酶工程原理及应用01 绪论ppt课件

酶工程 (原理及应用) 周二 3,4节，1-5，,7-18 A2306 郑穗平E-mail: 酶？ 工程？ 科学问题： 工程问题： 淀粉与酶的结合？水解位置？ 淀粉酶和糖化酶的差异？ 高温淀粉酶与中温淀粉酶结构有无差别？ 如何获得酶？生产成本？使用成本？ 酶的水解速度？如何控制？ 淀粉酶和糖化酶如何搭配？作用条件？ 例子1： 科学问题： 工程问题： 植酸与酶的结合？水解位置？活性位点？ 不同类型植酸酶的差异？结构特点？ 如何获得酶？生产成本？使用成本？ 在饲料中如何复配？剂型如何？ 例子2： 什么是酶工程？ 酶工程(enzyme engineering)是在1971年第一届国际酶工 程会议上才得到命名的一项新技术，是酶制剂的大批量生 产和应用的技术。 酶工程主要研究酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结 构的修饰和改造以及在工农业、医药卫生和理论研究等方 面的应用。 课程概述 通过本课程的教学，帮助学生了解酶工程的基本方法、原理， 了解酶在科学研究、国民经济、社会生活中的应用和生命科学 前沿领域的新进展。 本课程将系统介绍酶工程技术的概念、原理、研究方法、发展 方向，同时介绍酶工程领域的最新科技成果。内容主要包括酶 的基本特性和生产、轻工行业用酶、环境和化工行业用酶、医 药诊断治疗用酶、酶的进化和人工设计等前沿领域。 课程内容安排 酶工程发展的背景、前沿及有关基础理论知识 酶的大规模发酵生产及制备技术（菌种选育、基因工程技术、 高效分离制备等） 酶的工程化改造（修饰、固定化、非水相催化等） 重要酶制剂的研发及应用 参考书目 第一章 绪 论 一、酶工程发展面临的挑战、机遇 二、酶工程技术发展历史及现状概述 三、酶工程技术发展中需要解决的关键问题及思路 一、酶工程发展面临的挑战、机遇 生物技术的四大支柱 基因工程：用“剪刀+糨糊”创造新物种的工程。 细胞工程：微观水平的嫁接技术。 酶工程：让工厂高效、安静、美丽如画的工程。 发酵工程：把微生物或细胞造就成无数微型工厂，将神话变为现实的桥梁。 现代化学工业面临重大的挑战 以石油等化石资源为源头的化学工业所面临的挑战在于化石资源 日益枯竭 化石资源的市场价格上涨迅速，现代化学工业的原料成本猛增 光合作用产生的 生物质循环 目前世界 化石资源消耗 仅需使用小于 10% 生物质循环， 即可替代化石资源 950亿吨 C年 65 亿吨 C年 现代化学工业面临的机遇 随着生物技术的发展，生物质资源的生产不断提高 生物催化与转化已成为 发达国家的重要科技与产业发展战略 新的生物催化剂是21世纪可持续发展的化学加工业的必 需工具。2020年，通过生物催化技术，使化学加工业的原料、 水资源、能量的消耗各降低30，污染物的排放和扩散也减少 30。 20世纪 80年代 20世纪 90年代 21世纪 生物医药 转基因植物 生物催化 生物技术的 三次浪潮 医药生物技术 人类基因组学 及相关科学 农业生物技术 动植物基因组学 及相关科学 工业生物技术 微生物基因组学 及相关科学 推动 目前人类所了解的微生物仅占总数1，故以微生物和酶为主的 工业生物催化技术的发展潜力非常大，发展空间较大。 推动 推动 拉动 人口 健康 食品 资源 能源 环境 拉动 拉动 Red Biotechnology Green Biotechnology White Biotechnology 科学技术社会需求 酶工程技术是工业生物技术的核心 工业生物技术发展的共性关键技术平台工业生物技术发展的共性关键技术平台 技术平台为依托 以高通量筛选手段为基础的微生以高通量筛选手段为基础的微生 物或酶功能优化平台物或酶功能优化平台 1. 酶工程技术平台 2. 代谢工程技术平台 以提高综合效益为目标的过程以提高综合效益为目标的过程 工程技术平台工程技术平台 1. 大规模发酵过程优化技术 2. 