损伤修复与抗肿瘤药物研究ppt课件

冯冰虹教授 DNA损伤修复与抗肿瘤药物研究 2 基因突变（gene mutation）: 在生物进化过程中，由于生物体内外环境多种 因素的影响，使遗传物质的结构改变而引起遗传信 息的改变，均可称为突变。 从分子水平来看，突变主要表现为DNA分子上 碱基的改变。 在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤 （DNA damage）。 突变的意义 3 （一）突变是进化、分化的分子基础。 （二）只有基因型改变，而无可察觉表型改变的 突变（基因多态性：用于描述个体之间的 基因型差别现象）。 （三）致死性的突变（利用此特性消灭有害病原 体）。 （四）突变是某些疾病的发病基础。 4 第一节 DNA损伤的因素和类型 一、引起DNA 损伤的因素 5 *紫外线照射 *电离辐射 自发突变： 频率：10-9 *5-溴尿嘧啶(5-BU) *羟胺 *亚硝酸盐 *氮芥类 物理 生物 化学 诱变因素 病毒等 （二）环境造成的DNA 损伤 8 1、紫外线引起的DNA损伤 UV T G A A C C A C T T G G 胸腺嘧啶二聚体 DNA之间交联 DNA与蛋白质交联 DNA链断裂 9 2、电离辐射引起DNA损伤 （1）导致碱基变化 主要由OH自由基引起，包括DNA 链上碱基氧化修饰、过氧化物形成、 碱基环的破坏和脱落等。 （2）导致脱氧核糖变化 脱氧核糖上每个碳原子和羟 基上氢都能与OH反应,导致脱氧 核糖分解，最终引起DNA链断裂 （3）导致DNA链断裂 可使脱氧核糖破坏或磷酸二酯 键断开而导致DNA链断裂。有单链 断裂、双链断裂等不同形式。 （4）引起DNA链交联 DNA-DNA交联、DNA-蛋白质 交联。是细胞受电离辐射后在显微 镜下看到的染色体畸变的分子基础 10 3、烷化剂引起DNA损伤 （1）导致碱基烷基化 G的N7和A的N3最容易烷基化，G的 N7被烷基化后改与T配对， G-CA-T （2）导致碱基脱落 G烷基化后的糖苷键不稳定，易 脱落形成DNA上无碱基位点，复制时 可插入任何核苷酸，使序列改变。 （3）导致DNA链断裂 磷酸二酯键上的O易烷基化，形 成不稳定的磷酸三酯键，糖与磷酸间 发生水解，DNA链断裂。 （4）引起DNA链交联 单功能基烷化剂：甲基甲烷碘酸 双功能基烷化剂：DNA链内、链间、 以及与蛋白质的交联 氮芥、硫芥；环磷酰胺；二乙基 亚硝酸 11 4、碱基类似物、修饰剂引起碱基对的改变 （1）碱基类似物用作促突变剂或抗癌药物 5-氟尿嘧啶（5-FU）、5-溴尿嘧啶（5-BU）、 2-氨基腺嘌呤（2-AP）。 （2）某些化学物质能专一修饰DNA链上碱基 亚硝酸盐：使C脱氨变成U，经复制使G-CA-T 羟胺：使T脱甲基变成C，结果A-T G-C 黄曲霉素B：专一攻击DNA上碱基，导致序列变化 这些均为诱发突变的化学诱变剂或致癌剂 二、DNA 损伤的类型 12 单点突变、多点突变 转换、颠换 链内共价交联 链间共价交联 电离辐射、某些化学试剂 使链内磷酸二酯键断裂 DNA重组 DNA损伤 碱基突变 DNA链断裂 DNA链交联 插入或缺失 单个碱基、多个碱基、 一段序列的插入或缺失 DNA分子内发生较大片 段的交换。 1. 碱基和糖基破坏 损伤因素 酸、热去嘌呤作用、碱基修饰剂、自由基 、活性氧、紫外线 损伤类型 碱基丢失/插入、碱基置换、DNA片段缺失/插入 13 2. 