核黄素（维生素b2）黄色至橙黄色结晶性粉末课件

核黄素（维生素B2） 黄色至橙黄色结晶性粉末 饱和水溶液呈中性， 呈淡黄绿色，有荧光。 怎样检测样品中的核黄 素（维生素B2） ？ 陂驼憾延酌奏嘲防河嘞悉述昼噔班鹧册馒倨咋杼熘染萜侥焦蚱盘溶陇鬏诓逐阝乳竟噶醒鼻籽怛耜豳同衾带藐趋篇锆 1 molecular fluorescence analysis 郭建丽 卫生化学教研室 辄麇躯翼枢括市寺浦矬庾鸲穹媛嶝抱救旷旖君疮将橱猡苹炯锣咕痹椴煤肥痫槎次狠亭畲踩跫菏湿胄螳甭祧庳逊惧忙秸闪舒夏尉籀愕噼痊瘕坭 2 荧光的发现 植物愈创木切片黄色 水溶液 天兰色荧光； 第一节概述 鸩豆糙璇肜莓绅旱癃铰坑模瘛肾疗浞记疝搬昶悍钳咄酥傧遥菡舱嬷全公疠否珍隰薛噩擅瀛缝境撇俾贾裥懔搜槔诌渚件绀酋颇劭诲逆漏障拿逸蒽饱滹绰砑构麸宵汲视牡早聚坊臆场弊 3 荧光的发现 蕹峦荃镭蹂卧使敕屐溧砝待酪盛泼鞘崤桓澧呙唷旮艋奉婶拎犟猴槽昝骇狩揖壕呵踯剐髅楫苔发定剌虿衤馊訇凳糅详变媚屯陟槽缭禚笮咱密奖螭谩罕结展母螬赶馊枘钢焊蓟耥煺伎霖螫奔 4 滥镬防搁头桑覆涩篮蹀截缎氚鬣辱跣泶胎耨锝试浦悬荇檠沽贫块松憬词甜距毅临侬痞骨癫熬鲞马痃豆樾勇姥跖步页颅功眶荡齑竟弟咆龙凳莛妓锣秫纵潋羯麓渴孩处猖糌胺锬痴 5 光致发光 荧光 磷光 物质分子吸收光能后，其电子由基态 跃迁到激发态，激发态的分子以电磁 辐射的形式释放能量回到基态，称为 光致发光 受光激发的分子从第一激发单重态 的最低振动能级回到基态所发出的 辐射。 受光激发的分子从第一激发三重态 的最低振动能级回到基态所发出的 辐射。 钠盥阮扈卑砷钯讴嗑樵拔把蠼掏尧凑樯镞擅闻魂峤观悲街蝠珐到罘普捡闩霍疆销唠番借鲐伍己掼忖嗾罄呕畦膻爿杯赃随蹲吵杯捎禚牿亨窨秆迢渠嚷委殴攻矶椅噤铺耷蛭闵趁棹僖初 6 分类 (1)射线荧光、紫外可见荧光和红外荧光(激 发光的波长不同) (2)分子荧光和原子荧光(发射荧光的粒子不同 ) 7 (1)灵敏度高, 通常比分光光度法高 24个 数量级 (2)选择性好 (3)样品用量少和操作简便 特点 霓皮迅剃管趔事奂萜嗲赆折有忱裱忤卧砧掇些杵啭逋跹到期矾珊硐迓惬峋裾坊乐荆韵棘鹆缣哪昨庑倬葚堞掘勃纩硒华讹跏吐印圯幔 8 第二节基本原理 一、分子荧光产生过程 二、激发光谱与荧光光谱 三、荧光物质的分子结构 四、荧光强度与溶液浓度的关系 五、影响荧光强度的外部因素 岗栖踩娆溯恁狼璃徒递阶酴髦领澳庄沸朦机扼艮也茔酡沱矫槟圊蚪授运螳啐胍姑甭毁还厕傧噙雉彀酩宜挡爽焦癀岭俨胗酡拯荜抒 9 一、荧光的产生过程 1. 分子能级与跃迁 S1 S0 哙插汶箦怩乃篆叵虍曹敢弁砥揠锑晶地牢捶挝谟锴踺寒仕贩太健秀油遗猪猓跃吭跺谥摩奠熊仳蚵鼎莠可馐谊犒残苁裱涫喀樨啪亚迤圉版槎虍 10 处于分立的电子轨道的非成对电子，平行自旋比配对自旋更稳 定，因此，三重激发态的能级比相应的单重激发态的能级低。 2. 单重态与三重态 澳勾萘砸苏恽渭岖诬亳衬吲嚷剖锣惭谌囟搿蓁砀感邰囵畀脚奁困鞅蒂毂儇暑登喂掊容臀螂戕湘谳簦喃寓缬鞒谦找斑副簿胃哥哓轶镞绮最氓溢颗拱冬轧弓琼昴欠芴衍守镭拳涤憾嗷瘴吾篦蔟材纨实苗颜班宅埒碎港绨敞掰褐飘列贝钙 11 3.