称为变异体(Variant)。 中国农业大学蔬菜系 （七）体细胞无性系变异和突变体的筛选 体细胞无性系变异和突变体的区别？ 中国农业大学蔬菜系 （七）体细胞无性系变异和突变体的筛选 2、应用前景和变异特点 (1)突变率高，且能基本保持原品种的特性，只在 1-2个性状上发生变化。 (2)变异广泛，且专化性强。 (3)取材方便，可节约时间和空间。 (4)后代稳定快，纯合体突变占的比率高，在第 二代就可得到稳定的株系。 (5)通过筛选可激活某些潜在的隐性性状 中国农业大学蔬菜系 3、植物抗性突变体的产生和分类 （1）筛选过程 诱变处 理或不处理 选择压 外植体 愈伤组织 悬浮培养 短期培养 抗性愈伤组织 去除选择压培养 加选择压培养 利用 抗性突变体的遗传分析 抗性鉴定 再生抗性植株 3、植物抗性突变体的产生与分类 4（2）突变的产生 4 离体培养细胞的自然突变 4 A、植物的繁殖类型： 4 B、外植体的来源： 4 C、再生方式： 4 D、愈伤组织继代次数和培养时间： 4 E、激素： 4 人工诱变 中国农业大学蔬菜系 3、植物抗性突变体的产生与分类 4（3）供诱导和选择的试材 4（最理想的材料是单细胞，且最好是单倍体 ） 4 目前常用的三种材料： 4 A、悬浮培养的细胞： 4 B、原生质体： 4 C、愈伤组织直接诱变：简单 3、植物抗性突变体的产生与分类 4（4）筛选 4 以正选择为主： 常用的是加入病原物的毒素，或类似物） （七）体细胞无性系变异和突变体的筛选 （5）抗性突变体和变异体的类型 氨基酸及其氨基酸类似物抗性突变体（品质） 除草剂抗性突变体 胁迫抗性突变体 抗病突变体 其它突变体 中国农业大学蔬菜系 （八）基因工程在育种中的应用 1、进展 4 （1）抗除草剂转剂转 基因植株 4 现现已得到抗几类类除草剂剂的转转基因植物： 4 抗均三氮苯类类，如西玛玛津，作用是阻断光合系统统反应应中心 的电电子传递传递 ； 4 抗草甘膦膦(Glyphosate) ，它是应应用很多的非选择选择 性除草剂剂， 它破坏三种芸香族氨基酸的生物合成途径中的关键键酶； 4 抗磺酰酰尿类类和咪唑酮类唑酮类 ，它是破坏三种分枝氨基酸合成中的 关键键酶； 4 抗ppt除草剂剂，这这是欧洲用的最多的选择选择 性除草剂剂。 中国农业大学蔬菜系 （八）基因工程在育种中的应用 （1）抗除草剂转剂转 基因植株 4 应用最成功（已商品化）：美国“孟山 都(Monsanto)”公司，生产产出商品化的抗“ 农农达(Roundup)”（草甘膦膦）大豆、玉米、 油菜、棉花。草甘膦膦是灭灭生性除草剂剂，但 使用时对时对 抗性的上述四种作物来说说是安全 ，却能杀杀死全部杂杂草。 中国农业大学蔬菜系 （2）抗病转基因 4 抗病毒的基因工程 4A、病毒外壳蛋白介导的抗性 4 利用本无毒性的病毒外壳蛋白抑制病毒的 复制（脱壳）或激发宿主的抗性反应，病毒 外壳蛋白基因在植物体内表达产生对病毒病 的交叉保护反应,从而使植株获得抗病毒的能 力。 中国农业大学蔬菜系 （2）抗病转基因 4 抗病毒的基因工程 4 B、微卫星RNA 它不能独立侵染和复制，但可干扰病毒的 复制； 4 也可利用病毒反义RNA,构成双建RNA,使 病毒无法复制， 中国农业大学蔬菜系 （2）抗病转基因 4 抗病毒的基因工程植物 4 C、病毒复制酶介导的抗性 4 利用源于病毒的复制酶基因干扰扰病毒 的复制（如识别识别 、切割病毒的特定区域，破 坏其生物功能）。 中国农业大学蔬菜系 （2）抗病转基因 4抗真菌基因工程植株 4 A、几丁质酶基因 4 其表达产物可以使真菌的 细胞壁降解。 中国农业大学蔬菜系 （2）抗病转基因 4抗真菌基因工程植株 4 B、核糖体失活蛋白基 因 4 其机理是阻止真菌蛋白 的表达 中国农业大学蔬菜系 （2）抗病转基因 4抗真菌基因工程植株 4 C、植物凝聚素 4Mena等利用-甲基-硝基-亚硝基胍诱变 辣椒疫霉,富集游动孢子得到13个非致病突变体 (NOP),用NOP游动孢子及菌丝接种辣椒幼苗和 果实,均未产生辣椒疫霉病的病症。而且NOP突 变的非致病表型至少能持续25个无性世代。 中国农业大学蔬菜系 （2）抗病转基因 4蔬菜抗细菌病转基因 4 蛋白类 ： 4 抗菌肽类 4 溶菌酶类 4 其它抗菌蛋白类 中国农业大学蔬菜系 （3）抗虫基因工程 4 苏云金杆菌是有效的生物杀虫剂，主要对鳞 翅目害虫有特效。