药品洁净实验室微生物控制和监测课件

药品洁净实验室微生物控制和监测 概 述 2015版药典参考国家及国外标准制定了统一的标准 参考标准 USP(35)1116药品无菌操作环境的微生物控制和监测指导原则 ISO 14644 洁净室及相关受控环境附录无菌药品生产质量管理规范 GB/T16292-2010 医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游和沉降菌的测试方法 概 述 悬浮粒子数和微生物数控制适用洁净级别控制的实验室。 浮游菌和沉降菌、工作台面和墙壁、表面微生物检测，控制和监测洁 净室微生物污染状况确保药品质量安全及检测结果的准确性。 单向流空气区域、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区） 悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行监测。 GB/T16292-2010 医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌 的测试方法 - 2010版中国药典 检验环境 国际要求:制药洁净环境分级为A级、B级、C级、D级。 A（百级）、B（千级）、C（万级）、D（十万级） 2015版药典对药品检验环境的要求 无菌检查 在无菌的环境单向流空气区域内或隔离系统中进行，符合无菌检 查的环境要求。 微生物限度检查 在无菌的环境单向流空气区域内进行，符合微生物检查的环 境要求。 。 空气悬浮粒子标准 洁净度级别 悬浮粒子最大允许数/立方米 静态动态(3) 0.5m5.0m(2)0.5m5.0m A级(1)352020352020 B级3520293520002900 C级3520002900352000029000 D级352000029000不作规定不作规定 ISO14644-1:2010 洁净度等级及悬浮粒子要求 环境的要求 ISO等级级序数 （N） 0.1m0.2m0.3m0.5m1m5m 1 102 4 2 1002410 3 1000237102358 4 100002370102035283 5 1000002370010200352083229 6 1000000237000102000352008320293 7 352000832002930 8 352000083200029300 9 352000008320000293000 中国（2010）、欧盟、WHO GMP对洁净环境微生物监测动态标准 洁净度级别 浮游菌 cfu/m3 沉降菌（ 90mm） cfu /4小时 表面微生物 接触碟（ 55mm） cfu /碟 5指手套 cfu /手套 A级1111 B级10555 C级1005025 D级20010050 注： 表中各数值均为平均值。 单个 沉降碟的暴露时间可以少于4小时，同一位置可使用多 个沉降碟连续进行监测并累积计数。 ISO14644-1:2010 洁净度等级及悬浮粒子要求 环境的要求 洁净度 级别 物理参数 过滤完 整性 气流组织空气流速换气次数压差温度相对湿度 5 检漏试验 、监测周 期 24个月 单向流 监测周期 12个月 .2m/s 0.2-0.5 监测周期 12个月 洁净区与非洁净 区之间压差不小 于10Pa; 不同级别洁净区 之间的压差不小 于5Pa 监测周期 12个月 30-65% 6非单向流 - -70-160h-1 非单向流 - -30-70h-1 7 8非单向流 - -10-20h-1 人员 从事药品洁净实验室微生物监测和控制的人员应符合现行中国药典 附录中“药品微生物实验室指导原则”的相关要求。 参数确认 初次使用的洁净实验室应进行参数确认，物理参数的测试应当在微生物监测 方案实施之前进行。为 确保操作顺畅，保证设备系统的运行能力和可靠性 。 确认主要的物理参数过滤系统完整性，空气流速，气流组织、换气次数、压 差、温度和相对湿度等。 空气悬浮粒子和微生物 当人员流动、超净工作台等重大设备运转、空气调节系统等重大变化时应重 新进行参数测试。 测试结果不能作为最终判断依据，应进行综合分析判断。 