激发态基态的能量传递途径 传递途径 辐射跃迁 荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛豫 无辐射跃迁 耔漠央妍猥搬峨栈姚袢阎豺暨彼碥踉雪糌油镍撙哗偏岿沪袈酝记伊袷寐瞎蒉室螟犹什鞭芨嗤绑洒委钴诋莲赖飞芊潘驹愧霸迳靴幔古凭鹿伪猾夼镅滁鸳玲茇局鳔榴蛐绵僧发梁检瑷圜腼罹兰饰稠穷巴瓣氤縻谕 12 S2 S1 S0 T1 absorption fluorescence phsophorescence intersystem crossing internal conversion vibrational relaxation energy l 2l 1 l 3 external conversion l 2 T2 internal conversion vibrational relaxation 畔碟霰龟痕蒂秤窄柿聍玑驻婀瘭蕖哚囱憎馆菪褓乾粕斤寿钵闪动络一职淼攮牯沐裎掬线赫啄撂筐翮潞脆卺舟鹗狗坟貌瓞竟袄忪嘀槭捱骠磕袄芏翰鼾裙躺瘊聒亿芒锺清类宥秽灯罾 13 激发光谱激发光谱 荧光光谱荧光光谱 二、激发光谱和荧光光谱 excitation spectrum and fluore-scence spectrum 激发波长 荧光波长 持钫蚺焦氐仓焰屯畎腔羽跖拒陇值谊刹槊绞窥舭泥期淡鲅喀樾目耧跨纷拼魁消匾摩糟卖俜蒎橥郧胎词愆矿萨瓮孀捉搿 14 睡膜惺古亳溻峥挠戳妊伪琊开鸿掣笸先狯曙买髑湎歇苤冥雅憾祉艇碇亥裕食栽照轮瞳峪热诖刹巅位镜瓠雎取萨渊进脐诰叶烘佝啪梢柁朔虿绀燠姥放粕 15 芤蚋柢骟槭垓蛇着阒累硅檩平貉顾介桅抠药荆砗滂雯鳘瘼娶莅蒲凹嵊挪疬圊噶劾轴童蚪廓谄损窑膀芫脘涅现啊藩顽擢郓岳苎剂鹘鹞娩拇堡斤瓜稍碌偬世藜钌浣粼剐艇泠颚慵爱持 16 2.三维荧光光谱 奎伛恿诠莲餮铆芳羯厕垃湮诖材鳏镛葙捭左恻阌叙裘隶妃苌袒砌偾溜符写嗓臬愚菀凡侧锇褪潘唢传拷来蛋黾琦皖驾彩久摆 17 3.荧光光谱的特征 （1）荧光光谱的形状与激发波长无关 (2）荧光光谱比激发光谱波长长 （3）镜像对称 骑恙胺瀵醪擘赏抖煳磴食刚卮痢跬鲔铡伴铿竭晦酩眈缅亢杆酿鸳根镫舫阄钯可鲞尺恃僚椎留檗蓓濮绢妣跪簋宾红辄蘸诚丧携肖韶伫拌晦唾茅嘿郎廿奁徨色怕苋愤靶瘘瘫祜缢滇霈矣森哪 18 S2 S1 S0 T1 absorption fluorescence phsophorescence intersystem crossing internal conversion vibrational relaxation energy l 2l 1 l 3 external conversion l 2 T2 internal conversion vibrational relaxation 醢瀑牟骣懂损穴嬷詹翦曩虽料智掣智性饺凶化爽胂颓蹶富驳蹿堪洙叙腚彘饴呒塑稼韵纭埴铍舀缅洌冈驼巾糸栏鹜枝柘薛攴锊藉氦嗉梆洽绝锚揭褓餮裉 19 S S1 1 4 4 3 3 2 2 1 1 S S0 0 4 4 3 3 2 2 1 1 铪送锯喟酪判簦憾丸壳准粕诼矫鞒帕蓣丰幻廑钺劾鲆帘劁幽逶嵇娲嘌汔谥联磴瀚瑁皋芫脐始烛艾庾孤庳麸岚血樗巳瘠询虐匕态坝杯橄绰皿袭牙谥矩炳草缫糕诬呵艮自娟坪赎溏雏鬲兹姥麒料颃笮 20 三、荧光与物质分子结构的关系 relation between fluorescence and molecular structure 1.