2013金黄色葡萄球菌检测课件

第三节 食品中金黄色葡 萄球菌检测 一、金黄色葡萄球菌的生物学特性 1、形态与染色：(staphylococcus aureus) 金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数 无荚膜。 典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径 0.8 mm左右，显微镜下排列成葡萄串状。 革兰氏染色阳性。 2、培养特性： 金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养 基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度 37，最适生长pH 7.4。 平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，边缘整 齐、表面光滑、湿润，直径一般为12 mm。血 平板菌落周围形成透明的溶血环。 金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在7.5 15%NaCl肉汤中生长。 3、生化特性： 可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸 不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。 许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝 酸盐，液化明胶。 金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺 类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏 感。 葡萄球菌（Staphylococcus)是微球菌科的一个属 ，在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲料、 食品(剩饭、糕点、牛奶、肉品等)以及人和动物 的体表粘膜等处均有存在，大部分是不致病的腐 物寄生菌，也有一些致病的球菌。 葡萄球菌分为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、 腐生葡萄球菌。其中金黄色葡萄球菌(staphy aureus)为致病菌、表皮葡萄球菌偶尔致病（ staphy epidermidis)、腐生葡萄球菌（staphy saprophyticus)一般为非致病菌。 金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种。革兰氏阳 性球菌，呈葡萄串状排列，直径为0.51m，无 芽孢、无鞭毛、无荚膜。在普通肉汤培养基上， 形成圆形、凸起、边缘整齐、表面光滑的菌落， 菌落色素不稳定，但多数为金黄色。需氧或兼性 厌氧；最适生长温度为3037；最适生长pH为 67。耐盐性强，能在含715氯化钠的培养 基中生长。对氯化汞、新霉素、多粘菌素具有很 强的抗性，多数产肠毒素的菌株在血琼脂平板上 能形成溶血圈，并能产生血浆凝固酶，这些是鉴 定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。 金黄色葡萄球菌流行病学及致病性 金黄色葡萄球菌的致病性 金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可 引起局部化脓 感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等 ，甚至败血症、脓毒症等全身感染。 金黄色葡萄球菌的致病 力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶： a.溶血毒素：外毒素，分甲、乙、丙、丁、戊五种，能损伤 血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死； b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞； c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液 或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞 的吞噬作用。 葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关； d.脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶 能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌； e.肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋 白质性肠毒素，分为A、B、C、D、E及F六种血清型。 当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较 多的食品，如牛奶和乳制品、肉、蛋等，在温度条 件适宜时，经过810小时即可产生相当数量的肠毒 素，肠毒素可耐受100煮沸30分钟而不被破坏。人 摄食该菌污染的食物23小时后可引起中毒症状， 它引起的食物中毒症状是呕吐和腹泻。 此外，金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶 酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。 金黄色葡萄球菌的流行病学 金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在， 空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可 找到。作为人和动物的常见病原菌，其主要 存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上， 50%以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球 菌存在。