高效液相色谱法在中药化学指纹图谱研究中的应用（6）课件

高效液相色谱法在中药化学指纹 图谱研究中的应用 蒲晓辉 河南大学药学院 010年11月3日 1.1中药指纹图谱的定义 中药指纹图谱 中药化学(成分)指纹图谱 中药生物指纹图谱 中药生物 指纹图谱 中药材DNA指 纹图谱 中药基因组学 指纹图谱 中药蛋白组学 指纹图谱 生物活性指纹图谱 光谱指纹图谱 色谱指纹图谱 联用技术指纹图谱 中药化学(成 分)指纹图谱 1.2指纹化学图谱的起源与发展 中药化学指纹图谱借用DNA指 纹图谱发展而来中药指纹图谱，即 中药身份证，实际上是一种保证中 药质量的措施，是指对某种中药材 或中成药等运用现代分离分析科学 的手段，得到能够标示该中药的色 谱或光谱的图谱，最终用来对中药 质量评价的科学性方式。 光谱指纹图谱 联用技术指纹图谱 红外光谱 质谱 紫外可见光谱 核磁共振法 X射线衍射法 GC/MS HPLC/MS HPLC/MS/MS 色谱指纹图谱 TCL GC HPLC 高速逆流色谱法 (HSCCC) 高效毛细管电泳 法 (HPCE) 高效液相色谱不受样品挥发度和热 稳定性的限制，样品中大多数成分均可 在高效液相色谱仪上进行分析检测，是 构建指纹图谱的主要方法之一。由于中 药成分的复杂性，构建指纹图谱一般采 用梯度洗脱，因为逐步提高流动相洗脱 能力可获得较多色谱峰，提供更多指纹 信息。 中药化学指纹图谱 中药材(原料药材)指 纹图谱 中药原料药(包括饮片 、配伍颗粒)指纹图谱 中间产物指纹图谱 中药制剂指纹图谱 1.3指纹化学图谱研究的直接目的 （1） 对中药质量控制的补充和 提高。 （2） 控制中间体、成品的一致 性，减少批间差异。 1.3.1对中药质量控制的补充和 提高 现有中国药典质量控制方法及新 药申报资料，往往以1个或1个以上成分为 控制指标，在一定程度上反映了原药材、 中间体及成品的质量，但任何单一的成分 都难以准确、全面地评价中药质量，不仅 不能进行真伪鉴别和优劣判别，在很多情 况下，所检测的指标成分还不具有“惟一 性”，另外使用器材比较简单，操作比较 粗糙，有时重现性差。 中药注射剂指纹图谱研究 的技术要求要求将指纹图谱检 测指标限定作为质量标准单列项 目，这种做法是对现行中药质量 控制标准的有益补充。 一个理想的指纹图谱不仅能 达到定性鉴别的目的，色谱图中大 部分色谱峰应达到基线分离，对大 部分成分应可进行定量分析。在没 有对照品的情况下，也可以用已知 标准品针对其他未知或无标准品的 色谱峰进行定量。因此，可以说中 药指纹图谱是对现行中药质量标准 控制方法的提高。 1.3.2控制中间体、成品的一致性， 减少批间差异 中药生产的原材料，因土壤、气候 等环境因素及采收加工的不同，实际使 用时不能保证药材质量的稳定，经加工 提取得到的中间体，每个批次在成分含 量、成分组成及各成分比例方面都不能 保持一致。 中药化学指纹图谱中，有相当部分为次生 代谢产物，而这些产物的组成和含量不仅和药 材本身的种属有关，同时还与植物后天所处的 地域环境、生长条件、采摘时间和炮制方法有 很大的关系。对于中成药来说，与产品的加工 过程也有很大的联系。不同的加工过程与方法 都将对所得的指纹图谱有相当影响，表现在峰 高、峰面积、保留时间以及峰数量上的变化等 。因此，中药化学指纹图谱不仅可以用来对生 药的真伪、优劣进行鉴定，同时还可以对中药 的加工过程进行监测，可以有效地分析鉴定经 过不同的炮制、加工的中成药。 虽然无论是原药材、中间体还是成 品，都因组方已固定、生产工艺相对恒 定，而使药品的安全性不可能直接通过 指纹图谱来保障，但因为中药指纹图谱 可直接解决中间体、成品的批间一致性 及稳定性问题，从而可以间接并最终保 障成品的安全性和有效性。 样品收集 供试品的制备 参照物的选择与制备 色谱条件的优化 样品测试及方法学考察 指纹图谱的建立 指纹图谱的分析与评价 1.41.4中药中药HPLCHPLC指纹图谱构建程序指纹图谱构建程序 用于鉴别中药材的真伪、易混淆品种； 用于评价中药材、饮片质量控制； 用于中药提取物或制剂中间体的质量控制； 用于中成药的质量监控； 用于研究中药的稳定性。 