错配 损伤因素 碱基类似物、碱基修饰剂、自发脱氨基 常见错配类型 UT 14 3. DNA链断裂 损伤因素 电离辐射、化学物质诱导 损伤类型 单链断裂、双链断裂（最严重损伤，不能 原位修复，易致畸) 15 4. DNA交联 化学物质诱导化学物质诱导( (如丝裂霉素如丝裂霉素) ) 损伤因素 损伤类型 链内交联 同一DNA链上碱基共价结合 嘧啶二聚体DNA链上相邻的两个嘧啶碱 基之间共价结合，形式有TT、CT、CC 链间交联 不同不同DNADNA链之间的碱基共价结链之间的碱基共价结合合 DNA-蛋白质交联 DNADNA与蛋白质以共价键结合与蛋白质以共价键结合 16 DNA交联示意图 17 第二节 DNA损伤的修复的机制 18 常见的DNA损伤及其修复机制 DNA损伤因素 DNA损伤类型修复机制 X射线、氧自由基 、烷化剂 自发脱碱基 单链断裂、无碱基位点、氧化性 碱基（如8-氧鸟嘌呤）脲嘧啶 碱基切除修 复 紫外线和多环芳烃环丁烷嘧啶二聚体等大的紫外线 光产物和稳定的多环芳烃化合物 等大分子DNA加合物 核苷酸切除 修复 抗癌药（如顺铂和 丝裂霉素） 双链断裂和链间交联双链断裂修 复（同源重 组修复和末 端连接） 复制错误和烷化剂碱基错配和缺失（插入）错配修复 19 修复(repairing) 是对已发生分子改变的补偿措施，使其 回复为原有的天然状态。 光修复(light repairing) 切除修复(excision repairing) 重组修复(recombination repairing) SOS修复 错配修复 修复的主要类型 一、一、DNADNA损伤的修复的概念和类型损伤的修复的概念和类型 20 二、DNA损伤的修复的机制 光复活酶与DNA链上嘧啶二聚体部位结合 受波长为260-380 nm的近紫外线 作用激活使二聚体解聚 酶从DNA链上解离，DNA恢复正常结构 （一）回复修复 酶学光复活 21 光修复酶 (photolyase) UV 22 23 嘌呤直接插入 O6-甲基鸟嘌呤-DNA的甲基转移 单链重接（单链断裂修复） 24 * 25 25 （二） 切除修复 定义 在多种酶的作用下，先将损伤区域切除，然 后利用互补链为模板，合成一段正确配对的碱 基顺序来修补 切除过程 切除方式 碱基切除修复、核苷酸切除修复碱基切除修复、核苷酸切除修复 识别并切除修复合成并连接 26 2.12.1碱基切除修复（碱基切除修复（base-excision repair, BERbase-excision repair, BER） 所有细胞中都带有能识别受损核酸位点的所有细胞中都带有能识别受损核酸位点的 糖苷水解酶，它能特异性切除受损核苷酸糖苷水解酶，它能特异性切除受损核苷酸 上的上的N-N-糖苷键，在糖苷键，在DNADNA链上形成去嘌呤链上形成去嘌呤 或去嘧啶位点（或去嘧啶位点（APAP位点）。位点）。 27 vDNA分子中一旦产生了AP位点，AP核酸内切 酶就会把受损核苷酸的糖苷-磷酸键切开，并 移去包括AP位点核苷酸在内的小片段DNA，由 DNA聚合酶I合成新的片段，最终由DNA连接酶 把两者连成新的被修复的DNA链碱基切除修 复(base-excision repair)。 28 .糖甘水解酶识别改变了的碱基，把碱基从N- 糖苷键处切下来，在DNA链上形成去嘌呤或去 嘧啶位点，统称为AP位点。 29 由AP磷酸内切酶将受损核 甘酸的糖苷-磷酸键切开 53 30 DNA连接酶连接 利用DNA聚 合酶I在切 除损伤部 位，补上 核苷酸 31 * 32 32 核苷酸切除 被切除的不是单个碱基，而是一段寡核苷酸 。是细胞内更为重要的一种修复方式 切除修复的特点切除修复的特点 是DNA修复的一种普遍形式 33 2.22.2核苷酸切除修复（核苷酸切除修复（Nucleotide Nucleotide excision repair, NERexcision repair, NER） 是机体正常细胞针对是机体正常细胞针对DNADNA链上较大损伤的修链上较大损伤的修 复过程，它由多种复过程，它由多种DNADNA修复酶组成。修复酶组成。 34 2.22.2核苷酸切除修复（核苷酸切除修复（Nucleotide Nucleotide excision repair, NERexcision repair, NER） 损伤发生后，首先由损伤发生后，首先由DNADNA切割酶切割酶 (excinuclease)(excinuclease)在己损伤的核苷酸在己损伤的核苷酸55和和33 位分别切开磷酸糖苷键，位分别切开磷酸糖苷键， 产生一个由产生一个由12121313个核苷酸个核苷酸( (原核生物原核生物) )或或2727 2929个核苷酸个核苷酸( (人类或其他高等真核生物人类或其他高等真核生物) )的的 小片段，小片段， 移去小片段后由移去小片段后由DNADNA聚合酶聚合酶(原核原核) )或或（真（真 核核) )合成新的片段，并由合成新的片段，并由DNADNA连接酶完成修复连接酶完成修复 中的最后一道工序。