其中起杀虫效果的是该菌中 的伴孢晶体蛋白，它占菌体蛋白的30%，现已得 到转晶体蛋白的基因植株，如烟草、番茄、棉 花等，并初步鉴定有一定地抗性。 中国农业大学蔬菜系 （3）抗虫基因工程 4 另一种抗虫基因是蛋白酶抑制基因 ，蛋白酶抑制基因是植物对病菌和害 虫的自然防御体系，目前已有少量成 功的报道。 中国农业大学蔬菜系 （4）其它 改良品质 抗逆基因（如耐冻 ） 耐贮基因 中国农业大学蔬菜系 项目名称 项目类别 申报单位 申报人 审批号 马铃薯抗青枯 环境释放 中国农业科学院 唐益雄 97A-01-13 病基因工程 生物研究中心 转基因贮藏番茄 商品化生产 华中农业大学 叶志彪 97A-01-15 中试开发研究 转基因抗黄瓜花番 环境释放 北京大学 陈章良 97A-01-17 茄叶病毒（CMV） 转基因抗黄瓜花叶 环境释放 北京大学 陈章良 97A-01-17 病毒（CMV）甜椒 抗环斑病毒番木瓜 田间实验 中国热带农业科学院 郑学勤 97A-01-18 转基因株系大田实验 提高营养品质的 环境释放 北京大学 林忠平 97A-01-20 转基因马铃薯 1997年通过 国家农业基因工程安全评价的园艺植物 2、植物转基因的方法 4 （1）PEG介导的DNA直接吸收法 4 利用PEG(Polyethylen glycol，聚 乙二醇)对原生质体膜的部分溶解性和 粘着性，提高原生质体对外源大分子 的摄取率，使外源DNA、质粒或基因 转入细胞中。 中国农业大学蔬菜系 2、植物转基因的方法 4（2）电激孔法： 4 共同点是膜系统统可逆损伤损伤 ，实验实验 系统统最好是原生质质 体 4 A、电电激法： 4 即用高压压直流电电脉冲，使细细胞发发生可逆性 破裂，使外源基因导导入原生质质体。电电激法使细细 胞膜产产生非对对称性，即电压电压 高的一端被电击电击 穿 ，另一端完整，保证证了电击电击 后细细胞膜仍可恢复 。 中国农业大学蔬菜系 2、植物转基因的方法 4（2）电激孔法： 4 B、基因枪喷枪喷 射法： 4 利用因放电电而加速的金属颗颗粒对细对细 胞 击击孔，做法是首先将钨钨、金等金属微粒与 外源DNA溶液共同保温，使DNA吸附在颗颗粒 的表面，当颗颗粒被加速喷喷射入原生质质体、 细细胞或小组织块时组织块时 ，外源的遗传遗传 物质质随金 属颗颗粒进进入细细胞。 中国农业大学蔬菜系 2、植物转基因的方法 4（2）电激孔法： 4 C、激光微束法。 4 细胞的膜系统由于能吸收一定波长的 激光，而导致某种程度的损伤，使膜发生 可逆性穿孔，穿孔可在10秒种内自动修复 ，这样就可使外源基因导入原生质体。 中国农业大学蔬菜系 2、植物转基因的方法 4（3）直接注射法 4 在显显微镜镜下直接将外源基因注入原生 质质体、小细细胞团团等，或用微量注射器直 接将外源基因注入受精后的子房。前者为为 微量注射，后者称巨量注射。 中国农业大学蔬菜系 2、植物转基因的方法 4（4）花粉管介导导的转转化途径 4 将外源基因与花粉混合再授粉， 或先将外源基因涂在柱头头上，再授粉 ，使外源基因通过过花粉管导导入子房与 卵细细胞结结合。 中国农业大学蔬菜系 2、植物转基因的方法 4（5）脂质质体介导导的转转化法 4 脂质质体是人工构造的由磷脂组组成的双层层膜结结 构，并将外源基因包在膜中间间，而避免DNA酶的作 用，它与原生质质体共培养，通过过膜间间的作用将脂 质质体中的外源基因导导入原生质质体。 中国农业大学蔬菜系 2、植物转基因的方法 4（6）改造过过的病毒载载体转转化系统统 4 植物病毒侵入植物体内可自主的复制 ，因此也可用病毒作载载体。主要用改造的 CaMV(花椰菜花叶病毒)，先将外源基因接 到CaMV上再转转入植物体中。 中国农业大学蔬菜系 2、植物转基因的方法 4（7）Ti质质粒（或Ri质质粒）为为 载载体的转转化系统统 4 这这是目前应应用较较多，下 面举列讲讲授过程。 