血栓性疾病及其检验课件

血栓性疾病及其检验 华西检验系 彭黎明 一、概述 二、血栓性疾病的分子标志物 及检测 三、PTS的实验诊断指标 四、血栓形成的特异检测 五、易栓症的实验诊断 六、小结 一、概述 (一) 血栓前状态和血栓性疾病的种类 血栓前状态(prethrombotic state, PTS) 易栓症(thrombophilia) 深静脉血栓形成(deep vein thrombosis, DVT) 心肌梗死(myocardial infarction) 脑梗死(cerebrol infarction) DIC (二) 基本概念 1、高凝状态(hypercoagulable state, HCS) 原发性高凝状态(primary hypercoagulable state) 继发性高凝状态(secondary hypercoagulable state) HCS 2、血栓前状态(prethrombotic state, PTS) 定义 血管内皮细胞受损伤或受刺激 血小板和白细胞被激活或功能亢进 凝血因子含量增高或被激活 抗凝蛋白含量减少或结构异常 纤溶成分含量减低或活性减弱 血液粘度增高和血流减慢 (三） 易发血栓性疾病的因素 1 遗传性或先天性因素 缺乏凝血抑制物的活性 AT 、PC 、PS 、HC-II 缺乏纤溶活性 PLG 、PA、PAI FIG（N） 血液病和代谢病 Sickle cell anemia (HbS) HCY 2. 获得性或继发性因素 血液病 Erythrocytosis,thrombocytosis, PNH,TTP,DIC, LA (lupus-type anticoagulants) 医源性因素 Heparin, Warfarin 非血液病因素 肿瘤:肺/胃/胰腺/前列腺/卵巢癌 血管病：心/脑/周围血管病 肾脏病:肾病综合征,狼疮性/糖尿 病肾炎 产科病：子痫，羊水栓塞， 宫内死胎 心脏病：人工瓣膜，心衰， 心肌病 代谢病：糖尿病，高脂血症 呼吸疾病：RDS（呼吸窘迫综合征）， 慢性阻塞性肺病 感染：内毒素，病毒，立克次氏体 促凝物入血：创伤，手术，癌细胞 其它：老年，肥胖,妊娠,口服避孕药 二、血栓性疾病的分子标志物及检测 (一)血栓性疾病的分子标志物 1. 血管内皮细胞的分子标志物(7) von Willebrand factor (vWF) 棒管状小体(Weibel-Palade body) 6-酮-前列腺素F1 (6-keto-prostaglandin F1,6-keto-PG F1) demethyl-6-keto-prostaglandin F1 (DM-6-keto-PG F1) endothelin-1 (ET-1) P-selectin Thrombomodulin (TM) 2. PLT的分子标志物( 7) Platelet micro-particles (PMP) -thromboglobulin (-TG) Platelet factor-4 (PF-4) P-selectin(granular membrane protein -140, GMP-140) thrombospodin (TSP) dedimethyl-thromboxane B2 (DM-TXB2) dehydro-thromboxane B2 (DH-TXB2) 3. 凝血系统的分子标志物( 9) prothrombin fragment 1+2 (F1+2) frbrin peptide A 1-16 (FPA 1-16) frbrin peptide B 1-14 (FPB 1-14) factor IX-35/IX-9 peptide (FIX- -35/IX-9) factor X-52/X-15 peptide (FX- 52/X-15) intrinsic thrombin protein C peptide (PCP) tissue factor (TF) soluble fibrin monomer complex (SFMC) 4. 抗凝系统的分子标志物( 6) protein C (PC) protein S (PS) activated protein C resistance (APCR) thrombin-antithrombin complex (TAT) tissue factor pathway inhibitor (TFPI) lupus-type anticoagulants (LA) 5. 纤溶系统的分子标志物( 9) fibrin peptide 1-42 fibrin peptide 15-42 D-dimer plasmin-antiplasmin (PAP) fribrin(ogen) degredation product A (FDP-A) fribrin(ogen) degredation product E (FDP-E) tissue plasminogen activator (t-PA) urokinase plasminogen activator (u-PA) plasminnogen activator inhibitor (PAI) 6. WBC的分子标志物( 2) leukotriene B4 (LTB4) intercellular adhesion molecular (ICAM) (二)血栓性疾病分子标志物 的检测 1反映血管内皮细胞受损的指标 (1)血浆血管性血友病因子抗原 (vWF:Ag) 方法火箭电泳法 原理 参考值 94.1%32.5% 方法ELISA 原理 参考值 108%30% 临床意义：减少血管性血友病(vWD) 增加PTS及血栓性疾病 (2) 棒管状小体(Weibel-Palade body) 方法荧光抗体标记法 原理 FITC-anti-vW + EC (W-P body) FITC-anti-vW-Vw FM 参考值：(一) 临床意义：(+)内皮细胞受损或受刺激 (3)6酮前列腺素F1(6-keto-PGF1) 方法：ELISA竞争抑制法 原理 参考值：17.97.2pg/ml 临床意义：同DM-6-keto-PGF1 (4)去甲基6酮PGF1(DM-6-Keto-PGF1) 方法：ELISA 原理 AAb(包被)+Ab(anti-DM-6-keto-PGF1)+Ag AAbAbAg E-Anti-Ag AAb-Ab-Ag-Ab-E S 显色反应 参考值：尿15011pg/mg肌酐 临床意义：升高反映血管内皮细胞损伤， 见于PTS或血栓性疾病 (5)血栓调节蛋白活性(TM:A) 方法：发色底物法 原理 Thrombin(a) TMPC TMa (活性)APC S-PNAPNA+S 405nm比色 参考值：100%13% (6)血栓调节蛋白抗原(TM:Ag) 方法：免疫放射分析法 (immunoradiometric assay, IRMA) 原理 anti-TM(包被)+TM(标本) TM-anti-TM 121I-Anti-TM 121I-anti-TM-TM-anti-TM 121I放射性强度测定 参考值：2035ng/ml(g/L) 临床意义：增加血管内皮细胞受损，见于 PTS和血栓性疾病 (7)内皮素1(endothelin-1, ET-1) 方法：ELISA 原理：与DM-6-keto-PGF1相似 参考值：2) 标准化APC(nomalized APC-SR,n-APC-SR) 患者标本的APC-SR值 正常参比血浆的APC-SR值 参考值：10.60.19(0.84) FV Leiden杂合子0.450.7，纯合子4g/L 4体外血栓形成试验：27mg 5血液流变学：血液粘度增高 (二)特异性实验诊断指标 表 诊断PTS的一级、二级综合性特异性指 标 一级指标二级指标 反应血管内皮细胞受损 vWF：Ag() TM()、ET-1() 反映PLT激活 -TG() P-selectin(),DH-TXB2() 反映凝血酶生成增多 FPA()F1+2() TAT()PCP() 反映生理性抗凝物减弱 AT-III()PC()、APC-R(+) 反映纤溶系统活性 t-PA()B142()B1542() PAI()PAP() tPA/PAI(参考值0.360.09) FDP(),D-dimer() 四、血栓形成的特异检测 （一）血栓前体蛋白（thrombus precursor protein，TpP）测定 纤维蛋白原（Fg）经凝血酶作用，丢 失FPA和FPB，剩余的纤维蛋白单体可以 相互聚合，形成多聚物，统称为TpP。 【原理】双抗体夹心法。以鼠抗可溶性纤维蛋白 多聚体单抗包被板孔。样品中的可溶性纤维蛋白 单体多聚体（抗原）与包被抗体结合，再以生物 素标记的第二抗体（检测抗体）识别已结合的可 溶性纤维蛋白单体。然后加入亲和素连接的辣根 过氧化酶，利用生物素和亲和素特异性结合的特 性，即可形成双抗体夹心酶联免疫复合物。加入 TMB底物后，辣根过氧化物与之反应。以硫酸终 止反应。样品中TpP的浓度与显色深度呈正比， 读出吸光度A值，求得可溶性纤维蛋白单体多聚 体的含量。 【参考值】可溶性纤维蛋白单体多聚体 6g/ml。 【临床意义】TpP值升高，见于血栓前状 态和血栓性疾病，如急性心肌梗死（ AMI）、脑卒中、DIC 、深静脉血栓形 成（DVT）、肺梗死（PE）、糖尿病等 。 据一组115例有胸痛症状的患者，TpP 值升高。结果：胸痛发作6小时内的早 期AMT占88%，发作6小时后的晚期 AMI占25%，不稳性心绞痛患者占63% ，心绞痛者50%，房颤者占60%，心衰 者占67%，非心脏病胸痛者占50%。因 此，据称TpP是一种敏感而特异的指标 。见图8。 （二）同型半胱氨酸（hemocysteine，Hcy）测定 Hcy是甲硫氨酸代谢过程中的一种重要中间 产物，它涉及亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR ）、胱氨醚合成酶（CBS）和甲硫氨酸合成酶 （MS）等多种代谢调节酶以及多种辅因子，如 叶酸、维生素B6、B12等。见图9。Hcy与动脉粥 样硬化和血栓病关系密切。 1高效液相色谱法（HPLC） 【原理】荧光法（HPLC-FD）或电化学法 （ HPLC-ED）。 【参考值】Hcy为515mol/L。 2酶标法（ELISA） 【原理】血中氧化型Hcy经二硫苏糖醇（DTT ）还原为还原型Hcy，后者经5-腺苷同性半胱氨 酸（SAH）水化酶水解为SAH。包被微孔板上的 SAH竞争性与鼠抗SAH单抗结合，加入辣根过氧 化酶标记的兔抗鼠抗体。用TMB显色，硫酸终止 反应。在450nm处读A值，吸光度与样品中的总 同型半胱氨酸（tHcy）含量呈正比。 【参考值】tHcy为9.673.00mol/L。 【临床意义】tHcy增高：轻度为1524mol/L，中度 为25100mol/L，重度为100mol/L，血tHcy 40mol/L为同性半胱氨酸尿症。 1早发育同性半胱氨酸血症 见于5岁以下儿童。因脑 卒中和心肌梗死死亡者，其血tHcy水平异常增高（ 100450mol/L），尸解见动脉粥样硬化。 2缺血性心脑血管病变 研究表明，同性半胱氨酸与 血脂同样是动脉粥样硬化和缺血性心脑血管病变发病 的危险因素。 3外周血管病变 外周动脉因动脉粥样硬化变得狭窄 。有人发现，43%的男性与34%的女性Hcy升高伴主 动脉狭窄超过25%。 4其它病变 妊娠并发症、流产、妊高症、2型糖尿病 和阿兹海默综合征等患者，其血tHcy水平升高。 五、易栓症的实验诊断 （一）定义：易栓症（thrombophilia)是指存在 基因缺陷的凝血因子、抗凝因子、纤溶 系统或代谢障碍性疾病。 （二）易栓症的可能原因（表） （三）易栓症的实验诊断（表） 表. 易栓症的可能原因（表） 遗传性 AT缺陷、PC/S缺陷、APCR（FV Leiden) 获得性/遗传性 HCY血症、因子VIII/II水平