中的最后一道工序。 35 识别损伤部位 损伤的两边切除几个核苷酸 DNA 聚合酶以母链为 模板复制合成新子链 DNA连接酶将切口补平 36 （三） 重组修复 定义 重组酶系将未受损伤的DNA 片段移到损伤部位， 提供正确的模板，进行修复 分类 同源性重组 两段双链DNA同源性大于200 bp，大肠杆菌及酵母 中Rec A蛋白、人细胞中Rad51是关键 非同源性重组 同源性低，DNA双链断裂的主要修复方式，关键 分子是DNA-PK及XRCC4，非精确修复 37 * 38 38 复制中出现损伤 重组修复 DNA聚合酶填补 缺损 39 * 40 40 （四）错配修复（四）错配修复（mismatch repairmismatch repair，MMRMMR） DNA DNA 错配修复是细胞复制后的一种修复机制错配修复是细胞复制后的一种修复机制, , 具具 有维持有维持DNA DNA 复制保真度复制保真度, , 控制基因变异的作用。控制基因变异的作用。 l l 错配修复实际上是一种特殊的核苷酸切除修复，错配修复实际上是一种特殊的核苷酸切除修复， 它专门用来修复在它专门用来修复在DNADNA复制中出现的新合成复制中出现的新合成DNADNA链链 上的错配的碱基。但如何避免将上的错配的碱基。但如何避免将DNADNA链上正确的链上正确的 碱基切除呢？这就需要将碱基切除呢？这就需要将old strand old strand 和和new new strandstrand区分开来。区分开来。 41 u原核生物利用甲基化区分old strand 和new strand，因此原核细胞 中的错配修复也称甲基化指导的错配 修复（methyl-directed mismatch repair）。 42 u错配修复系统识别母链靠Dam甲基化酶（ Dam methylase），它能使位于5GATC序 列中A的N6位甲基化。一旦复制叉通过复制 起始位点，母链就会在开始DNA合成前的一 小点时间（几秒钟至几分钟）内被甲基化 。刚合成的DNA新链上的GATC序列还没有来 得及甲基化，而作为模板的old strand早 已被甲基化了，利用这种差别区分old strand 和 new strand。 43 此后，一旦发现错配碱基，错配修复系统此后，一旦发现错配碱基，错配修复系统 就会根据就会根据“保存母链，修正子链保存母链，修正子链”的原则的原则 ，找出错误碱基所在的，找出错误碱基所在的DNADNA链即将未甲基化链即将未甲基化 的链切除，并以甲基化的链为模板进行修的链切除，并以甲基化的链为模板进行修 复合成。复合成。 GATCGATC中中A A甲基化与否常用来区别新合成的链甲基化与否常用来区别新合成的链 （未甲基化）和模板链（甲基化）（未甲基化）和模板链（甲基化） 。这一这一 区别很重要区别很重要 44 错配修复（错配修复（mismatch repairmismatch repair） DamDam甲基化酶使母链位于甲基化酶使母链位于5GATC5GATC序列中腺苷酸甲序列中腺苷酸甲 基化基化 甲基化紧随在甲基化紧随在DNADNA复制之后进行复制之后进行 根据复制叉上根据复制叉上DNADNA甲基化程度，切除尚未甲基化甲基化程度，切除尚未甲基化 的子链上的错配碱基的子链上的错配碱基 通过通过3 3个蛋白质（个蛋白质（MutSMutS、MutHMutH和和MutLMutL）校正）校正 45 根据母链甲基化原则找出错配碱基的示意图根据母链甲基化原则找出错配碱基的示意图 1. MutS发现错配碱基 2.