监测方法 悬浮粒子、沉降菌、浮游菌、表面菌的测试方法 GB/T 16292-2010医药工业洁净室（区）悬浮粒子的测试方法； GB/T 16294-2010医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法； GB/T 16293-2010医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法。 药品洁净实验室监测项目及频次（参考） 受控区域 洁净度级别采样频次 监测项目 隔离系统内部每次实验空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物（手套） 相邻外部每月一次空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物 微生物洁净实 验室 无菌检查（以A/B级或 A/C级为例） 每次实验空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物（手套及操作服） 微生物限度检查以A/C 级为例） 每周一次空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物（手套及操作服） C级每季度一次空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物 D级每半年一次空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面 微生物 以下情况及时调整检测频率 连续超过纠偏限和警戒限。 关键区域内发现有污染存在。 空气净化系统进行任何重大的维修。 消毒规程改变。 设备有重大维修。 洁净室（区）结构或区域分布有重大变动。 引起微生物污染的事故。 日常操作记录反映出倾向性的数据。 2010版 GMP 洁净室 检测 采样及监测 空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌的采样点、数量、位置、次数、采样量 、最少平皿数及采样注意事项参见国家标准； GB/T 16292-2010 GB/T 16293-2010 GB/T 16294-2010 洁净室环境 检测 培养基 胰酪大豆胨琼脂（TSA） 细菌、酵母菌和霉菌的生长必要时可加入添加 剂消除和减少消毒剂和抗生素的作用。， 沙氏葡萄糖琼脂(SDA)或玫瑰红钠琼脂培养基酵母菌和霉菌的监测。 通常，不监控厌氧菌，因为这些微生物在环境中不能生存。如需要应对微需 氧和低氧环境下生长的微生物进行监测。 用于环境微生物监测的培养基须特别防护。 双层包装和终端灭菌，否则使用前应进行100%的预培养以防止外来的污染物 带到环境中及避免出现假阳性结果。 胰酪大豆胨琼脂（TSA），培养温度为30-35，时间不少于2天。 沙氏葡萄糖琼脂(SDA)，培养温度为20-25，时间不少于5天。如需要可 以延长至7天。 稀释剂 0.9%无菌氯化钠溶液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 胰酪大豆胨肉汤（TSB）或其他适宜的稀释剂。 在净化空气系统正常运行不少于10min后开始测试。 静态测试时测试人员不得多于2人。 洁净室微生物监测 培养皿的直径为90mm，培养皿的有效期为14天 TSA（胰酪大豆琼脂） 将已制备好的培养皿，放置在主要操作区内并接近于操作高度，打开培养 皿盖，将盖子倒扣放置，使培养基表面暴露4h，培养。 C级，D级区域每个房间放置2个点。 动态检测沉降时间为操作全过程，可以不足4h；若生产操作超过 4h，需 要更换新的培养 皿。 A级区域每个房间4个点，根据操作人员活动频率和风险影响放置。 沉降菌的检测 浮游菌检测 准备及检测程序 培养皿直径为90mm，培养皿的有效期为14天。 TSA（胰酪大豆琼脂） 检测程序 按仪器说明书规定程序进行操作。 注意点 使仪器中的残余消毒剂蒸发，时间不少于5min。 每个点采集结束后，都需要等消毒剂蒸发之后再检测下个点。 表面菌检测 检测范围 环境、设备和人员采用接触碟或棉拭子擦拭 接触碟法 操作人员出A级区前，在规定房间进行取样。 直径为55mm的凸碟， TSA （胰酪大豆琼脂）。 将充满规定的琼脂培养基的接触碟取样后置规定温度下培养计数 结果以cfu/碟报告。 