流感病毒细胞分离培养课件

流感病毒细胞分离培养 *1 一、组织培养概况 （一）组织培养定义 组织或细胞培养是指从机体中取 出组织或细胞，模拟机体内的生理条 件在体外进行培养，使之生存和生长 。 Date2 （二）、组织组织 培养的原理 组织培养主要是为病毒易感的组织细 胞提供一 个良好的生存环境，使细胞对环境产生适应性，获 得生长繁殖的能力。 病毒在敏感细胞中繁殖，常可引起细胞代谢等 方面的变化，可出现细胞病变并释放病毒到维持液 中，这种情况可用细胞病变、色变法及检测维 持液 中病毒抗原的方法，判定病毒的存在及滴度。 有些病毒不引起细胞病变，有些在核内繁殖不 易释放到维持液中，前者可用干扰的方法及免疫荧 光的方法来检测病毒，后者常采用冻融破坏细胞获 得病毒后检测。 Date3 （三）、组织组织 培养所需的材料和条件 1、组织或细胞来源： 人、猴、啮齿类 、禽的胚胎、脏器以及昆虫 等为组织 培养常见的组织 来源。用于病毒培养 的往往是病毒的自然宿主细胞。如人类病毒用人 和猴组织较敏感，但有些病毒用其他宿主细胞亦 很敏感，如乙脑病毒对白纹伊蚊细胞系C6/36较人 的细胞更为敏感。流感病毒对狗肾传代细胞（ Madin darby canine kidney,MDCK）亦很敏感 。 Date4 2、单细胞的制备（略） Date5 3细胞培养的基本条件： （1）细胞接种数：细胞量越大繁殖的速度越快， 接种传代细胞一般为1030万/ml。 （2）合成培养液：如Eagle氏液，RPMI1640， Eagles MEM。 不同培养液各有其特点，但往往 也适用于各种细胞培养，其主要成分为氨基酸、碳 水化合物、维生素、无机盐及其他成分。配制培养 液的水一般用单蒸后的去离子水。 合成培养液中不含蛋白质成分，血清蛋白对 组织培养是不可缺少的；不仅能促进细胞增长且 能帮助细胞贴壁，不同血清对细胞促进作用不同 ，以胎牛血清最好，每批血清使用前需以5630分 钟灭活处理。含有10%血清的培养液能促进细胞增 殖，称为生长液。 Date6 （3）酸碱度：细胞生长最适宜的PH范围是 7.07.4。培养环境偏酸较偏碱更宜于细胞 贴壁。PH的变化主要取决于，HCO3-浓度、二 氧化碳分压，细胞糖代谢能力。使用二氧化 碳培养箱，能提供稳定的5%二氧化碳。可自 动调节细胞代谢引起的PH改变。 （4）温度：细胞培养的最适温度与细胞来 源的动物体温一致，温度增加23对细 胞产生不良影响，使之在24h内死亡。低温 对细 胞影响较小。 Date7 （5）无菌条件：细胞培养的关键之一是要有无菌概 念，要防止污染。在细胞培养中，可能发生污染的来 源很多，有组织培养液、器皿、组织本身、工作者本 身、空气等。因此要对培养液、器皿用具、操作室进 行彻底消毒，在操作时要严格实行无菌操作。 （6） 培养器皿的处理：培养器皿处理的好坏与否对 于细胞的贴壁生长影响很大。常用的器皿主要有玻璃 及塑料二大类。玻璃器皿一般须用清洁液浸泡过夜 、清水洗10次后再用蒸馏水洗2次，烤干备用。塑料 板一般用2%NaOH浸泡1小时后，清水洗净再用1N HCl浸泡1小时，用清水洗后再用蒸馏水漂洗。37 干燥后，紫外线照射消毒。 Date8 (四）组织培养的优缺点及应用范围： 优点：可提供大量生物性状相同的细胞作为研究对 象，对疫苗生产来说，其抗原性更接近于自然流行 株，可减少宿主蛋白成分，减少变态反应。 缺点：病毒复制后滴度低，不易保存，保存时易使 病毒滴度丢失，传代细胞含致癌因子，不宜用于疫 苗生产。且随着细胞代数增加，对病毒敏感性也随 之下降。 应用范围：目前组织培养技术已应用于病毒学的 各个部门，不仅应用于病毒性疾病的诊断及疫苗制 备，也深入应用到病毒学基础理论的研究 Date9 二、组织培养分离流感病毒 流感监测最主要的目的是及时发现并分离到 有意义的流感病毒新变种，尤其大流行株， 用于诊断试剂的制备、疫苗的生产及疫情预 报。组织培养技术是分离，诊断流感病毒最 常用和最可靠的方法之一。 人流感病毒最初是通过雪貂分离出，但雪貂 繁殖慢，量少，价钱昂贵并难饲养，故无法 加以广泛应用。上世纪30年代中开始，多用 鸡胚来分离流感病毒。 Date10 近来由于PCR技术突习猛进地发展，发现 了通过鸡胚所分离到的流感病毒，其抗原 性与原始标本的有所不同，而通过MDCK细 胞分离出的，其抗原性与原始标本的相似 。近来由于“O”相毒株的重现，MDCK等一 些细胞对“O”相毒株的敏感性大大超出鸡 胚的敏感性。