发酵工业清洁生产技术 物质加工方式的变革 可持续可持续 发展发展 不可持不可持 续发展续发展化 学 制 造 化石资源 化学 催化剂 基础物质加工业 （含化工、医药、石化、食品、材料和能源等） 生 物 制 造 生物 催化剂 生物质资源 传统加工方式新一代加工方式 石油精炼 有机化学 化工过程 化学反应多步 溶剂, 催化剂 能量 石油工业 石油 石脑油 石油 化学产品 关键化合物 乙烯、丙 烯、丁二烯 苯、甲苯、 二甲苯 生物基 化学产品 生物有机化学 新化学工业过程 生物催化 化学催化 工艺绿色化 生物质化学工业 CO2 太阳能 H2O CO2 O H O H O O H O H O H 关键 化合物 D-葡萄糖 可持续 社会 短缺 燃料 分解 生物质加工的重大产品体系 C4 C3 C2 C1 生 物 质 糖 甲烷、甲醇等 乙醇、乙酸、乙烯、乙二醇等 乳酸、丙烯酸、丙二醇等 丁二酸、富马酸、丁二醇、丁四醇等 衣康酸、木糖醇等 高 分 子 材 料 产 品 和 化 学 品 柠檬酸、山梨醇等 C5 C6 苯、苯酚等 二、酶工程技术发展历史及现状概述 1、酶的发现历史 人们对酶的认识起源于生产与生活实践。 夏禹时代，人们掌握了酿酒技术。 公元前12世纪周朝，人们酿酒，制作饴糖和酱。 春秋战国时期已知用麴(曲)治疗消化不良的疾病。 酶者，酒母也 酶 酒 西方国家19世纪对酿酒发酵过程进行了大量研究。直到1897年 ，德国巴克纳Buchner兄弟用石英砂磨碎酵母细胞，制备了不含 酵母细胞的抽提液，并证明此不含细胞的酵母提取液也能使糖 发酵，说明发酵与细胞的活动无关。从而说明了发酵是酶作用 的化学本质，为此Buchner获得了1911年诺贝尔化学奖。 1896年,日本的高峰让吉首先从米曲霉中制得高峰淀粉酶,用作 消化剂,开创了有目的的进行酶生产和应用的先例。 1878年, 给酶一个统一的名词，叫Enzyme，这个字来自希腊文 ，其意思“在酵母中”。 后来对酶的作用机理及酶的本质做了深入研究， 1930年，证实酶是一种蛋白质； 80年代初发现了具有催化功能的RNA核酶(ribozyme)，这一 发现打破了酶是蛋白质的传统观念，开辟了酶学研究的新领域 ， 现已鉴定出4000多种酶，数百种酶已得到结晶，而且每年都有 新酶被发现。 1908年,德国的罗姆制得胰酶,用于皮革的软化。 1908年,法国的波伊登(Boidin)制备了细菌淀粉酶,应用于纺织 品的退浆。 1911年,美国的华勒斯坦(Wallestein)制得木瓜蛋白酶,用于除 去啤酒中的蛋白质浑浊。 此后,酶的生产和应用逐步发展。然而在50年代以前停留在从 微生物，动物或植物中提取酶,加以利用阶段.由于当时生产力 落后,生产工艺较繁杂,难以进行大规模工业化生产。 2、酶的应用历史 被动、低效 的应用状态 1949年,用液体深层培养法进行细菌淀粉酶的发酵生产,揭开了近 代酶工业的序幕。随着生化工程的发展,大多数酶制剂的生产已转 向微生物流体深层发酵的方法。酶的应用越来越广泛。 50年代：开始了酶固定化研究。1953年德国科学家首先将聚氨基 苯乙烯树脂与淀粉酶,胃蛋白酶,羧肽酶和核糖核酸酶等结合,制成 了固定化酶。 60年代，是固定化酶技术迅速发展的时期。1969年,日本的千烟一 郎首次在工业上应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L-氨基 酸。出现了“酶工程”这个名词来代表有效利用酶的科学技术领 域。 酶工程 出现 1971年第一届国际酶工程学术会议在美国召开,当时的主题即 是固定化酶，进一步开展了对微生物细胞固定化的研究。 1973年,千烟一郎首次利用固定化的大肠杆菌细胞生产L-天冬 氨酸。 1978年,日本的铃木等固定化细胞生产 -淀粉酶研究成功. 80年代，固定化细胞已能用于生产胞外酶，同时还发展了固 定化原生质体技术。 在酶的固定化技术发展的同时,酶分子修饰技术也取得了进 展。 