中国农业大学蔬菜系 3、Ti质粒为载体的转化系统 4 （1）结构和原理 4根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)： Ti质粒(Tumor inducing plasmid) 4 4发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)： Ri质粒（Root induing plasmid） 4 Ti质粒产生冠瘿碱(Opine) 4 它有二种：胭脂碱(Nopaline) 4 章鱼碱(Octopine) 中国农业大学蔬菜系 3、Ti质粒为载体的转化系统 4（1）结构和原理 4 A、野生型基本构造 4 Vir致病区 4 OD转化驱动子序列 4 LB R RB左边界序列 4 左边界序列 25bp 4 25bp 4 T-DNA 转移DNA片段 3、Ti质粒为载体的转化系统 4 （1）结构和原理 4 B、改造后的Ti质粒(以含CMV外壳蛋白基因的一元式为例) 4 Vir致病区 4 Spc/Str（抗链霉素） 4 4 4 LB RB 4 nos-3 CMVcp 35s nos NPT 4 end 插入基因 Promater 抗Km（标记基因） 4 转录终 (目的基因)（启动子） 胭脂碱合成酶基因（Nopaline Sythase) 4 子因子 （报告基因） 4 （T-DNA） 3、Ti质粒为载体的转化系统 4（2）转化植物 叶片、子叶、根、茎、原生质质体和农农杆菌共培养 细细菌附着在细细胞上 （酚类类化合物可促进进附着，所以必须须要有伤伤口，才能促进进附着） 农农杆菌感染植物细细胞 （将t-DNA转入受体植物） 去除农农杆菌，并将植物组织组织 或细细胞培养再生出完整植株 转基因植株的鉴定 3、Ti质粒为载体的转化系统 4（2）转化植物 4 4 据大多数报报道认为认为 ，农农杆菌对对双子叶 植物效果较较好，而对单对单 子叶植物效果较较差 ，其原因可能是与单单子叶植物缺少酚类类化 合物有关。 4 目前在单单子叶植物上也有成功的报报道 ，常在转转化时时加入酚类类化合物。 中国农业大学蔬菜系 3、Ti质粒为载体的转化系统 4（3）Ti质粒转化系统（叶盘法(Leaf disc)为例说明 无菌外植体(如子叶等) 1mlLBKm 加入一菌落 28暗培养12-24t 120转/分 叶 盘 暗培养12-24t LBKm 28120转/分 稀释40倍 共培养一定时间 无菌虑纸吸干 黑暗下预培养2天 选择性培养基上培养 选择性培养基上再生完整植株 3、Ti质粒为载体的转化系统 4（3）Ti质粒转化系统 再生株的鉴定 定性鉴定 DNA杂交法 蛋白质表达产物检测 (胭脂碱,Nopaline) (Southern Blot) (Western Blot) 是否表达(用纸电泳) 要有分子探针 3、Ti质粒为载体的转化系统 4 影响转化效果的因素（重演性差原因）： 4 农农杆菌不同菌系对对不同作物敏感性不同，即侵染能力 差异很大； 4 外植体的类类型、年龄龄、部位(酚类类化合物多少有关。如辣椒上 子叶较为较为 幼嫩的为为好，叶柄或叶脉处处更易转转化)； 4 菌的浓浓度(变变化很大，一般不低于106 个/ml均有效) 4 共培养时间时间 (5分种-2天)； 4 加入酚类类化合物、悬悬浮培养细细胞； 4 高糖、高pH、高Ca+ 等影响 材料的准备 预处理 (如预培养或低温煅练) 将材料装入试管，插入冰浴中(0) 加入0预冷的冰冻保护剂聚乙二醇、二甲基(DMSO)、甘油、氨基酸等 在0放置30-45分种 慢速(1/min)降温到-30- -40停留2小时 液氮(-196) 37-40水浴中快速化冻 TTC法检测 再培养 细胞活力 观测 恢复生 生长量 存活率 植株再生 遗传性分析 长速度 （九）种质资源的保存 1、超低温保存的意义 2、操作过程(简述） 应用： 分子标记遗传图谱的建立及基因定位 亲缘关系和遗传多样性研究 分子标记辅助选择 品种纯度鉴定 中国农业大学蔬菜系 十、分子标记辅助育种 结束 第二部分 蔬菜育种技术的变化 分子标记辅助育种 正在发挥越来越重要的作用！ 90 遗传标记(genetic marker)：可以稳定遗传的、易于识别的特 殊遗传多态性形式。 经典遗传学指等位基因的变异(差异) 。 现代遗传学指基因组中任何座位上的相对差异 或者是DNA序列的差异。 一、 遗传标记的基本类型 遗传标记的概念： 91 1. 形态标记 (morphological marker)： 能够用肉眼明确观测的一类外观 特征性状。