1.5中药化学指纹图谱的实际应用 示例一： HPLC指纹图谱法鉴别远志及其伪品 李云峰，房敏峰，张文娟，等. 西北大学学报(自然科学版),2008, 38(2):265. 1.5.1中药材的真伪、易混淆品种的鉴别 1-1色谱条件： 色谱柱：Hypersil C18柱(4.6mm 250mm，5m)；流动相：乙腈-0.5%磷酸 (25:75)；流速 ：1.0mL/min；检测波长： 310nm；柱温：40；进样量：20L。指 纹图谱记录时间1 h。 1-2供试液的制备 精密称取远志、卵叶远志、白薇、 麦冬须根药材各10g，分别置100mL锥形 瓶中，加50%甲醇25mL，超声30min， 过滤，滤液用50%甲醇定容至25mL，备 用。 2方法学考察 2-1精密度试验 取陕西合阳远志药材的供试品溶液， 连续进样5次，每次20L，检测色谱峰， 测定各峰的相对保留时间和相对峰面积， 结果各峰相对保留时间和相对峰面积的 RSD均小于2.1%，符合指纹图谱技术要求 ，说明测定方法精密度高。 2-2稳定性试验 取陕西合阳远志药材的供试品溶液 ，分别在0，3，5，8，12，24 h进样,每 次20L，检测色谱峰，各峰相对保留时 间的RSD为0.8%1.2%，相对峰面积的 RSD为1.0%2.6%。结果表明：供试品 溶液常温下在024h之间可保持稳定。 2-3重复性试验 取陕西合阳远志样品5份，按1.2供试品 溶液的制备方法，在1.1色谱条件下检测色 谱峰，结果其相对保留时间和相对峰面积 稳定，各峰相对保留时间和相对峰面积的 RSD小于2.8%，符合指纹图谱技术要求， 说明本方法重复性良好。 2-4指纹图谱的建立及分析结果 存在16个共有指纹峰 。 存在15个共有指纹峰 。 白薇和麦冬须根的高效液相色谱图 示例一： 不同采收期连翘的HPLC 指纹图 谱研究 郑晓珂，魏悦，冯卫生. 中国实验方剂学杂志 ,2007,13(3):1. 1.5.2中药材、饮片的质量控制 1-1色谱条件 色谱柱：Shim-pack CLC-ODS(150 4.6mm)；检测波长：235nm；柱温：25 ；流速：0.8mL/min; 流动相: 乙腈(A)/ 水 (B) 梯度洗脱。线性梯度程序: 010 min, 10%17% (A)；1030min，17%35% (A) ；30.01min，50%(A)；45min，80% (A)； 50min，STOP。 1-2供试品溶液的制备 精密称取过40目筛的连翘粉末1g， 精密加入甲醇50mL，称定重量，超声提 取30min，取出静置，放置室温，加甲醇 补足损失的重量，取续滤液，备用。用 时用0.45m 的微孔滤膜过滤。 1-3精密度实验 取同一连翘供试品溶液，连续进样5 次，记录色谱图。考察色谱峰相似度的 一致性。 1-4重复性实验 取同一连翘样品5 份，按供试品制 备方法进行制备，分别进样，记录色谱 图。考察色谱峰相似度的一致性。 1-5稳定性实验 取同一连翘供试品溶液，分别在0， 1，4，8，12，48h进样，记录色谱图。 考察色谱峰相似度的一致性。各色谱峰 相对保留时间的RSD0.5%，各色谱峰相 对峰面积的RSD2%。表明供试品溶液 在48 h 内稳定。 2实验结果 2-1连翘HPLC 指纹图谱的建立 分别精密吸取对照品溶液和各供试 品溶液以及甲醇液( 空白对照) 10L，按 1-1项下的色谱条件操作，记录60min 色 谱图。 22个样品存在有25个共有峰。 2-2共有模式的建立和相似度分析 示例二： 不同黄连炮制品HPLC指纹图谱 研究 廖庆文，樊冬丽，肖小河，等. 中国中药杂志,2007,32(3):210. 1-1供试品溶液的制备 取各黄连炮制品粉末(过60目筛)约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加盐酸 -甲醇(1:100)40mL，摇匀，称定质量，超 声处理60min, 取出，放冷，用盐酸-甲醇 (1:100)补足质量，摇匀，滤过，滤液转 移至50mL量瓶中，加盐酸-甲醇(1:100)稀 释至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.45m)滤 过, 取续滤液得各供试液。 