极端酶、抗体酶,人工酶、模拟酶等领域 以蛋白质工程、定点突变、合理设计和定向进化技术为代 表的新酶研发 酶的剂型、复配等应用技术研究 大宗酶种的生产工艺改造等 酶工程技术 的拓展 “绿色健康，“酶”力无限 洗涤剂、纺织、淀粉制糖、发酵、酒精、食 品（包括果蔬汁、啤酒酿造、谷物食品、蛋 白水解、和功能食品以及食用油脂）、饲 料、皮革、造纸和化工等工业领域 3、酶工程技术的应用现状 纺织工业 焙烤工业 石油工业 造纸工业 洗涤剂工业 乳制品工业 皮革工业 啤酒工业 淀粉糖工业 制药工业 精细化工工业 燃料酒精工业 工业酶制剂是工业生物技术 发展的基石，在环境、能 源、食品、农业、化工、医 药等领域中发挥着重要的作 用。酶制剂的服务销售市场 也已成为生物技术服务大产 业仅东莞一年用于牛仔布 洗涤剂用纤维素酶的需求就 达50001万吨，市值36亿 元 饲料工业 酒与饮料工业 Novozymes in China 诺维信在中国 Regional headquarters located in Beijing Zhongguancun Science Park consists of marketing, sales, and supply chain operation, with overall responsibility for China and Asia. A modern R&D centre, approved by the government as Post- Doctoral training base is also based here. 位于北京中关村科技园区的中国总部 ，建立了覆盖中国和亚洲的市场运营 网络及供应链系统，并拥有现代化的 研发中心，是国家批准的博士后培训 基地。 A modern biotechnology manufacturing site in Tianjin Economic Development Area, serving as a strategic site for the global market. 位于天津经济技术开发区的现代化生 物技术生产设施，为国际市场服务的 战略生产基地。 Suzhou Hongda Enzyme Co. Ltd. 苏州宏达制酶有限公司 A joint venture for crude enzymes manufacturing and a local model for environmentally friendly manufacturing 苏州太仓合资企业基础酶制剂生产厂；成为当地环保典范 Novozymes Shenyang Bioprocessing 诺维信 沈阳生物加工有限公司 A microorganisms production site in Shenyang with distribution network covering greater China. 位于沈阳开发区的微生物制剂公司覆盖整个大中华地区 国际市场几种大宗发酵产品产业发展预测 品种2003年2010年总产值（ 亿元） 2020年总产值 （亿元） 总产量（万吨）总产值（亿元） 抗生素5.8383.5500-6002000-2200 维生素9121.8400-5001400-1500 氨基酸170230300-500600-700 柠檬酸100803050 酶制剂4017.53050 总 计832.8 1260 - 1660 4100 - 4500 近年来出现快速增长的趋势！近年来出现快速增长的趋势！ 国际与国内市场酶制剂销售额比例国际与国内市场酶制剂销售额比例 国际国际国内国内 洗涤剂用酶 淀粉、酒精用酶 其它用途 淀粉酶类与淀粉糖业 青霉素酰化酶与抗生素改造 果汁生产与果胶酶 乳制品与凝乳酶 酶制剂在国外饲料工业 中得到不断应用，不仅 提高了饲料原料的转化 率，也促进了对饲料的 消化。 植酸酶 Bio-Feed Phytase ( Ronozyme P ) 主要用于提高植酸磷的消化率，并相应改善钙和其 它矿物元素的利用率。