在水解ATP的作用下， MutS， MutL与碱基错配 点的DNA双链结合 3.MutS-MutL在DNA双链 上移动，发现甲基化 DNA后由MutH切开非甲 基化的子链 46 甲基化指导的错配修复示意图甲基化指导的错配修复示意图 错配碱基位于 切口3下游 端， 错配碱基位于 切口5上游端 ， 47 （五）SOS修复 定义 DNA损伤时应急产生的修复作用，解除 修复系统抑制，使其产物 (多种修复蛋白) 参与修复 48 SOS修复中LexA-RecA操纵子的作用机理 49 当细菌当细菌DNADNA遭到破坏时，细菌细胞内会启动一遭到破坏时，细菌细胞内会启动一 个被称为个被称为SOSSOS的诱导型的诱导型DNADNA修复系统。修复系统。 在正常情况下，在正常情况下，DNADNA损伤的修复基因的操纵子损伤的修复基因的操纵子 被被LexALexA蛋白所阻遏。蛋白所阻遏。 SOSSOS修复系统受到修复系统受到LexALexA阻阻 遏蛋白的抑制，平时该蛋白表达水平很低。遏蛋白的抑制，平时该蛋白表达水平很低。 SOSSOS体系的诱导表达过程其实就是体系的诱导表达过程其实就是LexALexA阻遏蛋阻遏蛋 白从这个基因的上游调控区移开的过程。白从这个基因的上游调控区移开的过程。 阻遏蛋白阻遏蛋白LexALexA的降解与细菌中的的降解与细菌中的SOSSOS应答应答 50 当有紫外线照射时，细菌体内的当有紫外线照射时，细菌体内的RecARecA蛋白水蛋白水 解酶被激活，催化解酶被激活，催化LexALexA阻遏蛋白裂解失活，阻遏蛋白裂解失活， 从而导致与从而导致与DNADNA损伤修复有关的基因表达。损伤修复有关的基因表达。 RecARecA蛋白：是蛋白：是SOSSOS反应的最初的发动因子。在反应的最初的发动因子。在 单链单链DNADNA和和ATPATP存在时，存在时，RecARecA蛋白被激活，表蛋白被激活，表 现出水解酶活性，分解现出水解酶活性，分解LexALexA阻遏物。阻遏物。 51 v表达RecA蛋白与这些缺口处单链DNA相结 合，被激活成蛋白酶。具有蛋白酶活性的 RecA蛋白将LexA蛋白切割成没有阻遏作用的 和具有与操纵区DNA结合活性的两个片段， 导致SOS体系的高效表达，使DNA得以修复。 52 SOS反应 SOS基因 紫外线 激活 Rec A Lex A阻遏蛋白 与DNA 损伤修复有 关的酶和蛋白质 基因 表达 Lex A阻遏蛋白 操纵序列DNA 53 当修复完成后，活化信号消失，当修复完成后，活化信号消失， RecARecA蛋白回复到非蛋白水解酶的形式，蛋白回复到非蛋白水解酶的形式， LexALexA蛋白开始逐步积累，并重新建立起蛋白开始逐步积累，并重新建立起 阻遏。阻遏。RecARecA蛋白的合成停止，蛋白的合成停止，DNADNA恢复复恢复复 制，制，RecARecA蛋白被稀释到原来的本底水平蛋白被稀释到原来的本底水平 。 54 三、三、 DNA 修复的细胞周期检查点控制细胞周期检查点控制 真核生物细胞真核生物细胞DNADNA受到损伤时细胞除了诱导修受到损伤时细胞除了诱导修 复基因的转录外，还可暂时阻断细胞周期，防复基因的转录外，还可暂时阻断细胞周期，防 止受损止受损DNADNA继续复制，如无法修复，则可诱导细继续复制，如无法修复，则可诱导细 胞进入凋亡。这些都是细胞通过细胞周期检查胞进入凋亡。这些都是细胞通过细胞周期检查 点控制（点控制（checkpoint controlcheckpoint control，又称关卡控制，又称关卡控制 ）对）对DNADNA损伤的应答反应。损伤的应答反应。 