1-2色谱条件及系统适用性试验 Cromasil C18色谱柱(4.6mm250mm， 5m)；流动相乙腈50mmolL-1磷酸二氢钾 溶液(磷酸调pH 3.0) (50:50)，内含SDS 12.5mmolL-1；检测波长345nm；流速 1mLmin-1；柱温为室温；进样量10L； 盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱与 其他峰的分离度均大于1.5。 2方法与结果 2-1稳定性试验 取酒制黄连供试液，分别于0，2， 4，6，8，12，24，36，48h进样10L ，记录指纹图谱。 2-2精密度试验 取酒制黄连供试液，重复进样6次 ，记录指纹图谱。 2-3重复性试验 取酒制黄连药材粉末6份，精密称定 ，按1-1项下方法制备供试液，分别进样 ，记录指纹图谱。结果表明，各主要色 谱峰相对保留时间和相对峰面积比值无 明显变化，RSD分别为0.02%1.02%和 1.24% 1.93%，符合指纹图谱要求。 2-4指纹图谱的建立 图2 黄连不同炮制样品聚类谱系图 2-5相似度计算与系统聚类分析 示例一： 穿心莲提取物的HPLC指纹图谱研究 蒋珍藕，饶伟源，陈秋虹，等. 中成药, 2008,30(2):243. 1.5.3中药提取物或制剂中间体的质量 评价 1-1色谱条件和系统适用性试验 Waters C18色谱柱；以乙腈为流动 相(A)和0.1%磷酸溶液为流动相(B)进行 梯度洗脱，流速：1.0mL/min；检测波 长为254nm；柱温：25。记录60min 色谱图，35min以后没有出峰，说明 35min内穿心莲提取物成分出峰完全。 1-2供试品溶液的制备 精密称取穿心莲提取物0.5g，置 25mL量瓶中，加入40%甲醇20mL，浸 泡1h，超声处理（功率160W，频率 40kHz）20min，放冷，加40%甲醇至刻 度，摇匀，用微孔滤膜（0.45m）滤过 ，即得。 2方法与结果 2-1稳定性试验 取同一供试品溶液(9#)分别于0，5，9，11 ，20，22h进样测定。 2-2精密度试验 取同一供试品溶液(9#) 连续6次进样测定。 2-3重复性试验 取同一样品(9#) 6份，分别制备成供试品溶 液进样测定。 示例二 ： 芍药总苷高效液相色谱指纹图谱研究 邹忠梅，徐丽珍，杨世林. 药学学报, 2003,38(1):46. 1-1色谱条件 色谱柱：C18分析柱（5m，150mm 46mm）；流动相：流动相A为乙腈，流 动相B为水（磷酸调pH为3.0），梯度洗 脱；流速：1mL/min-1；色谱峰光谱采集 范围：190400nm；检测波长：230nm； 柱温：25；进样量：10L。 1-2供试品溶液的制备 精密称取芍药总苷约0.15g，溶于 甲醇，过滤，滤液置于10mL量瓶中， 加甲醇至刻度，过0.45m膜，备用；精 密称取白芍粉末约2g，加50%乙醇 40mL加热回流2h，滤过，合并滤液， 减压回收乙醇，水浴蒸干后溶于甲醇中 ，滤过，定容至10mL，过0.45m膜， 备用。 2方法与结果 2-1精密度与重现性 取批号为991112的样品，按供试品溶 液制备方法制备供试品，连续进样5次， 检测指纹图谱。 取批号为991109的样品5份，按供试 品溶液制备方法制备供试品，检测指纹图 。 2-2样品稳定性考察 取批号为991112芍药总苷样品，按供试 品溶液制备方法制备供试品，分别在0，2， 4，8和24h 检测指纹图谱。结果表明，各色 谱峰的相对保留时间和主要峰的峰面积比值 基本没有明显变化。 2-3主要色谱峰的鉴定 在同样色谱条件下，测定芍药内酯苷和 芍药苷对照品，并与样品指纹图谱中相应色 谱峰的保留时间及紫外光谱进行比较，发现 样品指纹图谱中5和6号特征峰分别为芍药内 酯苷和芍药苷。 示例一： 黄芪皂苷注射液指纹图谱的研究 管佳，毕志明，李萍. 中国中药杂志,2006,31(10):807. 