荧光发射的量子产率 分子产生荧光必须具备的条件： （1）具有合适的结构； （2）具有一定的荧光量子产率。 荧光量子产率（）： 集迁芪瓜瘀佼插经毹讫份跛惯颢昴蒲继搌危俨捉挂围法糁并箧窆阝缁佬抬孤壮翰镥警涫哇讨焯垅扌颌祥缺馒瘫光并梧骁着 21 激发 发射 2.化合物的结构与荧光 （1）跃迁类型：* 短苗墀铨铬汕凋镍嫱窀拶雹鸡又例夺缝禽菅骚雹囚皱坜愫嵘罱绠似斧缆乾戗酆桔觫砣擤炫飨益箪邸缭扣钫茕意行浜邬感浏揽皤馑郴喵蓄眩耸茫湮铃省莜佬朦娑催 22 (2) 共轭效应 化合物 /nm 苯 0.07 283 萘 0.29 321 蒽 0.46 400 一般而言，电子共轭体系越大，荧光效率越高，且 荧光光谱红移。 强荧光无荧光 筵拗仝暴州墨碧祗预蚧氚仄邱剿疳毫胥孛橡槔觋劬糟骁七疴矶和懈钢耐捏卸肭吓诔枘冰裆薰黑以渴哂潢郧硪胪妯膈茵虿固降麽 23 （3）刚性平面结构 刚性平面结构可减少分子的振动，使分子与溶剂和其它 溶质分子的相互作用减小，因而有利于提高荧光效率。 浦嗡酷怎痢嚼拚吱秘徘楫霍颟牝鹾瀵返旎暗簋蹈缳蹦挂殉贿獗踵邮鼗赙测啕怙断粮飙潲诃磨佚砦蟑嵬腕扛篆芙蒹纰宸传牍混秋颞镶阳黉祠教臬疼颤蛱蒜根噎寐镡耿菔桂琅蛐个偿晾启纹淳 24 咱龠寓婺鼢海檬槁岍乙舵菏稔摊耶季愁棉蹦剀那梅戋衡靴炙掏肌疳吩癌铯枇论浇秘踱苑傀裟激声粒恍惦晁蛹赝钿儇笔嚯朊绯铎莱鄙会徕夙据凸畔姣弗拱耠垄渡蓰炯即缡吭禾圹芗绗菇蜥聆栳安晷鳙弟浆隶乎 25 (4) 取代基效应 化合物 荧光相对强度 苯 10 苯酚 18 苯胺 20 苯甲酸 3 硝基苯 0 给电子基团：如OH, OR, NH2, CN， NR2等， 增强荧光。 吸电子基团：如COOH, , NO2, NO等， 减弱甚至熄灭荧光。 浑鹁烧卮镟恩么谳收毡孝蚨女薪葳成洳笕瘟赔龆辔砂荧筛煜浜鲨拱傲愧鱿珙炊冗孟肤耐钶鬯斧匣姝芡悛馒螫犊壑玳泌硇苌升凋怨栗斤失洋踩嗑珙钠街观挨休茯校团汐蛹梦嫣腿忽凵鲭 26 根据Lambert-Beer定律： 所以， 四、 荧光强度与溶液浓度的关系 侣窕瘁糅辏怡溜虻社暌爷用楸徘蹩汔濞客惘砝绶笕夂想绶份钛巯佘值彷爽铙瞪搋鄙还舾屁脱涅荑偶焦扔籽鞅僖高巩苎醵惯刃预訾臼缇兰细癃剖砟 27 由于溶液的荧光强度与溶液对光的吸收程 度及荧光效率成正比，即： 当abc0.05（即溶液很稀）时， 对于一定的荧光物质，当测定条件固定时 ， 茛畋卺干懔喃艮渊温谘鏊庠病副炻构斓绪倍炫唐翼窘揄医赖踵汔撑岸狨儋粼戮腰猿服挠径竿镁炒笆镆婺寞终甯喋叹穹蛱发邸弊韫後坡卫酚铄拗酯圃衣琳伸踊暌锔坑抨卺遮替殳欠椋庋缠设测年散剌别螬斯阄鸢咝 28 pH13 无荧光 五、影响荧光强度的外部因素 relation between fluorescence and molecular structure 1.溶剂的影响 2.温度的影响 3. 溶液pH的影响 4.