55 酵母细胞的细胞周期检查点控制机制酵母细胞的细胞周期检查点控制机制 DNA 损伤在 S 期DNA 损伤在 G1 和 G2 期 G1SG2M POL2 RFC5 DPB11 RAD9 RAD17 RAD24 MEC3 MEC1,TEL1 RAD53 56 哺乳类动物的细胞周期检查点控制机制哺乳类动物的细胞周期检查点控制机制 DNA 损伤 P21 Gadd 45 Bax P53 CDK/cyclin Gadd45 Gadd45-PCNA Blocking cell cycleExcision repairingCell apoptosis 57 四、DNA损伤应答的研究进展 （一）乙酰转移酶 T i p 6 0在 DNA损伤应答中作用的研究进展 T i p 6 0 ( T a t i n t e r a c t i v e p r o t e i n ) 是进化上极为保守的 乙酰转移酶， 它在细胞周期阻滞、 凋亡、D N A损伤修复等众多生理学过 程中都发挥着重要的作用。 作为许多转录因子的共调节因子， T i p 6 0 既可以激活也可以抑制特 定基因的转录。当发生D N A损伤时， 它被招募到损伤位点， 参与D N A 损 伤应答的感受、 信号转导和修复过程中。 除此之外， T i p 6 0还与许多病理过程有关， 尤其是在肿瘤发生中起 着关键作用。 58 T i p 6 0可以p 5 3依赖赖和不依赖赖两种方式参与 D N A损伤应损伤应 答： 59 （二）调调控 D N A损伤损伤 修复基因的miRNA 60 61 62 第三节 DNA损伤和修复的基因 63 一、甲基化损伤修复相关基因 甲基转移酶（MGMT）把O6-甲基鸟 嘌呤的甲基转移到自身的半胱氨酸残基上 ，修复甲基化的DNA。 MGMT突变可作 为甲基化损伤的基因型标记物。 64 二、切除修复相关的酶和基因 尿嘧啶糖基化酶为主要的始动因素，可作 为DNA损伤的生物标记物。 大肠杆菌Uvr基因家族、人ecrr基因和切除 修复基因等 65 三、错配修复相关基因 MSH2、MLH1等蛋白参与错配修复，而错 配修复的缺陷往往是癌变的第一步。 错配修复基因：Muthls系统、人类的hmsh2/3 、hpmsl1/2、Mutsa、msh6。 错配修复基因的微卫星序列的不稳定性 （microsatellite instability， MI） 66 四、 DNA聚合酶 DNA聚合酶参与辐射损伤和化学损 伤的修复，并对细胞的生长具有调节作 用。 DNA聚合酶 的突变可导致碱基切除修 复功能的缺陷。 67 五、 DNA加合物 英文名称：DNA adduct 定义：DNA分子与化学诱变剂间反应形成的一种共价 结合的产物。这种结合激活了DNA的修复过程 。 如果这种修复不是发生在DNA复制前，会导致核 苷酸的替代、缺失和染色体的重排。 DNA加合物可作为DNA损伤的暴露标记物和效应 标记物，其去除的速度也可作为DNA修复功能的生物 标记物。 68 DNA损伤和修复的生物学意义 避免基因组的不稳定性、癌症和细胞 死亡是至关重要的。 DNA修复途径可以识别 和修复特异的 DNA损伤 ，保证生物物种的遗传稳 定 性。 69 第四节 与DNA修复有关的人类遗传疾病 着色性干皮病(Xeroderma pigmentosum) 布伦氏症候群(Blooms syndrome) 遗传性大肠癌(Hereditary nonpolyposis colon cancer；HNPCC) 70 71 着色性干皮病 (Xeroderma pigmentosum) 是一种隐性遗传性疾病，有些呈性联遗传。因核 酸内切酶异常造成DNA修复障碍所致。临床以光 暴露部位色素增加和角化及癌变为特征。 1. 幼年发病，常有家族发病史。 2. 面部等暴露部位出现红斑、褐色斑点及斑片， 伴毛细血 管扩张，间有色素脱失斑和萎缩或疤痕 。皮肤干燥。数年内发生基底细胞癌、鳞癌及恶 性黑素瘤。 3.皮肤和眼对日光敏感。 4.病情随年龄逐渐加重，多数患者于20岁前因恶性 肿瘤而死亡。 5.组织病理 晚期出现表皮非典型性增生、日光角 化及鳞癌和基底细胞癌等恶性肿瘤。 72 着色性干皮病患儿脸部特征 73 着色性干皮病背部, 着色性干皮病组织切片 74 着色性干皮病 的并发症 75 着色性干皮病的治疗 避免紫外线照射 避免肿瘤致病因子 对症治疗 76 遗传性大肠癌的临床特征 发病早 (45 岁) 肿瘤好发部位 肠外肿瘤的类型 77 遗传性大肠癌(HNPCC