大大降低了动物粪便中磷的 排放量，有益环保。 生物抛光是一种用纤维素酶改善纤维素纤维制 品表面的整理工艺,以达到持久的抗起毛起球 并增加织物的光洁度和柔软度 超氧化物歧化酶SOD 溶菌酶 凝血酶 栓溶酶类与心血管疾病 以特殊的酶为靶点开发特异性治疗药物 Iressa 艾若萨 (ZD1839) 阿斯利康公司 苯胺喹啉化合物（anilinoquinazoline） 强效EGFR（表皮生长因子受体）酪氨酸激酶抑制剂。 对癌细胞的增殖、生长、存活的信号转导通路起阻断作用。 增加PPD、Taxel、Doxtaxel、ADM治疗NSCLC有效率920 不良反应：皮疹、恶心、呕吐、腹泻。 增生 X 凋亡 血管生成 转移 细胞膜 癌细胞 ZD1839 EGF TGFa X X X 细胞核 激酶 X ZD1839: 作用机制 三、酶工程技术发展中需要解决的关 键问题及思路 酶工程技术体系中存在的问题 自发、分散、Case-by-case 的 研究模式（周期平均20年）， 效率低、周期长 品种繁多的大量 的酶，催化体系 矛盾 ？ 传统模式工业化需要 传统研究方式与工业化需要的矛盾 问题分析 一些重要而急需的人工 转化体系还没有合适的 菌种和酶。(酶活太低） 构建快速高效 的生物催化剂 的改造方法 ？ 难点与周期太长 生物催化剂 改造的方法学 基础理论问题 新 来 源 基 因 与 酶 ! 可提高酶活 数倍数万倍 提高酶活530 ，十分困难 问题分析 微生物与酶不适应工业环境 产品浓度低，分离成本高 建立高效率的高浓度 生物催化反应体系 !？ 应用的成本问题 生物催化剂 适应性原理 生物系统催化 的理论和方法 系统生物催化的基础理论问题 必须从生物催化体系的全局进行研究 应用系统生物学原理 研究生物催化反应体系 生物催化剂 微生物-来源 分子设计-改造 环境 生物反 应系统 适应性 NoNoYesYes 高效生物高效生物 转化过程转化过程 介质工程 工业酶创新仿制的 “标杆酶反向生物信息学战略” 解析“ 标杆” 酶序列 同类酶计算机分 子模建及与标杆 酶的三维拟合 计算机还原 成三维构象 重组、检定 生物催化剂的酶工程技术研究生物催化剂的酶工程技术研究 课题课题1 1：生物催化剂分子生物催化剂分子 改造与优化技术研究改造与优化技术研究 课题课题2 2：酶蛋白的高效表达与酶蛋白的高效表达与 分离技术研究分离技术研究 课题课题3 3：酶制剂发酵过程酶制剂发酵过程 控制与后处理工艺控制与后处理工艺 主要针对工业酶制剂、 新型生物添加剂、重要医药中 间体等产业老产品竞争力差， 新品种缺乏等问题，通过自主 创新，研制新一代生物催化剂 ，支撑化工、纺织、食品医药 等产业可持续发展。 重点产品： v工业酶制剂：耐高温酸性 -淀粉酶、高温碱性甘露聚糖 酶 、耐热植酸酶等 v生物添加剂：生物防腐剂、 甜味剂、香料和色素等以及 糖基生物产品、医药中间体 产品、新型手性化合物等 课题课题4 4：酶工程产品及新酶工程产品及新 工艺技术研究工艺技术研究 生物催化剂的优化改造及应用 大宗工业酶制剂 新型工业酶制剂 绿色制造工艺 酶蛋白结构复杂、功能多样、应用广泛。采用酶分子定 向改造技术、基因高效表达技术、发酵工艺和后处理工 艺等关键技术，优化酶的性能，提高酶活力，开展生物 催化剂在造纸、纺织、洗涤剂、能源、皮革、制药等行 业中的应用研究，建立新的绿色制造工艺。 