因而，食品受其污染的机会很多。 金黄色葡萄球菌的流行病学 近年来，美国疾病控制中心报告，由 金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅 次于大肠杆菌。 金黄色葡萄球菌的流行病学特点 季节分布，多见于春夏季；中毒食品 种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此 外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起 的中毒事件也有报道。 上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%， 所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。 金黄色葡萄球菌的流行病学 一般说，金黄色葡萄球菌可通过以下 途径污染食品： 食品加工人员、炊事员或销售人员带 菌，造成食品污染；食品在加工前本身带 菌，或在加工过程中受到了污染，产生了 肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不 严，运输过程受到污染；奶牛患化脓性乳 腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位 的污染。 *金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生 问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起 的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%， 加拿大则更多，占45%，我国每年发生的此 类中毒事件也非常多。肠毒素形成条件： 存放温度，在37内，温度越高，产毒 时间越短； 存放地点，通风不良氧分压低易形成肠 毒素； 食物种类，含蛋白质丰富，水分多，同 时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。 分布 在自然界中广泛存在，空气、水、灰尘及人和动 物的排泄物中都可找到。 传播媒介为被该菌污染的食品，主要为淀粉类(如 剩饭、米面、粥等)、牛乳及乳制品，以及鱼、肉 、蛋类等。被污染的食物在室温20-22放置5 小时以上时，病菌大量繁殖，并产生肠毒素。 葡萄球菌皮肤感染 耐受力 几乎所有的消毒试剂以及热加工过程对金 黄色葡萄球菌都有严重的破坏作用 肠毒素可耐受100 30分钟不被破坏。 对于加工过的食品或食品加工设备而言， 此菌或其肠毒素的存在通常作为卫生条件 差的一种指标。 污染的控制 防止金黄色葡萄球菌污染食品 防止带菌人群对各种食物的污染：定期对 生产加工人员进行健康检查，患局部化脓 性感染（如疥疮、手指化脓等）、上呼吸 道感染（如鼻窦炎、化脓性肺炎、口腔疾 病等）的人员要暂时停止其工作或调换岗 位。 污染的控制 防止金黄色葡萄球菌污染食品 防止金黄色葡萄球菌对奶及其制品的污染 ：如牛奶厂要定期检查奶牛的乳房，不能 挤用患化脓性乳腺炎的牛奶；奶挤出后， 要迅速冷至-10以下，以防毒素生成、细 菌繁殖。奶制品要以消毒牛奶为原料，注 意低温保存。 污染的控制 防止金黄色葡萄球菌污染食品 对肉制品加工厂，患局部化脓感染的禽、 畜尸体应除去病变部位，经高温或其他适 当方式处理后进行加工生产。 污染的控制 防止金黄色葡萄球菌肠毒素的生成 应在低温和通风良好的条件下贮藏食物， 以防肠毒素形成； 在气温高的春夏季，食物置冷藏或通风阴 凉地方也不应超过6小时，并且食用前要彻 底加热。 金黄色葡萄球菌的检验 GB4789.10-2010 第一法 金黄色葡萄球菌定性检验 适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验 第二法 金黄色葡萄球菌 Baird-Parker平板计数 适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色 葡萄球菌的计数； 第三法 金黄色葡萄球菌MPN计数 适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高 的食品中金黄色葡萄球菌的计数。 第一法 金黄色葡萄球菌定性检验 金黄色葡萄球菌的检测程序金黄色葡萄球菌的检测程序 检样检样25g(mL) 25g(mL) 225mL225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液生理盐水或磷酸盐缓冲液 7.5%7.5%氯化钠肉汤或氯化钠肉汤或10%10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤氯化钠胰酪胨大豆肉汤 361361 Baird-ParkerBaird-Parker平板，血平板平板，血平板 涂片染色涂片染色观察溶血观察溶血 血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验 报告报告 血平板血平板1824h1824h， Baird-ParkerBaird-Parker平板平板1824h1824h 或或4548h4548h。 BHIBHI肉汤和营养琼脂小斜面肉汤和营养琼脂小斜面 3613611824h1824h 5、1、样品的处理 利用金黄色葡萄球菌耐盐的特性（可耐 受15%的氯化钠），用含10%氯化钠的胰 酪胨大豆肉汤增菌。 按无菌操作取检样25 g（mL），加入盛有 225 mL 7.5%氯化钠肉汤或10%胰酪胨大 豆肉汤无菌容器内，振荡混匀。 5、2、增菌及分离培养 5.2.1 将上述样品匀液于36 1 培养18 h24 h 。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生 长，污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈 混浊生长。 5.2.2 将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker 平板和血平板，血平板36 1 培养18 h24 h。 