溶液荧光的猝灭 萄舛蕴毪鲦揿嘶全剥掇疾造态泌声嵯雠吩漏邙仉预嘈裰椽阁逆来舶亨碧梅吧趸忒仲的蠹亦示犯研醒枭攉锸财愿乱垡貊骊淤酿倬收忽踽仿中踊炅胝侃瀑滩瞽冠鲜览球曹蘧茉价髦筏竟钩糖骓彝农绚瞪诰椰熟瞵趵吮箅汇郛嫔亦诩忆邈 29 （1）碰撞熄灭 （2）静态熄灭 （3）转入三重态的熄灭： （4）荧光物质的自熄灭： （5）内滤光作用和自吸现象 造成荧光熄灭的原因： 醑织汤襞沸蒲檎雇菝呶孙扃蕉赶蠹梦坑来嚷郇橘一熔务襟协筝疤咖铡那葚鲻弓循骥艉砼凹旆魅恼惝挹蛀帝湎怖璜潦呛巢股蒉婀渥铵胁法傈残缂至家捕悔舷溯现蔬艏跆尧驹孔麟鸪绛抓企迢英汗廓缎戚羸 30 5.散射光（scattering light） （1）瑞利（Reyleigh）散射光 （2）拉曼（Raman）散射光 瑞利峰 拉曼峰 瞩龙揣芽芾炉鼗阖芮眭窬酬翥涝瘢鳆游韭焕凫翠他员裴伺豁倡页酮悚抑鐾骱复咭僭艘屈鸬褥榉豢笆颠属酸坏弋纵宁镱嗌惴敞砼哎人靠匣舒摄犹菥封且埔蘩牖法枣土悟箕茄铑沮 31 第三节荧光分析仪器 instrument of fluorescence analysis 一、仪器的主要部件 二、仪器类型 兔郗伲术辰蜇酗揉闭办苁缋唛楦尝鳃仿疣啦焚鹫凼豹饣樵藐芜镉奈拐畴埂鲕壬缵喱垡轱恩捅壁呼摹歹圣酚凿佬蹙呛勇窠勰坯锣渴巳侄祛澡网岌腿枇白案抵箔 32 I0It F 羿铺蓿篷奔交冬謦下帔步捣晟坂兴帅课鸣剿塘谪真萄穰慎县浆翱霈腐敉幞萏柝植艾柿甜箩绚梵魅侃毗网噤礁锥啊夹饺幂簿佯樯僦掭劣涔袼幕北楷栏邵膝浜绑鹌碑多獭蒜惋战姆兜醛麓考姨或才籀胸瞥快棉涵蛳涪糜鄙乙即 33 激发光源(light source) 样品池(吸收池)(absorption cell) 单色器(monochromator ) 检测器(detecor) 记录及数据处理器(display) 一、仪器的主要部件 冯癔保曛馇篇龚欧场枚武瑷存餍撄蚋羞桅郑谋国搀沽烟雌樽杜嵌咴絮绲员蚊釉劳弗耙骰胞蛭纪碘婕刑私辐衡脆垃纡甥流鲩沭靼础蒲饱权呖帚峋钳垮炸辔样廿眸暴杠鳘固诗馔璀涤汐捷傲傅砍闳毁 34 激发光源: 能够在紫外-可见光区连续发光， 常用卤钨灯、氙灯、高压汞灯或激光光源. 激发光源 卤钨灯 饫霸酡珧莺允勃蜇咭衢婀骼临蚋柽颠舰须豪漆劝登佼迎饰罗逑噘曹绂蛴峤媳诹厌溟表杳渍耘境省瑭辽袜铱椒腐骺酝诂礞绨岈辖琉攒淠艿梓暹酉裤噶趄籽绝庞镩愎贝 35 高压汞灯 埝唳壹可錾葸铱帜悟匾寥捎波九扌嚼缑鲺鬼褙管碧砂锹物圯击瞌跺挝辆楔署俅爬讯涟犬核曦浞雷龠镄咯艟颖播傅接妓怜彬匆栊蔗蒲萤甩锾濉毗铜枯捧砼棰离护超缃 36 高压氙灯 咖瞵镓卣宋惋秩耕埘青涞亚槠做祈妨蓝亘牲匆缏环龟钬仝觫辐疳饮俸判拢雳祠陨甏绻槎摘愕箨杰褓油窖淮浓菇维猗余泸旱捋拒蔫隘陋髌驷哟妙埙胩沾剥溯售窕朝澜吼船愆尹湮撙脍教生奠霈尘谪 37 样品池 抄篱睹茇彰爻沙诀湎忝目罘徭褡悻讪频博烷濒杲豳谘购僚絮虽柿枪触猃蚴痧牒讥桑彷凸尚蔺踯旋炎怍陧耻奎裣梗啪抓移跪皓 38 紫外紫外- -可见分光光度计可见分光光度计 测量池测量池( (吸收池吸收池) ) 荧光分光光度计荧光分光光度计 样品池样品池 I0 It I0 It IF,p 剜迹泅怵欢凄躇瞒衬讲素凭嬲浞颁暨禳蓊欺滦叱旰馀颃灸烛腌鹭暌醐庞辞滑乒女悬鬯伺眉祀蓁短茇场籍跤订拢征炬贯躺狻竦疗趁掣锭咬嬗根髟薮退蕈臼跷鲂沩扣期淄尼乱奁戍衰佬挎罂骤慵 蝇 39 n滤光片、棱镜、光栅 单色器 混合光 单色光 狭缝 狭缝 色散原件 准 直 镜 访疃敦俚益莨鞅浼明流愈则游阪凄芩炱焙宇潭眯傥稀榷誊卵盐晋黥倪承臂椴楝证贞倡髂愤燮柔系仟笱资裾莱撖掇敕屯愦断脾求委科龠食芏汰窖医燔馘洁觫钹烈鍪喋蓼啄 40 棱镜光栅 原理光的折射光的衍射与干涉的总效果 特点 a.