高温淀粉酶 脂肪酶 纤维素酶 -乙酰乳酸脱羧酶 乳糖酶 植酸酶 甘露聚糖酶 木聚糖酶 生物纺织 生物柴油 生物制革 手性产品 特定基因序列 结构与催化功能信息 定点突变 表达纯化 结构和活性表征 稳定性、适应性信息 所需要的生物催化剂 yes 循 环 分 子 设 计 因特网生物信息数据库 生 物 催 化 剂 理 性 分 子 设 计 示 意 图 特定基因 反转录酶/易错PCR技术 丰富的变种DNA文库 （生物质谱）高通量筛选技术 高效生物催化剂 循 环 正向突变基因 生 物 催 化 剂 快 速 定 向 进 化 示 意 图 n稳定性 n活性 n有机溶液中的活性 n不同的底物的利用 n酸碱度 n蛋白质的表达 n亲和性 n专一性 理性分子设计和定向进化的结合 高效人工进化酶的构效关系 辅 酶 底 物 定向进化与理性分子 设计的结合策略 蛋白质组学 组学 Discovery-driven 转录组学代谢组学通量组学 DNA芯片技术 二维电泳/质谱技术 多维色谱/质谱技术 同位素-核磁共振技术 计算生物学 基因组模型化技术 以酶为关键实现以酶为关键实现 学科交叉和技术集成学科交叉和技术集成 实验生物科学 Hypothesis-driven 分子遗传学 分子微生物学 蛋白质工程 结构生物学 代谢工程 重组DNA 技术 蛋白质结晶及 晶体衍射技术 酶的定向 进化技术 高通量 筛选技术 微生物生理学 反向代谢 工程技术 蛋白酶分子进化 和功能优化 第二章 酶的基本性质及相关基础理论 和概念 第一节 对酶化学本质的认识是一个不 断深入的过程 1. 不自觉的应用：酿酒、造酱、制饴、治病 2. 对酶的初步认识: 消化与发酵现象 19世纪30年代，德国科学家施旺获得胃蛋白酶。 1833年，法国化学家Payen和Person用酒精处理麦芽抽提液，得 到淀粉酶（diastase）。 1878年，德国科学家Khne提出enzyme从活生物体中分离得到 的酶，意思是“在酵母中”（希腊文）。 3、19世纪，对于发酵过程的本质开展了长期的学术争论，并导致了 随后一系列对于酶的分离及化学本质的研究 当时法国化学家和微生物学家Pasteur认为没有生物则没有发酵。 德国化学家Liebig认为发酵是由化学物质引起的。 此争议由德国学者Buchner兄弟于1896年解决。 Buchner兄弟的试验：用细砂研磨酵母细胞，压取汁液，汁液不含 活细胞，但仍能使糖发酵生成酒精和二氧化碳。证明：发酵与细 胞的活动无关。 4、酶是活细胞产生的，能在细胞内外起催化作用的生理活性物质。 那么酶的化学本质究竟是什么？ 1926年,美国康乃尔大学的Sumner博士从刀豆中提取出脲酶结晶， 并证明具有蛋白质的性质。 1930年，美国的生物化学家Northrop分离得到了胃蛋白酶（pepsin ）、胰蛋白酶（trypsin）、胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）结晶 ，确立了酶的化学本质。 随着X光晶体衍射，多维核磁共振（NMR ）技术的发展，很多酶的 空间结构被揭示。 1957年Sanger报道了胰岛素的氨基酸系列，这是第一次阐 明一个蛋白质的氨基酸全系列。 1963年第一个酶（核糖核酸酶）的氨基酸序列被报道。 1969年，Merrifield等人由氨基酸人工合成了具有催化活 性的酶Rnase,进一步证实了酶的蛋白质本质。 5、80年代初发现了具有催化功能的RNA核酶(ribozyme)，这一 发现打破了酶是蛋白质的传统观念，开辟了酶学研究的新领域。 1983年核酸酶的确认：切克(Thomas Cech)等人发现四膜虫（ Tetrahynena）细胞的26 S rRNA前体具有自我剪接功能（Self- splicing）。该RNA前体约有6400个核苷酸，含有一个内含子（ Intron）或称为间隔系列（Intervening sequence, IVS）和两 个外显子（Exon），在成熟过程中，通过自我催化作用，将间隔 系列切除，并使两个外显子连接成成熟的 RNA。这种剪接不需要 蛋白质存在，但必须有鸟苷或5GMP和镁离子参与。切克（ T.Cech）将之称为自我剪接反应。认为RNA 亦具有催化活性。并 将这种具有催化活性的RNA 称为ribozyme。 第二节 酶催化作用的一般特点 1、酶催化作用的专一性 2、酶催化作用的高效率 3、酶催化作用的条件温和 一种酶只能催化一种底物进行一种反应，这种高度的专一 性称为绝对专一性。 