Baird-Parker 平板36 1 培养18 h24 h 或45 h 48 h。 5.2.3 金黄色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上，菌 落直径为2 mm3 mm，颜色呈灰色到黑色，边 缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明 圈。 用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶 然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及 透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的 菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能 粗糙并干燥。 在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、 湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完 全透明溶血圈。 挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶 试验。 5.3 鉴定 5.3.1 染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏 阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无 荚膜，直径约为0.5 m1 m。 5.3.2 血浆凝固酶试验：挑取、Baird- Parker 平板或血平板上可疑菌落1 个或以 上，分别接种到5 mL BHI和营养琼脂小斜 面，36 1 培养18 h24 h。 5.3 鉴定 取新鲜配置兔血浆0.5 mL，放入小试管中，再 加入BHI 培养物0.2 mL0.3 mL，振荡摇匀，置 361 温箱或水浴箱内，每半小时观察一次， 观察6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时， 呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判 定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴 性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用 商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶 试验。 结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5 mL BHI，36 1 培养18 h48 h，重复试验。 5.4 葡萄球菌肠毒素的检验 可疑食物中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素 的金黄色葡萄球菌菌株的鉴定，应按附录B 检测葡萄球菌肠毒素。 6 结果与报告 6.1 结果判定：符合5.2.3、5.3，可判定为 金黄色葡萄球菌。 6.2 结果报告：在25 g（mL）样品中检出 或未检出金黄色葡萄球菌。 血平板上金黄色葡萄球菌菌落形态 金黄色葡萄球球菌的单个菌落在血平 板上形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿 润、金黄色（有时为白色），菌落周围可 见完全透明溶血圈。 完全溶血和不完全溶血 溶血溶血 溶血溶血 第二法 金黄色葡萄球菌 Baird- Parker平板计数 BP平板： 胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏提供碳源、氮 源、硫、维生素和痕量矿物元素 丙酮酸钠是一种生长促进剂 亚碲酸盐对除金黄色葡萄球外的其他能分 解卵黄的菌株有毒性，并使菌落产生黑色 卵黄提供营养和有利于观察卵磷脂环 甘氨酸和氯化锂对金黄色葡萄球菌以外的 其它菌株有抑制作用。 金黄色葡萄球菌在BP平板上的菌落形态 在Baird-Parker琼脂平板上菌落呈圆形，表面光滑 、凸起、湿 润，直径23 mm。灰黑色至黑色，有光泽 ，常有浅色（非白色）的边缘，周围绕以不透明圈 （沉 淀），其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有 黄油样粘稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株，除没有 不透明圈和清晰带外，其他外观基本相同。从长期贮存 的冷冻或脱 水食品中分离的菌落，其黑色常较典型菌落 浅些，且外观可能较粗糙，质地较干燥。 B-P平板 金黄色葡萄球菌的检验 3.鉴定 染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性 球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜 ，直径约为0.5 m1 m。 金黄色葡萄球菌可以产生凝固酶，因此对 其鉴别的主要实验是测定其凝固酶。 对于凝固不完全的菌株，可以通过一些其 他实验来进一步确认，例如：厌氧葡萄糖 发酵、溶葡萄球菌酶敏感性实验、耐热核 酸酶实验等。 血浆凝固酶试验： 吸取1:4新鲜兔血浆0.5 mL，放入小试 管中，再加入培养24 h的金黄色葡萄球菌 肉浸液肉汤培养物0.5 mL，振荡摇匀， 置 361温箱或水浴内，每半小时观察一 次，观察6 h，如呈现凝固,即将试管倒置 或 倾斜时，呈现凝块者，被认为阳性结果 。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉 汤作为对照。 4、金黄色葡萄球菌肠毒素的检测 一、动物学试验 主要用幼猫和猴。 二、血清学试验 肠毒素作为抗原，可以 和特异性抗体发生结合性反应，产生可见 沉淀。 用血清学反应检验金黄色葡萄球菌肠 毒素，方法主要有： 1.免疫琼脂扩散法 2.反向间接血凝试验 3.免疫荧光法 4.酶