广义上包 括色素、生理特性、生殖（育性）特性、抗性等。 优点：简单直观、经济方便、容易观察记载等。 缺点：数量少；有些受环境影响 大；有些对植株表型影响大，与 不良性状连锁；在遗传育种中作 用有限等。 92 2. 细胞学标记 (cytological marker)： 细胞学标记是指能明确显示遗传多态性的细胞学特征 。 优点：能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位 ；等。 缺点：数量少；培育细胞学标记材料费时费力；材料 保存难；真正用于遗传育种的少；等。 93 同工酶(isozyme)： 一个以上基因座位编码的酶的不同形式。 等位酶(allozyme)：由一个基因座位的不同等位基因编码的 酶的不同分子形式, 其功能相同但氨基酸序列不同。 3. 生化标记 (biochemical marker) 也称为蛋白质标记，是以基因表达的蛋白质产物为主的 一类遗传标记系统，主要包括种子贮藏蛋白、同工酶等。 94 缺点：数量少；不同酶标记需要不同的显色方法和技术 ；某些酶活性具有发育和组织特异性；同工酶标记局限 于反映基因组编码区的表达信息等。 优点：表现近中性，对植物经济性状一般没有大的不良 影响；直接反映基因产物的差异，受环境影响较小等。 95 4. DNA标记 能反映生物个体或种群 间基因组中某些差异特征的 DNA片段，直接反映基因组 DNA间的差异。 96 分子标记 狭义上: 仅指DNA标记，是基因组中任何座位 上的相对差异或者是DNA序列的差异 。 现在被广泛采纳。 广义上：指可遗传并可检测的DNA序列或蛋白 质，包括生化标记和DNA标记。 97 DNA标记多态性 分子基础示意图 二、DNA标记的类型及优缺点 98 该标记技术是利用限制性内切酶酶解及凝胶电泳分离不 同生物体的DNA分子，然后用经标记的特异DNA探针与之进 行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示DNA的 多态性。 1. 基于DNA-DNA杂交的DNA标记 （2）VNTR标记技术 （1）限制性片段长度多态性( RFLP)标记技术 （3）荧光原位杂交技术（FISH） 99 该技术由Grodzicker等于1974年创立。这种多 态性是由于限制性内切酶酶切位点或位点间DNA区 段发生突变引起的。 （1） 限制性片段长度多态性( RFLP)标记技术 RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism 100 a. 标记的数量几乎是无限的； b. 稳定可靠； c. 共显性，可区分纯合子和杂合子； d.无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制； e. DNA需要量大，检测技术繁杂，信息量少低，难 以用于大规模的育种实践中。 优缺点 101 亲本1 亲本2 F1 F2 共显性 显性 102 a. 标记的数量几乎是无限的； b. 稳定可靠； c. 共显性，可区分纯合子和杂合子； d.无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制； e. DNA需要量大，检测技术繁杂，信息量少低，难 以用于大规模的育种实践中。 优缺点 103 （2）VNTR标记技术(已被后来发展的SSR取代） VNTR = Variable Number of Tandem Repeats 104 染色体原位杂交技术是DNA 探针与染色体上的DNA杂交，并 在染色体上直接进行检测的分子 标记技术。 目前发展最快的是荧光素标 记的原位DNA杂交技术，即荧光 原位杂交技术(Fluorescence In Situ Hybridization, 简称FISH技 术)，是利用与荧光素分子偶联的 单克隆抗体与抗原标记的探针分 子特异性的结合来检测DNA序列 在染色体上的位置。 C. 荧光原位杂交技术 105 染色体原位杂交技术比较简便， 结果直观。但其灵敏度和分辩率很大 程度上依赖于制片技术和观察设备， 一般实验室无法满足需要。 优缺点 106 PCR技术是一种利用酶促反应对特定DNA 片段进行体外扩增的技术，该技术只需非常少 量（通常在纳克级范围内）的DNA样品，在短 时间内以样品DNA为模板合成上亿个拷贝。