当酶作用的底物含有不对称碳原子时，酶只能作用于异构 体的一种。这种绝对专一性称为立体异构专一性。 一种酶能够催化一类结构相似的底物进行某种相同类型的 反应，这种专一性称为相对专一性。 键专一性的酶能够作用于具有相同化学键的一类底物。 基团专一性的酶要求底物含有某一相同的基团。 族专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底物。 RCOO- +R OH + H+ 酯酶：RCOR + H2O O O CH2OH OH OH OH 1 5 -葡萄糖 苷酶 OR +H2O O CH2OH OH OH OH OH 1 5 + ROH 绝对专一性：只能作用于某一底物。 脲酶：H2NCNH2 + H2O O 2NH3 + CO2 锁钥学说（Lock and Key theory） 诱导契合学说（ Induced fit hypothesis） 酶催化反应的效率之所以这麽高，是由于酶催化反应可以使反 应所需的活化能显著降低。 酶催化作用一般都在常温、常压、pH近乎中性的条件下进行。 在极端的条件下，会引起酶的变性而失去其催化功能。 极端酶的需求 第三节 酶的分类与命名 1、蛋白类酶的分类与命名 2、核酸类酶的分类与命名 习惯命名法 国际标准命名法 六大类酶:依据为反应类型 亚类:依据的作用基团 次亚类:依据为催化作用受体 1、蛋白类酶的命名和分类 1961年国际酶学委员会（Enzyme Committee, EC）根据酶 所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类 I、氧化还原酶类：主要是催化氢的转移或电子传递的氧化还原 反应。 AH2 + B（O2）A + BH2（H2O2，H2O） （1）脱氢酶类：催化直接从底物上脱氢的反应。 AH2 +BA +BH2（需辅酶或辅酶） (2) 氧化酶类 催化底物脱氢，氧化生成H2O2： AH2 + O2A + H2O2（需FAD或FMN） 2AH2 + O22A + 2H2O (3) 过氧化物酶 ROO + H2O2RO + H2O + O2 (4) 加氧酶（双加氧酶和单加氧酶） O2 + OH OH C=O C=O OH OH （顺，顺-已二烯二酸） RH + O2 + 还原型辅助因子ROH + H2O + 氧化型辅助因子 （又称羟化酶） II、转移酶类：催化化合物中某些基团的转移。 AX + BA +BX 根据X分成8个亚类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃 基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。 其系统命名是其系统命名是“供体：受体某基团转移酶供体：受体某基团转移酶” III、 水解酶类：催化加水分解作用。 AB + H2OAOH + BH 该大类酶的系统命名是先写底物名称，再写发生水解作用的化该大类酶的系统命名是先写底物名称，再写发生水解作用的化 学键位置，后面加上学键位置，后面加上“水解酶水解酶” IV、裂解酶类：催化非水解性地除去基团而形成双键的反应或逆 反应。 CH3 C=O COOH CC键 CH3 C=O H + CO2 CO键CH2COOH HOCHCOOH HCCOOH HOOCCH + H2O 一般裂合酶在裂解反应方向只有一个底物，而在缩合反应一般裂合酶在裂解反应方向只有一个底物，而在缩合反应 方向却有两个底物。催化底物裂解为产物后，产生一个双方向却有两个底物。催化底物裂解为产物后，产生一个双 键。键。 该大类酶的系统命名为该大类酶的系统命名为“底物裂解的基团裂合酶底物裂解的基团裂合酶 ” CN键 COOH CHNH2 CH2 COOH COOH CH HC COOH + NH3 V、异构酶：催化 各种异构体之间的互变。 