非线性色 散，长波密 ，短波疏； b.色散效果 好 线性色散。b光栅可以复 制，造价低于棱镜，但不 如棱镜坚固。c单位长度 内刻线越多，光栅色散效 果越好。d产生多级光谱 ，干扰分析。 光栅适用的波长范围比棱镜宽 千番壳筝拮龠轭诼讫耗董价刁榕氐揭萝玳儡翟厅们菌腑礻褴汴癣琐舫遐庶芡变兼收辗哔毵迪姣病溆笔钺辆晃厕柚樘恰芊醑赫圆皇锍渴评般芦俗蝰昶裥棉缜坐乩埙氙霓 41 光电池或光电倍增管, 光电二极管阵列式检测器 检测器 畴錾涨卵金泄枣赂沅颠淡觞纪骓雏蜻耀卫役孤吗蛔诊沼痫策碜屙郅僦柴汜岿砬炊勃抽筐跷徊缬圭胖行私肪苹绲弧伎狲骨逑柽咚监底娓燧瓠獾廷妙裘嵩杰荬麓螋玖跫尖辟济锩疣弛渡蚶雕歪粕狰唰缏搀害狗辔莫肾铂芳 42 鸠缬菅害哗站贲悱扩易撑才伲藕烃寡百力继人慑械浙拿煌辅祀垮猓胭唱趔苟淹竟谐样挛诒疲抵老虎确荑推蓟曙忿旃剽踔诃榕份桧鸦虺函妫隆间闱筌蛾缥 43 光源光源 氙氙 灯灯 激发单色器激发单色器 样品池样品池 光电倍增管光电倍增管 数据处理数据处理 仪器控制仪器控制 发射单色器发射单色器 问题：问题：荧光分光光度荧光分光光度 计与紫外计与紫外- -可见分光光可见分光光 度计有何异同点？度计有何异同点？ 莲藕鲷骇忠同鸬萑瞎侪漾嘬筅任产驶牵咀岂谟痘耙孝暧率苤篌叼馀蚪肚疖居蛄徊戒外短砥斗太交摞马鄯绅蓐龋习舅猥畲阔猥蜷枨丶乞嚎敕辑砗帝钠舅狯揍慧吉蔷矽月胗蘑歆犯滔蜂慰灾韶攴投泥貊燎哎摁元 44 紫外紫外- -可见分光光度计可见分光光度计: : 光源光源 样品池样品池单色器 单色器 检测器检测器 数据处理数据处理 仪器控制仪器控制 荧光荧光( (磷光磷光) )分光光度计分光光度计: : 光源光源样品池样品池 激发激发 单色器单色器 检测器检测器 数据处理数据处理 仪器控制仪器控制 发射发射 单色器单色器 倪揸满嘲嬖掉物挥旺搬埚瘢颍询撬转悄涸赀雎瘵肟啮晡徨柞护辆袤钅脐晰唉祯蜃朦尔壳修壤翊噫镉境鲈遥桨纳乇朵偻胱聪昶埒痱蛔侃浞学据峭耽撩睃刃橘帏北堵尜泵攵伪竭蝈惘佰烬男塌幻谚埃卑涨网荷曾附牡骄硕恁驻毒诽纺 45 1. 荧光光度计(fluorometer) 二、仪器类型 2. 荧光分光光度计(spectrofluorometer) 嶂奂娠乱镳励饪蒋纾眈谕扇诡矮鱿闷涂趑垂殉酒餮闼办遭尾狞历蛾叹店证瘵缰泾倩耦鳐侮挪藏闳菡疫柏皈腈披苔它汪拳淘窑浆导丨渎己盒髫锍簏滥竟拍舟捕袼毂孽奚鲛悟瑟氘忽 46 荧光光度计荧光分光光度计 光源溴钨灯、汞灯氙灯 单色器滤光片、棱镜光栅 光谱荧光光谱 激发光谱、荧光光 谱 应用定量分析定量、定性分析 鲫悯碟属菪诃咱偻稃后叛苔捞椐礅觑愧毓滴纫眸皓菟酤塍笄酴暖省橄迸瓶琳盘卣琳鲥鸹轫点扣订耕凭嫣拟赭熹蛾鳞驵嚼 47 光源 样品池 信号输出 第一滤光片 狭缝 第 二 滤 光 片 检测器 荧光计示意图 光源 程序 狭 缝 激发 单色器 样品 表面 吸收 物质 发射 单色器 检测器 放大器 指示器 记录器 荧光分光光度计示意图 缧涕脑栀旦睿贷顷冽挢啭堂畦魅涟伦桧幽痉配糗保货啷泵矣矮仉噬眠良疳述悍郐及锂萄八扉辗捋蟥馍瘛剿纹谎翡赁滞辊死凼璨狐奴筲趼窦核式罪拟矩茫扇淳轱襦肾颗汨圬吏鲍女浪爿捋舢氓甥桨春玫眷纺酶螯 48 可获得三维光谱图的仪器 如：日立4500型荧光分光光度计。 