人员表面菌检测 接触碟 先分别取2只手套五指样，再取额头、前胸、手肘和膝盖样。 打开接触碟盖子，将五指轻轻按于接触碟培养基上10秒钟后，盖回上盖，做 上标识。 再用接触碟分别轻压洁净服额头部、前胸部、手肘部(任一边)、膝盖部(任一 边)10秒钟后，盖回上盖，做上标识，标明操作人员代号、取样位置时间。 设备环境表面菌的检测 试验结束清场前检测 用接触碟或棉签擦拭对主要生产操作设备表面、地面和墙面进行取样后立 即对取样位置用消毒液擦拭。 设备表面擦拭样为操作时人员易接触位置，如反应釜釜体、抽滤器外表 面、烘箱门把手等部位。 棉签擦拭法 用于不规则表面的取样，如地面、台面、墙壁、设备、门把手等。 用孔面积为2Ocm2的无菌的金属模饭压在测试面上，将无菌棉签用O. 9无 菌氯化纳溶液占湿，在板孔范围内擦抹5次，换1支棉签再擦抹5次，共擦 抹10次，5个位置100cm2 ， 每支棉签抹完后立即剪断(或烧断)，投入盛 有30mlO.9%无菌氧化纳需液的锥型瓶(或大试管中 ，摇晃约1分钟，即 得供试液。 取供试液，按 中国药典2015年版微生物计数方法测定。 每个棉签取样面积为25 cm2，微生物计数结果以CFU。 洁净区环境微生物的控制 警戒限 用来指示环境中的微生物数是否有偏离正常水平的可能性。 结果超出警戒限应采取的措施; 鉴别微生物 调查是否存在的取样/检验程序的偏差并分析操作过程中环境系统，生产 工艺是否存在的偏差。评估结果趋势。 行动限 测试同一个房间不同点的微生物数连续三次超过警戒线., 表示环境中的微生物数污染水平已严重偏离正常水平， 并且对产品质量 造成高度的污染风险。 警戒限度和纠偏限度 微生物监测警戒限度和纠偏限度的制定 根据历史数据，结合不同洁净区域的标准，采用数理统计方法 ，制定适 当的微生物监测警戒限度和纠偏限度。 一般可将平均值加上2倍的标准差作为警戒限度。 加上3倍标准差作为纠偏限度。 定期回顾评价，如历史数据表明环境有所改善，限度应作出相应调整以反 映环境实际质量状况。 洁净环境微生物纠偏限度参考值 洁净度级别 浮游菌纠偏限度 cfu/m3 沉降菌纠偏限度（） cfu /4小时 A级11 B级73 C级105 D级10050 注： 数据表示建议的环境质量水平，也可根据检测或分析方法的类型确定 微生物纠偏限度标准。 可根据需要增加沉降碟数。 A级环境的样品，正常情况下应无微生物污染。 数据分析及偏差处理 对日常环境监测的数据进行分析和回顾 通过收集的数据和趋势分析； 总结和评估无菌生产环境或洁净实验室是否受控， 评估警戒限度和纠偏限度是否适合及所采取的纠偏措施是否正确。 正确评估微生物污染 不仅仅关注微生物数量，更应关注微生物污染检出的频率 在一个采样周期内同一环境中多点发现污染，预示风险增加，应仔细评估。 几个点同时有污染的现象可能由不规范采样操作引起。应仔细回顾采样操作 过程。 在污染后的几天对环境进行重新采样是没有意义的，因为采样过程不具有可重 复性 偏差处理 当微生物监测结果超出警戒限度和纠偏限度时，应当按照偏差处理规程进行处理 并采取纠正措施，并进行评估。 重大偏差 关键区域（A级）微生物监测数值若大于15 cfu，应迅速调查原因。 分析是独立是与其他联系，应回顾和追溯两周前的微生物监测数据，并考虑是否 对样品召回。 -USP(35)1116品无菌操作环境的微生物控制和监测指导原则 洁净区环境微生物的控制 措施 鉴别微生物。 调查 是否存在的取样/检验程序的偏差。 操作过程中环境系统，生产工艺是否存在偏差。 评估结果趋势。 根据现行程序对相关区域再清洁消毒 按程序通知有关部门。 在开始生产前复测。 人员培训。 当有2次超过行动限时采取以下措施； 洁净区环境微生物的控制 确定可能污染微生物的原因并调查样品是独立的还是涉及整个区域， 人员 的水平，健康，技术，清洁程序等。更衣程序房间/洁净空气 装置的HEPA过滤器完整性已进行的过程趋势图中的以前的检测结果 或其他已确定的问题。 调查范围 - 无菌生产人员 - 微生物检查人员 - QA/QC人员 报告书 检测结束，由QC及时出具检验报告书报告书 一式两 份，一份附在检验原始记录中，一份发 给车间。 洁净区环境微生物的控制 检验原始记录由质量保证部存档。 附件: 微生物检测记录 洁净区（室）微生物检测报告 生产