AB 常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类。 异构酶按照异构化的类型不同，分为异构酶按照异构化的类型不同，分为 6 6 个亚类。命名时分别在底个亚类。命名时分别在底 物名称的后面加上异构酶（物名称的后面加上异构酶（isomeraseisomerase）、消旋酶（）、消旋酶（racemaseracemase）、）、 变位酶（变位酶（mutasemutase）、表异构酶（）、表异构酶（epimeraseepimerase）、顺反异构酶（）、顺反异构酶（cis-cis- trans-isomerasetrans-isomerase）等。）等。 VI、合成酶类：催化有ATP参加的合成反应。 A + B +ATPAB + ADP +Pi 乳酸脱氢酶 EC 1. 1. 1. 27 第1大类，氧化还原酶 第1亚类，氧化基团CHOH 第1亚亚类，H受体为NAD+ 该酶在亚亚类中的流水编号 连接酶是伴随着连接酶是伴随着ATPATP等核苷三磷酸的水解，催化两等核苷三磷酸的水解，催化两 个分子进行连接反应的酶。个分子进行连接反应的酶。 酶的命名有两种方法：系统名、惯用名。 系统名：包括所有底物的名称和反应类型。 乳酸 + NAD+丙酮酸 + NADH + H+ 乳酸：NAD+氧化还原 酶 惯用名：只取一个较重要的底物名称和反应类型。 乳酸：NAD+氧化还原 酶 乳酸脱氢 酶 对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。 2、核酸类酶的命名和分类 ribozyme具有自我剪接、自我剪切和催化分子间反应等多种 功能；作用底物有RNA、DNA、糖类、氨基酸酯等；研究表明 ，ribozyme具有完整的空间结构和活性中心，有其独特的催 化机制，具有很高的底物专一性，其反应动力学亦符合米氏 方程的规律。可见，ribozyme具有生物催化剂的所有特性。 是一类由RNA组成的酶 剪切酶 剪接酶 多功能酶 分子内催化 分子间催化 第四节 酶的基本结构及作用机制 1、酶的化学组成 酶 单纯酶 结合酶 （全酶）= 酶蛋白 + 辅因子 辅因子 辅酶 ：与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。 辅基：与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。 金属激活剂：金属离子作为辅助因子。 酶的催化专一性主要决定于膜蛋白部分，辅因子通常是作为 电子、原子或某些化学基团的载体。 2、单体酶、寡聚酶和多酶复合物 1.单体酶（monomeric enzyme)：仅有一条具有活性部位的多肽链 ，全部参与水解反应。 2.寡聚酶 (oligomeric enzyme)：由几个或多个亚基组成，亚基 牢固地联在一起，单个亚基没有催化活性。亚基之间以非共价键 结合。 3.多酶复合物 (multienzyme system)：几个酶镶嵌而成的复合 物。这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应。 丙酮酸脱氢酶系（E.coli）：丙酮酸脱氢酶（E）、硫辛 酰转乙酰酶（E）和二氢硫辛酰脱氢酶（E）。 EEE 碱性 EEE+ EE+ 脲 多酶复合物的例子 活性部位和必需基团 必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧 失。 活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接 有关的部位。 必需基团 活性部位 维持酶的空间结构 结合基团 催化基团 专一性 催化性质 3、酶的结构与功能的关系 （一）酶的催化作用与分子活化能 化学反应自由能方程式G =H -TS （G是总自由能的变化，H 是总热能的变化，S是熵的变化 ） 当G0，反应不能自发进行。 当G0，反应能自发进行。 