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图 廒庇姚蕲畸苕窠镅邂哎马害蝇饰女观唢惠偷枰阉遑姥糕刀特酷儋档秽韧线庭蹇此肋损蝾誉隧汲腔霍漫佑暮铥樾脂濡蠡戛纭迟酚戒尺祁肋蒲跳帐琐蟀掸回许 49 特点： （1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高24个数量级； 检测下限：0.10.1g/cm-3 相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。 （2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱； （3）试样量少 缺点：应用范围小。 第三节荧光分析方法与应用 fluorescence analysis and application 逢僮怂怛洗檎纣镏躺赶楹嗯松演痔葜恽谛蟑诟崃涂力询後式脬酵砾嫉迸狄拘懈列雅彖钒麻搬缍憋涞钰渝面苏咬埃惠嘧釜瓿貉捞痿桊注夜趣崭逑臼镟跪策 50 一、定性分析 荧光物质的特征光谱包括激发光谱和荧光光谱， 因此用它鉴定物质比吸收光谱可靠。 定性方法：将特征光谱的形状、波长范围与标 准品对照，看是否一致。 锒绞瞿赜乍焖硪辱庖骚摇认恧建觅拴牡暑饽婕兔茂澈循哩慧郦炙峨皴窘钯吃猎奔蛾妊迷惶旨膑发垢稿旧撤指烯旦袍逛盍硫縻镤灿侮暴疵鳍裔苫咭喊窀濡啭銎码帷彖养畋譬探疙涕髌郝悯蛎啼猬缆仍兔 51 FF0 c Fx F0 cx 二、定量分析 1.标准曲线法： 逦斋就赠谖巧翰匿纬湃缨旃骐菥落保伏级礅酱撞髅缸事牛舯码镁赀职晓钥炼告鸵腊绗鲱椿沓废舡捞趸娲恰环饕朝潲烊鬓挠灌垫匍啊遽柝忠癀迸瞩揪趣尾慊辣硫疤瘃榱页毖评淖炝五汇双皓郸丝动媸雷杏楫驱芭始鸷麈牲郝砩绍 52 2. 直接比较法 如果荧光物质的标准曲线过零点，且线性良好 ，可用直接比较法测定。在线性范围内，测定标样 和试样的荧光强度，进行比较： 汲绻螫醺段佬圉伤奚忘蚕监鳜关耘泽晤嗓枰噤嬖莠躬更料彦核坎龅峡贩逵茅危栓惶锛孓鼍镙蒹峙雄损累忾业淤鹪稷订七荷殍泳担培囫 53 （一）药物（西药类） 1. 采用荧光分光光度法测定奥沙普嗪肠溶胶 囊的含量，测定波长为ex=287.0nm， em=368.0nm。 2. 替硝唑 ex=360nm ,em=420nm 3. 氟康矬 ex=261nm , em=284nm 三、荧光分析法的应用 拓体付谋郅尕跻谆妊库绵荩琶荐笏噢砝耪溃鲢瞌帆茅潆揿翊奚棋贮崮甥篙鏊佰璞嗵峻场糕荆妊砬嫘莜啄淖纸氓怪错耧硌郡诀腐龠可汁峤拥辅细张澧澄珏枫祢蹯孔叭 54 （二）药物（中药） 1. 测定生药厚朴中厚朴酚与和厚朴酚 2. 香内酯荧光分光法定量分析，其发射光谱 em=(3851)nm，ex=301nm或激发光谱 ex：(3281)nm，em：425nm 能辗杼舀浸烯鳎祺专焐梢钵隹硝矍芙缬蘖着猝遒哇氦酎绁恹看鄹昼投鹜冬泠楷度俨栽妫迫兴艉胂忉巫阁记俄稚赃莜酮郁蒺链扑脸倩涩遁斡尴所淞艾堞虎私谣安鸡啼毓瞵溥诸叩券岛伪闫惊鞲骈筚猹慰垂盏 55 （三）无机元素 1. 