经 过电泳分离、染色或放射自显影，即可显示出 所扩增的特定DNA区段。 （1）随机引物的PCR标记 （2）特异引物的PCR标记 2. 基于PCR技术的DNA标记 107 特点：所用的引物核苷酸序列是随机的，扩增的DNA区段是 事先未知的，具有随机性和任意性。 （1）随机引物的PCR标记 主要类型: u 随机扩增多态性 DNA （Randomly Amplified Polymorphic DNAs， RAPD） u 简单序列重复区间扩增多态性（Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR） u 随机引物聚合酶链反应指纹法（Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction，AP-PCR） u DNA扩增指纹（DNA Amplification Fingerprinting，DAF） u 随机扩增微卫星多态性（Random Amplified Microsatellite Polymorphism，RAMPO） 等等 108 RAPD基本原理 RAPD标记技术是用一个（有时用两个）随 机引物（一般8-10个碱基）非定点地扩增基因 组DNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段。遗传材 料的基因组DNA如果在特定引物结合区域发生 DNA片段插入、缺失或碱基突变，就有可能导致 引物结合位点的分布发生相应的变化，导致PCR 产物增加、缺少或发生分子量变化。 109 RAPD主要特点 a. 不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息； f. 显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子； c. 技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术； e. 引物价格便宜，成本较低； g. 实验重复性较差，结果可靠性较低。 b. DNA样品需要量少，对DNA质量要求不高； d. 没有种属的特异性，一套引物可用于不同生物的基因组分析； 110 u 简单重复序列 (Simple Sequence Repeat, SSR) u 序列特异性扩增区 (Sequence Characterized Amplified Regions, SCAR) u 序列标签位点 (Sequence-tagged Site, STS) u 抗病基因类似序列 (Resistance Gene Analog, RGA) u 单引物扩增反应 (Single Primer Amplification Reaction, SPAR) 等等 特异引物PCR标记所用的引物是针对已知序列的DNA区段 而设计的，具有特定核苷酸序列。 （2）特异引物的PCR标记 111 SSR标记的基本原理 SSR的基本重复单元是由几 个核苷酸组成的，重复次数一般 为1050。同一类微卫星DNA可 分布在基因组的不同位置上。由 于基本单元重复次数的不同，而 形成SSR座位的多态性。但每个 SSR座位两侧的DNA序列一般是 相对保守的单拷贝序列，因此可 根据两侧序列设计一对特异引物 来扩增SSR序列 112 d. 由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息， 因此其开发有一定困难，费用也较高。 a. 具有较多的等位性变异；数量丰富，广泛分布于整个 基因组； b. 共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子； c. 操作简便，实验重复性好，结果可靠； SSR标记的优缺点 113 以限制性酶切和PCR技术为基础、将两种技术有机 结合的DNA标记,主要有两种: （1）扩增片段长度多态性 (Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP) （2）酶切扩增多态性序列 (Cleaved Am