活化能：分子由常态转变为活化状态所需的能量。是指在一定 温度下，1mol 反应物全部进入活化状态所需的自由能。 4、酶的作用机理简介 （过渡态） 促使化学反应进行的途径： 1. 用加热或光照给反应体系提供能量。 2. 使用催化剂降低反应活化能。 酶和一般催化剂的作用就是降低化学反应所需的活化能，从而 使活化分子数增多，反应速度加快。 （二）中间产物学说 E + SESE +P 中间产物存在的证据： 1.同位素32P标记底物法（磷酸化酶与葡萄糖结合）； 2.吸收光谱法（过氧化物酶与过氧化氢结合）。 中间产物学说中间产物学说 ESES P P S S E E Michaelis-Menten equation （三）诱导嵌合学说 “锁钥学说”（Fischer，1890）：酶的 活性中心结构与底物的结构互相吻合，紧 密结合成中间络合物。 诱导嵌合学说（Koshland，1958）：酶 活性中心的结构有一定的灵活性，当底 物（激活剂或抑制剂）与酶分子结合时 ，酶蛋白的构象发生了有利于与底物结 合的变化，使反应所需的催化基团和结 合基团正确地排列和定向，转入有效的 作用位置，这样才能使酶与底物完全吻 合，结合成中间产物。 1.邻近定向效应：酶与底物结合成中间产物过程中，底物分子从稀 溶液中密集到活性中心区，并使活性中心的催化基团与底物的反应 基团之间正确定向排列所产生的效应。 2.“张力”与“形变”：酶与底物的结合，不仅酶分子发生构象变 化，同样底物分子也会发生扭曲变形，使底物分子的某些键的键能 减弱，产生键扭曲，降低了反应活化能。 3. 酸碱催化：通过想反应物（作为碱）提供质子或从反应物（作 为酸）夺取质子来达到加速反应的一类催化。（广义酸碱催化， Bronsted的酸碱定义） 蛋白质中起酸或碱催化的功能基团有氨基、羧基、咪唑基、巯基 和酚基。影响酸碱催化反应速度的两种因素：（1）酸或碱的强度 （pK）；（2）质子传递的速度。His的咪唑基最活跃。 （四）使酶具有高催化效率的因素 酶分子为酶的催化提供各种功能基团和形成特定的活性中心，酶 与底物结合成中间产物，使分子间的催化反应转变为分子内的催 化反应。 靠近 定向 形 变 第五节 酶的活力测定方法及酶学分析 的类型 一、酶活性的概念 酶活性即酶促反应速度，指在规定条件下单位时间内底物的减少 量或产物的生成量。 底物浓度为S,产物浓度为P,时间为t，反应速度为v v =-dS/dt 或 v =dP/dt。 注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成 量为好。 二、酶活性单位 n定义：指在一定条件下使酶促反应达到某一速度时所需要的酶量。 酶活性单位是一个人为规定的标准。 惯用单位：酶活性测定方法的建立者所规定的单位。 国际单位 ：1IU指在规定条件（最适pH，最适底物浓度）下，每分 钟转化1mol底物的酶量。单位为IU/L 。 Katal单位：1Katal指在规定条件下，每秒钟转化1mol底物的酶量， 1Katal=60106IU。 三、酶活性单位的计算 n步骤： 运用公式进行计算。 明确测定方法的酶单位定义，按照酶单位定义确定物质量、 体积和时间的单位， 计算公式: 产物的增加量 每单位规定的保温时间 1000（ml） 酶单位/升 = 每单位规定的产物增加量 实际保温时间 实际标本用量（ml） 分光光度法测定的公式： （A测定 A对照）V总106 每单位规定的保温时间 酶单位/升 = LV标 实际保温时间 四、酶促反应进程 n 酶促反应进程曲线 n 酶量的测定： 通过酶活性测定间接测得酶的含量，因此，要准确测定酶量， 应使酶浓度（E）与酶促反应速度成正比，即E-dS /dt或EdP/dt。能够真正代表酶活性大小的是线性期的 酶促反应速度，即酶促反应初速度。 酶活性测定时首先要确定线性期，在此期测定反应速度才能准 确代表酶活性。 酶的含量 酶活性酶促反应初速度 五、酶活性的测定方法