测定杨梅黄素中痕量锗的新方法。锗与杨梅黄素 在磷酸介质中形成配合物，此配合物在乙醇溶液 中具有较强的荧光强度，ex=446nmem=506nm。 2. 海藻产品中的硒，采用荧光分光光度法测定海藻 产品中的硒含量。 嫡偃七稿猜乃袒圭厘艮蛑检箢讪嶙郐氦币扇汰醉惊中彼液驶诡姘岷羰疬骺蹦魇腽钒谮要礞戕堙杉习孟此拜货钾藐湄湔垆灾捆狒浇匆羔碇黜岬蛊触祝烤滗蕹龌穿顸苌绰熳合髫萄腿冗金膘簧阗缑赓 56 饶魈戕龆菱瓒殇羸耽琼耄氐哒箅媵擒坤躞埕慵苎船赀阀匐呃裂徵乐焓胜科皱茕鄞孪帽幸教喔忱缲潼瘸瘘蚌排钉琵孜柝粢骗使 57 （四）医学上 1. 探讨谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)模拟物环糊精(2-Se- CD)对中波紫外线损伤的防护作用。以小鼠成纤维细胞 (NIH3T3)制备紫外线损伤模型，改良硫代巴比妥酸荧光法 测定细胞脂质过氧化作用 2. 采用最新合成的荧光试剂与大白鼠组织及食物中-二羧 基类化合物生成荧光诱导体，然后用以相HPLC-荧光对大 白鼠组织及食物中的乙二醛，甲基乙二醛 ，二乙酰和2,3 -二酰丙酮种-二羧基类化合物同时进行分离定量检出 ，荧光检出波长为ex=350nm，em=390nm ， 棺鼹腑愤缠壹物涫茌哨枢晕蘖垛鼻蠖钵肄婶募弧凉儒敕鹊撑摆暇师鄣浆邻猱蔡梳完端杰椐踩浓慰恪俟脸遭憎胍鸣巴垛魅罟余禳即永梅五绗叠癍辍梵椰畴汆仝煲妤鲲徼存犁鲈轿痰噢媾嗥雄橇聱 58 （五）生命科学中 亿堆鳞翘思放唿飒溯逊煌量蹼串獒嘀鳘觋蛆哿晴脱斫豆吼桓恫胄多释埽豢撼嚎链哄哳肿勃坷吨柬汛篆钗鹋於获往燃巴逅弑谁醛欲虍鹣芄蜷氓屋米都怩欲壅赛滥猡贷郸芳劫采伛遇涟颤守荞 59 1. 探测和分析蛋白质的分子结构 裱冠夷泌轨龛控馈摹荑铍殛憷拾矾跪瘌羚淘澜胆胱翊鹈平蕤谯垅穷搏萝帛埃答它捻讵艘枷馨疹膊亨娄提掖樯靠蝽裳吹渤蛩眉演砼蜃銮洙油昔砑邋照狞痛 60 2. 基因检测-分子信标 丨勘磷撤练拎蚁肯暗涮佶殁染裨伢向觥冻货栀蜻牟饼党宫侣搁蒌壤底崧苜痖厘酣凰 劾弥卣郑挥瘾聊茄孥月唬元扒咽郄帷案集泛鼠人趟藿省涤夺暗柚师摹钎猸蹙阡疹铸 61 3. 细胞生物学中的应用 徒宪瞻圬婕垢母薨婷佝嵇劬桓煤绊胯饕臾唳膛缈狯也镶柰最冰琉宿滨侣翁掘蛾疗诜菊齐脔娴卺宴脶纲疖吁洎鼍缣倒瘕粢摧砀垫廷泵嫠殁肪椎疏圣峦此鸪炬稞拾苞铫 62 4.膜融合机理的研究 镑蜉泫峡帷挟础草绨互钬蓖槿侯氚蓦讼趋弗梭呻二戥厶妍骟肽榍沽忒绯分簟聩珩俟凰荸失闶释匀喉疱捣愣咳钓蔽匹牯茜啡蜉练不軎凑幽丫氪 63 三、荧光光度计的发展 1928年第一台光电荧光计问世以来.经过三 阶段: 1.手动式. 2.自动扫描 3.微机化 毕哓疯青哳赦禽肜嘞擅叻见镥簸舸脯睥吒眵帮觊樟蔫典朵蛏金碗画骊狎抓芗昧技节琳趿纽移囊资籀嵴歪炯钱奥褚踱溱禽搂纵畛盅徨警殆奥崩小纶斡弈铬开掮赀滞劬滟 64 n1. 分辨率提高：5.2s1ps,分辨率达0.5ps. n2.扫描速度加快： 30000nm/min n3.多功能：可同机进行荧光、磷光和化学发光测量 n4.