1.5.4中成药的质量监控 1-1色谱条件 C18色谱柱，柱温25，流动相为A 水-B乙腈，二元梯度洗脱，洗脱时间 65min，流速0.8mLmin-1，蒸发光散射 检测器(Alltech 2000)：漂移管温度105 ，载气流速2.7 Lmin-1。 1-2供试品的制备 药材样品处理：精取药材粉末约 1.5g，置索氏提取器中，加甲醇适量， 回流5h，放冷，滤过，滤液回收甲醇至 干，残渣加水10mL使溶解，用20mL水 饱和的正丁醇提取4次，合并正丁醇提 取液，用20mL氨试液洗涤2次，弃取氨 液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解并 转移至5mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度 ，摇匀，0.45m的微孔滤膜滤过，取续 滤液，即得。 中间体：取总皂苷提取物约20mg， 精密称定，置5mL量瓶中，加甲醇溶解 并稀释至刻度，摇匀。用0.45m的微孔 滤膜滤过,取续滤液，即得。 注射液：精密吸取注射剂100mL， 水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至 5mL量瓶中，摇匀，用0.45m的微孔滤 膜滤过，取续滤液即得。 稳定性试验 取同一供试品溶液（药材、中间体、注射 液），分别在72h内不同时间段进样。 精密度试验 取同一供试品溶液（药材、中间体、注射 液），连续进样5次。 重复性试验 取同一批号的供试品5份（药材、中间体 、注射液），按供试品的制备和检测方法制 备供试品和进行检测。 示例一： 指纹图谱评价复方丹参片的稳定性 勾晓洲，付春梅，刘三康，等. 华西药学杂志, 2009,24(4):377. 1.5.5中药稳定性的研究 1-1色谱条件 采用C18色谱柱；流动相为0.01%磷酸 溶液(A)-乙腈( B)，梯度洗脱：70min， 0min、5%B，15min、30%B，36min、 30%B，45 min、75%B，60min、85%B， 70min、95%B；流速0.8ml/min-1；柱温 35；检测波长280nm；进样量10L。 1-2供试品溶液的制备 取20片复方丹参片，研细，精取0.5g ，加适量70%甲醇溶液超声处理30min，放 冷，加70%甲醇溶液定容25ml，0.45m微 孔滤膜过滤，即得供试品溶液。 2方法与结果 2-1线性范围 通过试验，以峰面积对浓度进行直线 回归，回归方程为：Y=9.052103X + 1.236105( r=0.9994)，丹酚酸B0.099 0.728mg/ml-1与峰面积的线性关系良好。 2-2精密度试验 同一天内重复测定同一样品溶液6次 ，丹酚酸B峰面积的RSD=0.9%。 2-3重复性试验 取同一批样品，平行测定6份，丹酚 酸B含量的RSD=0.7%。 2-4溶液的稳定性 样品溶液在配制后10h内测定，含量 基本一致，RSD=0.9%；对照品溶液在冰 箱中贮存3d，浓度基本不变。 2-5复方丹参片的含量测定及加速稳定性 试验 取3批复方丹参片，测定制剂中丹酚 酸B的含量，结果表明丹酚酸B的含量基 本均匀。 取3批复方丹参片，置402、 RH75%5%的条件下，分别于第0、1、 2、 3、6个月末取样，测定。 2-6指纹图谱的方法学考察 取同一供试品溶液重复进样6次，各 共有峰tR的RSD0.3%，峰面积比值的 RSD2.5%。取同一批样品，平行测定6 份，各共有峰tR的RSD0.2%，相对峰面 积的RSD3.0%。在同日的10h内，测定 同一供试品溶液，各共有峰的tR相的 RSD0.3%，峰面积比值RSD2.5%，表 明样品溶液10h内稳定。 2-7加速稳定性试验结果 表1 三批样品加速试验后各共有峰对应成 分的相对含量变化值(n=3) 示例二： HPLC指纹图谱对红花大输液制备 过程中的热稳定性的考察 任爱农,高燃朱,玲英,等. 中成药,2009,31(2):165. 1-1色谱条件 色谱柱：C18(250mm4.6mm，5m)； 流动相：甲醇-