因此，MDCK等一些细胞已成 为各流感病毒分离不可缺少的一种宿主系 统。 由于MDCK等一些传代细胞属肿瘤细胞系， 用其分离的病毒不能用于疫苗制备，故要 求进行流感病毒分离时，同时采用鸡胚和 MDCK细胞。 Date11 （一）MDCK细细胞分离流感病毒 1、实验材料： MDCK细胞（最好是早代的） Eagle氏培养液（日本产的含谷氨酰 胺的以抽滤为好） Hank氏溶液 0.25%胰酶和Versene消化液 双抗(青、链霉素)或庆大霉素和抗真 菌素 胎牛或小牛血清 5.6%或7.5%的NaHCO3. Date12 （1）细胞生长液配制 90ml Eagles液+含终浓度为 100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素+10ml 小牛血清+2ml 5.6%NaHCO3 PH调至 7.2 -7.4。 （2）细胞维持液配制: 同生长液，但不含胎牛或小牛血清， 而含终浓度为23ug/ml胰酶，用前用 NaHC03将PH调至中性或偏碱。维持液的 作用是使细胞停止繁殖，但仍保持代谢 。 Date13 2、MDCK细胞传代 （1）先把需用的Eagles和Versene放37水浴预温 ，其它试剂不得放入。 （2）已成片的MDCK细胞，将其生长液倒掉。用 Versene洗2遍。 （3）把Versene与0.25%胰酶按71比例配成消化液 。 （4）置37恒温箱510min，当细胞变圆，细胞与 细胞间互不相联，表明消化时间已到。如细胞仍连 成片，表明消化时间未到。 （5）倒掉消化液，瓶内留少许流体，再放37 2 3，取出手上轻轻拍打几下，这时可加已配好的 生长液，稍加吹打即可。一般情况下，1瓶细胞传3瓶 ，每2-3天需传一代。 Date14 3、MDCK细胞保存及复苏 MDCK细胞对流感病毒的敏感性随其代数增加 而下降，故各实验室应液氮冻存代数较低的细 胞作为种子。一般保存液为含10%二甲基亚砜和 90%小牛血清。 （1）MDCK细胞保存：将单层细胞消化分散成为 单细胞，加入0.9ml小牛血清和0.1ml二甲基亚 砜混合保存液，每瓶加1ml保存液，缓慢冻存： 先放42h，转放704h，再转放液氮中长期 保存。 （2）MDCK细胞复苏：细胞冻存管从液氮罐取出 后，速放37水浴溶化，1500rpm/分离心1分钟 ，弃上清、沉渣加入若干ml培养液，混匀后加 入细胞培养瓶中，置37二氧化碳温箱培养。 Date15 4、MDCK细胞对流感病毒敏感性测试 MDCK细胞对病毒的敏感性随其代数 增加而下降。故MDCK细胞在实验室传20代 以上时，一般需测试一下其对流感病毒的 敏感性。其具体测试法：选一株对MDCK细 胞较敏感的流感病毒株。在同一条件下， 用早代与要测试的MDCK细胞对其进行 TCLD50测定。如果测试的TCLD50比早代的 低2个或以上Log,表明其对病毒的敏感性 已下降，不应再加以使用 。 Date16 5、MDCK细胞病毒接种和收获 （1）在低倍光学显微镜下检查MDCK细胞 生长状态。 （2）成片的细胞弃生长液，用Hanks液 洗两遍，将残余的牛血清洗净，因牛血清 中含有流感病毒非特异抑制素，会影响流 感病毒的复制。 （3）每瓶加入接种标本0.5-1.0ml，轻摇 细胞瓶，置35吸附1-2h。 （4）倒掉感染液，再用Hanks液洗12 遍，每瓶加入3ml维持液，置33-35培养 。 Date17 （5）次日起每天检查有无细胞病变（CPE）。CPE特 征为细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或碎 裂，严重时细胞部分或全部脱落（见附图）。 （6）收获及红细胞凝集活性（HA）检查：当CPE出现 +号时进行收获，由于CPE无法证实就是流感 病毒所造成。最后还得看维持液中是否有红细胞凝集 活性（HA），出现细胞凝集的为阳性标本， 收获所有的维持液进行病毒鉴定，也可暂冻存之 。 由于维持液中无牛血清，同时含一定量的胰酶 和NaHCO3，故不应在4保存，否则易造成HA活性丢 失和PH变高。维持液中加适量胰酶的目的是为了提高 流感病毒在细胞中复制能力。 （7）传代及盲传：如收获的维持液HA滴度不高或量 不够用于鉴定，需在MDCK细胞或鸡胚中传代，把HA滴 度提高或增多。 Date18 （二）细胞培养中应注意的一些问题 1、消化时间过长（30min-1h）或胰酶保存时间太久， 应改变胰酶的浓度或二次消化。 2、细胞的保存问题。取到早代细胞种子时一定要及时 地保