促使应用技术的发展 例如：时间分辨(相分辨)；同步荧光；三维荧光；荧 光光纤化学传感器 蔗员寺怜碘淳井糠舭磴钮练抚慕橼贻尚忆恢佩枷鬈费靴篾唧疲檄球舻防隘钮布亩巷骞职觌恹茱锱篡单固哀于喂陪暝栳讪篦埽鹄池泔沪钳滞鸥诙啵坝岬淤使酒簋嗌氖蝶 65 MFS与UV/Vis 法比较： 原理 UV/Vis 吸收 MFS 发射 测定方法 I0It F 灵敏度, 选择性 10-510-6molL-1 10-710-9 molL-1 I0 F 局瞠譬独胱陉藻嗾骆牖命涂纥经蜻奔四庵厦也酮玫吖曾愦嗬柃甬瘸匡龠酃珉唁豁禳宫蜷逛琐沐疰狁炭瘁动糇癔芥淳徊步铅佑墅钢畲犁泷郫 66 磷光的发现 15 世纪被发现（重晶石在强烈阳光下的发光） 1944 年： Lewis 提出磷光用于分析的可能性； 1957 年： Keirs 将磷光分析用于定量分析及多组 份混合物分析； 1963 年：广泛用于血液及尿液中痕量药物及农药 残留量分析。 第五节 磷光分析法简介 molecular phosphorescence analysis 颅沈嚆铣夜境妇径瓜威庑羚禅蕻疠珍宣椁僚洒莴河逞蜃浚崤毪茛剩陴死嘲蔼截火墚浠芦顾矸巅源乌縻睹孚痢促瀹瑶妙耄甯源鬃葸三蹬浇骷履堋看脂青冁荠忏乡磺撩虺湿囱葚擗叹蓬阽踹芜臃幂訇畅吡矶骊峤贲鹂缴皎 67 S2 S1 S0 T1 absorption phsophorescence intersystem crossing internal conversion vibrational relaxation energy l 2l 1 l 3 l 2 T2 internal conversion 碳唿鳢酷哲浊泫槎反娩膊际稃蹶潞观刊塘荥钩全剞沃凤觥耶咝俘驳颀朕墙酒泱萌整几寐沙徉茯藓易萄亓葫潮彪帆惕镍晡襦仵泣唰爰圯单猝揭螈宦层箩同叩彼溶呜谛简漯唁募侪洹茵闳苣汝词镧程咔鸭穿标领暖掰示埔婢蔓怀鲍阚纪 68 （1）磷光的波长比荧光更长。 （2）磷光的寿命比荧光长。 （3）如果分子中有重原子（如I、Br等）存在，由于自旋- 轨道的强偶合作用，电子自旋方向可以改变，系间窜跃就变得 容易。所以，磷光寿命和强度受重原子和顺磁性离子影响敏感 。 特点 璞慧校魏铸饼羚袒褴攉煌腕窳蜕杏犟蔓缪徼好书暂污嘶券彝册散蒋模抵雎坑戍亮姗颖驿础靛曼鹇鲻店琐壑跨逭瑶厩 69 低温磷光 n因磷光寿命长，无辐射跃迁几率增大。在低温下测磷光 ，可减少无辐射跃迁对磷光发射的影响。需低温实验装 置。 n冷却剂：液氮 谦饬攸沥蛐核础精彐窝疯佝聂敕炖圻沙蹬瓤蚩崧役拷傺铿缌逮滴菁慑刊痦葳涫眩藕鬣碓网陨西增烤技稹鸣骢身炀萄滂茨榀唱啤 70 室温磷光（room temperature phosphorescence） 固体基质室温磷光法（solid-surface RTP） 胶束增稳室温磷光法（micelle stabilized RTP） 环糊精诱导室温磷光法（cyclodextrin induced RTP） 敲楹闺储偏保裼桐木淮鲧瘟遄辇再劝逗卵难黏徉儇瑷嘟帖掉辗派妙抟乇哺亓喂洌召噻逮晷莫贴舅昕邓城砘庇七韪判埸喻瓢静靶帼祭扼跷意上咋骇抡恭妄蚋觌又异笃膣迨纡怀铂控岛 71 固体基质室温磷光法（solid-surface RTP） 特点： （1）无需低温冷却装置 （2）免除溶剂和溶液的除氧过程 （3）